本研究旨在利用基于阻抗的实时细胞分析仪与基于高内涵筛选（HCS）的平台相结合的方法，评估15种香烟烟雾成分的生物学影响 体外本研究提供了有关受试化合物的有效剂量、毒性和作用机制的信息。
本文内容
摘要
摘要
香烟烟雾（CS）是心血管疾病和肺部疾病的主要风险因素。由于香烟烟雾是一种复杂的气溶胶，含有超过7,000种化学物质1，因此评估其各种单独组分对整体毒性的贡献具有挑战性。然而，可通过体外（in vitro）高通量筛选工具建立单个组分以及混合物的毒理学特征谱，从而对美国食品药品监督管理局（FDA）定义的烟草烟雾中有害和潜在有害成分（HPHCs）进行表征2。
为进行初步评估，采用基于阻抗的仪器对化合物的毒性进行实时、无标记检测。该仪器的读数依赖于细胞黏附、活力和形态，这些参数共同提供了细胞状态的总体情况。通过一个无量纲参数——细胞指数（cell index）进行定量分析。此外，建立了一套不同的染色方案，结合高内涵筛选（HCS）平台进行荧光成像分析，以更深入地了解每种烟草危害成分（HPHC）所引发的细胞毒性类型。
在测试的15种组分中，仅有5种因测得可计算的LD50 （< 20 mM）而被选用于基于高内涵筛选（HCS）的分析，分别为1-氨基萘、砷（V）、铬（VI）、巴豆醛和苯酚。根据其在HCS中的效应，1-氨基萘和苯酚可被鉴定为可诱导线粒体功能障碍；1-氨基萘、苯酚与铬（VI）均可基于组蛋白H2AX磷酸化水平升高被鉴定为具有基因毒性；巴豆醛被鉴定为氧化应激诱导剂，而砷（V）则被鉴定为应激激酶通路激活剂。
本研究证明，基于阻抗和高内涵筛选（HCS）技术的组合为 体外 CS成分的评估
引言
毒理学风险评估历来依赖动物模型，尽管动物模型在生命科学中具有基础性作用，但也存在诸多缺陷，例如对人类的可转化性不一致以及成本高昂。此外，近年来人们越来越致力于寻找动物实验的替代方法，以践行"3R原则"2（替代、减少和优化）。过去几年中，这一努力不断加速，不仅得益于高通量技术与系统生物学等新方法的进展，也受到立法限制动物实验的推动，尤其是在欧盟地区。
调控细胞对毒性损伤反应的信号通路具有复杂性，这表明仅使用单一的毒理学终点指标不足以描述某些化合物的毒理学基础。因此，还需考虑数百种相互作用的蛋白质所构成的生物网络之间的协同作用。为了研究毒物对这些网络的影响，结合表型中通量和高通量筛选实验的系统毒理学方法，有助于推断毒物的效价，同时提供更多关于单个毒物作用机制的信息。
在本研究中，我们采用高内涵筛选（HCS）作为强大的筛选工具。该工具由自动化显微镜和生物软件应用程序组成，能够获取、处理和分析来自基于荧光的细胞检测的图像数据。这使得可以在单个细胞或亚细胞水平上对细胞内的可视化变化进行定量，并同时分析多个参数。3 例如，通过基于抗体的方法检测组蛋白H2AX的磷酸化来评估DNA双链断裂，同时使用一种可穿透细胞膜且对超氧阴离子敏感的染料来定量活性氧（ROS）。
由于肺上皮细胞是抵御吸入性毒物（包括香烟烟雾）的第一道生物屏障，我们采用原代支气管上皮细胞作为研究模型 体外 用于分析美国食品药品监督管理局公布的有害和潜在有害成分（HPHCs）影响的模型。4 本文是对先前一项研究的后续工作5 我们评估了一组不同HPHCs的生物学影响。
作为我们评估细胞毒性的实验流程的一部分 体外我们首先利用基于阻抗的实时细胞分析（RTCA）系统，评估了15种HPHC化合物的活性，以确定适用于后续高内涵筛选（HCS）分析的剂量范围。图1）。随后使用九个细胞毒性的多参数终点指标进行毒理学高内涵筛选（HCS）评估，每个指标均在两个时间点（4 和 24 小时）进行监测。所用标志物可指示线粒体毒性、DNA 损伤、应激激酶、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）含量、caspase 3 - 7 活性、细胞色素 C 释放以及细胞膜通透性，具体如文中所述 表1.
我们的方法通过剂量和时间依赖性取样，实现了对香烟烟雾成分作用的鉴定与表征。最终，这产生了一个 体外 每种有害和潜在有害成分（HPHC）的毒理学特征。多组学方法也可用于进一步补充高内涵筛选分析，从而深入理解细胞信号传导和/或转录水平上的效应。
方案
1. 正常人支气管上皮细胞（NHBEs）的收获
- 将细胞培养基（支气管上皮细胞生长培养基添加物）、HEPES、胰蛋白酶和胰蛋白酶中和液（TNS）在37 °C水浴中预热。
- 当细胞融合度达到80%时收获细胞。
注意：以下人原代支气管上皮细胞（NHBE）培养接种条件可用于在未包被的T75培养瓶中加入20 ml培养基，以获得最佳汇合度：- 接种 1 × 106 用于3天培养的细胞，0.5 x 106 用于4天培养的细胞及0.25 x 106 用于5天培养的细胞。细胞培养期间每2天更换一次培养基，以补充营养。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2.
- 从烧瓶中移除上清液，并加入 HEPES 洗涤细胞（例如，75 cm² 培养瓶使用 3 ml2 烧瓶）。旋转每个烧瓶，使HEPES溶液覆盖细胞单层。
- 移除 HEPES 溶液，加入胰蛋白酶溶液（例如，75 cm²培养瓶使用3 ml2 烧瓶）。旋转烧瓶，使胰蛋白酶溶液覆盖细胞单层。
- 在 37 ± 2 °C 条件下孵育培养瓶 5 分钟。在显微镜下观察细胞脱落情况，必要时延长孵育时间，并轻轻敲击培养瓶以使残留的贴壁细胞脱落。
- 加入TNS以终止反应（例如，75 cm² 培养瓶使用 3 ml2 烧瓶）并将细胞悬液转移至15 ml离心管中。
- 将细胞悬液在300 × g下离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml新鲜培养基中，轻轻混匀，制成均匀的细胞悬液。
- 通过100 µM细胞筛过滤细胞悬液以去除细胞团块，并对细胞进行计数。注意：本实验室采用电场多通道细胞计数系统，以精确且一致地评估活细胞数量。
2. 基于实时细胞分析仪（RTCA）的剂量范围筛选（DRF）
注意：采用基于阻抗的检测系统进行以下操作：1）评估化合物的毒性，2）筛选出可进一步通过高内涵筛选（HCS）进行研究的化合物，3）确定适用于HCS的合适剂量。在RCTA板中的原代人支气管上皮（NHBE）细胞通过向每孔中已有的100 μl培养基加入25 μl待测化合物稀释液进行给药。因此，所有待测溶液均需配制为所需终浓度的5倍（5x）。
- 接种原代人支气管上皮细胞（NHBE细胞）
- 设定仪器程序，以定义阻抗测量的次数和持续时间。本研究中，每15分钟记录一次数据，持续48小时（给药前24小时±2小时至给药后24小时）。
- 通过移液将50 μl预热的培养基加入96孔RTCA板的每个孔中，以测量板背景值。注意：此步骤是仪器的技术要求，用于计算培养基的电学电阻，并作为基于细胞测量的基线参考值。
- 制备浓度为144,000个细胞/ml（±5%）的细胞悬液，并向已加入50 μl/孔培养基用于仪器背景测量的RTCA板各孔中加入50 μl细胞悬液（每孔7,200个细胞）。
- 将细胞在室温下静置30分钟以促进贴壁（以改善细胞分布的均一性），然后放入RTCA孵育架中。将RTCA板置于培养箱内的RTCA孵育架上（37 °C，5% CO2），并在给药前开始记录数据，持续24±2小时。
- HPHCs及阳性对照品的稀释
- 阳性对照品稀释
- 将星形孢菌素（Staurosporine）储备液（10 mM）用DMSO按1:10比例稀释（见表3），取5 μl稀释液加入195 μl培养基中，得到5倍工作液。
- HPHC稀释
- 将每种HPHC溶于相应溶剂（表2）中，配制成1 M的储备液。再将每种HPHC储备液用培养基按1:10比例稀释，得到100 mM的溶液。
- 使用含10%溶剂的培养基进行五步1:10倍系列稀释，制备“化合物主板”，以获得5倍工作液（图2）。注意：最终剂量分别为0.2 μM、2 μM、20 μM、0.2 mM、2 mM、20 mM。同时在此步骤中制备仅含溶剂的0剂量组。
- 给药
- 暂停RTCA仪器运行，打开孵育架取出检测板。
- 取出检测板后立即放入RTCA板温控工具中（该工具用于在RTCA系统外操作期间维持RTCA板的温度），以避免细胞冷却，从而影响阻抗测量结果。
- 从“化合物主板”中取25 μl的5倍溶液加入细胞孔中，每组设三个复孔，保持与化合物主板相同的加药顺序（最高剂量位于最上排，溶剂对照位于第7排）（图2）。无需移除原有（100 µl）的细胞培养基。
- 向最下排右侧半部分孔中的细胞加入25 μl的5倍阳性对照溶液，不更换原有培养基；向最下排左侧半部分孔中的细胞加入25 μl培养基，同样不更换原有细胞培养基。
- 用封板膜密封检测板，放回RTCA孵育架并锁定。重新启动数据记录，持续至预定暴露时间（例如，24小时）。注意：建议使用该封板膜以避免潜在污染，包括孔间交叉污染。
- RTCA数据分析及LD50计算
- 将原始数据导出为文本（.txt）或Excel（.xls）文件。注意：文件将包含有关板布局的所有信息（化合物、剂量及孔位）。原始细胞指数值以96孔格式组织（与板孔分布一致），并提供每次记录时间点的数据。在时间t时96孔板中位置i处的值记为CIt(i)。
- 确定每个位置i在给药前最后一个时间点作为归一化参考点（例如，位置i在23小时50分00秒时的细胞指数，CIt(i)=23:50:00 = CIRef(i)）。注意：该信息必须在给药时进行标注。
- 以孔为单位，将每个时间点的值除以归一化参考值，使所有值在给药时间点实现归一化。在时间t时96孔板中位置i的归一化值记为NCIt(i)，其定义为NCIt(i) = CIt(i) / CIRef(i)，适用于所有时间点t。
- 计算每一样本i（96孔板中的位置i）在给药后24小时的曲线下面积（AUC），包括阳性对照和溶剂对照孔位。
- 通过累加每个矩形区域的面积来获得位置i的AUC，每个矩形位于两个时间点tk和tl之间（tk l）；使用x*y计算每个矩形面积，其中x = tl - tk为两个时间点之间的间隔，y为两个时间点活性值的平均值（y = (NCItk(i) + NCItl(i)) / 2）。
注意：位置i在给药后24小时的AUC记为AUC(i)。由于所有条件均设三个复孔，采用三个值的中位数。
- 通过累加每个矩形区域的面积来获得位置i的AUC，每个矩形位于两个时间点tk和tl之间（tk l）；使用x*y计算每个矩形面积，其中x = tl - tk为两个时间点之间的间隔，y为两个时间点活性值的平均值（y = (NCItk(i) + NCItl(i)) / 2）。
- 使用以下公式对数值进行归一化：
其中i为96孔板中计算了给药后24小时AUC的位置，
Vehicle为给药后24小时板上溶剂对照孔AUC值的中位数，
Positive control为给药后24小时板上阳性对照孔AUC值的中位数，
CR为溶剂对照期望的中位归一化值（0%），
SC为阳性对照期望的中位归一化值（-100%）
注意：此步骤结束后，获得一个数据集，其中包含96孔板中每个位置i的浓度ci（以对数单位表示），以及对应于位置/孔i样本的给药后24小时归一化AUC值AUC_normalized(i)。 - 使用四参数Hill方程对(ci, AUC_normalized(i))值进行绘图和拟合。如可能，同时计算LD50。
其中Y = AUC_normalized，
Zero Activity S0 = 测试化合物浓度为零时的活性水平，
Infinite Activity Sinf = 化合物浓度无限大时的活性水平，
AC50 = 活性达到最大水平50%时的浓度，
Hill coefficient n = AC50处曲线斜率的度量，
c = 对数单位的浓度，对应于剂量-反应曲线图横轴上的数值。
注意：在细胞毒性检测中，AC50对应于LD50，是效力的度量指标，数值越低表示效力越高。
- 阳性对照品稀释
3. 通过高内涵筛选测量毒理学效应
注意：使用高内涵筛选（HCS）平台测量共计九个毒性多参数指标，这些指标分为六种不同的检测方法（表1）。根据RTCA细胞活力分析（第2节），确定每种成分的剂量范围，同时包含一个3R4F参考剂量。该参考剂量相当于一支参考香烟3R4F烟气中所含的有害和潜在有害成分（HPHC）的量。
- 接种 NHBE 细胞
- 制备细胞悬液，浓度为 120,000 个细胞/ml（± 5%），向每孔 96 孔 HCS 板中加入 100 µl 细胞悬液（每孔 12,000 个细胞）。为所有检测（细胞毒性、DNA 损伤、应激激酶、活性氧、谷胱甘肽含量和细胞凋亡）及时间点（4 小时和 24 小时）准备足够数量的板。
- 将 HCS 板在室温下静置 30 分钟，使细胞贴壁，随后在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 24 ± 2 小时，然后进行给药。
- HCHP 和阳性对照品的稀释
注：HCS 板中的 NHBE 细胞将通过向每孔已有的 100 µl 培养基中加入 25 µl 测试样品溶液进行给药。因此，所有剂量应配制为所需终浓度的 5 倍。- 阳性对照品稀释（阳性对照板）
- 将每种阳性对照品的储备液（见表 3）各取 40 µl 加入第 2 列（图 4a，红色阴影孔）；在第 3 列和第 5 列（图 4a，浅蓝色阴影孔）各加入 20 µl 溶剂，在第 4 列（图 4a，浅蓝色阴影孔）各加入 40 µl 溶剂。
- 从第 2 列各孔中吸取 12 µl，转移至第 3 列各孔并混匀（图 4b），依次操作，直至获得每种阳性对照化合物的三剂量（d1、d2 和 d3）及溶剂（V）的最终系列稀释液（图 4c）。为制备阳性对照板，将化合物在培养基中进行 1:40 稀释（图 4d）。
- HPHC 稀释（化合物主板）
注：HCS 实验中 HPHC 的选定剂量范围列于表 2。- 将每种 HPHC 储备液（1 M）用培养基按 1:10 稀释，得到 100 mM 浓度。使用含 10% 溶剂的培养基进行稀释，以获得每种 HPHC 所需的 5 倍剂量。
- 阳性对照品稀释（阳性对照板）
- 给药
- 从化合物主板中取 25 μl 的 5 倍浓度溶液，加入细胞孔中，每组设三个复孔，保持与化合物主板相同的加药顺序（最高剂量位于最上一行，溶剂对照位于第 7 行）（图 5）。无需移除原有（100 µl）细胞培养基。
- 从阳性对照板中取 25 μl 的 5 倍浓度溶液，加入板底部一行的细胞孔中，保持与阳性对照板相同的加药顺序（图 5）。无需移除原有（100 µl）细胞培养基。注：每项检测均有特定的阳性对照品；参见表 3。将板置于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育至所需暴露时间（4 或 24 小时）。
- 染色
- 所有检测的准备工作
- 将洗涤缓冲液（PBS）预热至 37 °C。
- 通过将 10.81 ml 的 37% 甲醛加入 89.19 ml 洗涤缓冲液中配制固定液（4% 甲醛溶液），并预热至 37 °C。
- 将 10 ml 的 10 倍通透缓冲液加入 90 ml 洗涤缓冲液中配制通透缓冲液，并预热至 37 °C。
- 将 10 ml 的 10 倍封闭缓冲液加入 90 ml 洗涤缓冲液中配制封闭缓冲液，并预热至 37 °C。
- 将细胞培养基预热至 37 °C。
- 当达到 4 小时和 24 小时暴露时间后，从培养箱中取出 HCS 板，并按以下各项检测的具体方案进行操作。
- 细胞毒性检测
- 根据以下公式配制足量（V）的活细胞染色液：培养基体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 根据供应商说明，将线粒体染料稀释于活细胞染色液中。根据供应商说明，将膜通透性染料稀释于活细胞染色液中。
- 向标记为“细胞毒性检测”的板的每孔中加入 50 μl 活细胞染色液。无需移除细胞培养基，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
- 轻柔吸除培养基和染色液，每孔加入 100 μl 固定液，然后在室温避光条件下孵育 20 分钟。
- 轻柔吸除固定液，每孔用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤一次。
- 吸除洗涤缓冲液，每孔加入 100 μl 1 倍通透缓冲液，室温避光孵育 10 分钟。
- 吸除通透缓冲液，使用板式洗涤器每孔用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤两次。
- 吸除洗涤缓冲液，每孔加入 100 μl 1 倍封闭缓冲液，室温避光孵育 15 分钟。
- 根据以下公式配制足量（V）的一抗溶液：封闭缓冲液体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。将抗细胞色素 C 抗体（小鼠来源）按 1:250 比例稀释于一抗溶液中。
- 吸除封闭缓冲液，每孔加入 50 μl 一抗溶液，室温避光孵育 60 分钟。
- 根据以下公式配制足量（V）的二抗与核染料溶液：封闭缓冲液体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。将抗小鼠抗体按 1:500 比例稀释于二抗与核染料溶液中。将核染料按 1:1,000 比例稀释于二抗与核染料溶液中。
- 吸除一抗溶液，使用板式洗涤器每孔用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤三次。
- 吸除洗涤缓冲液，每孔加入 50 μl 二抗与核染料溶液，室温避光孵育 60 分钟。
- 吸除二抗与核染料溶液，使用板式洗涤器每孔用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤三次。每孔加入 100 μl 洗涤缓冲液。板现已准备好，可在 HCS 读板仪上进行检测。
- DNA 损伤检测
- 轻柔吸除标记为“DNA 损伤”的板中的培养基。
- 执行与步骤 3.4.2.4–3.4.2.8 相同的操作。注意在此情况下，步骤 3.4.2.4 仅移除培养基。
- 根据以下公式配制足量（V）的一抗溶液：封闭缓冲液体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 将抗磷酸化 H2AX 抗体（小鼠来源）按 1:2,000 比例稀释于一抗溶液中。
- 执行与步骤 3.4.2.10 相同的操作。
- 根据以下公式配制足量（V）的二抗与核染料溶液：封闭缓冲液体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 将抗小鼠抗体按 1:500 比例稀释于二抗与核染料溶液中。
- 将核染料按 1:1,000 比例稀释于二抗与核染料溶液中。
- 执行与步骤 3.4.2.12–3.4.2.14 相同的操作。
- 应激激酶检测
- 轻柔吸除标记为“应激激酶”的各板中的培养基。
- 执行与步骤 3.4.2.4–3.4.2.8 相同的操作。注意在此情况下，步骤 3.4.2.4 仅移除培养基。
- 根据以下公式配制足量（V）的一抗溶液：封闭缓冲液体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 将抗磷酸化 cJun 抗体（兔来源）按 1:200 比例稀释于一抗溶液中。
- 执行与步骤 3.4.2.10 相同的操作。
- 根据以下公式配制足量（V）的二抗与核染料溶液：封闭缓冲液体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 将抗兔抗体按 1:500 比例稀释于二抗与核染料溶液中。
- 将核染料按 1:1,000 比例稀释于二抗与核染料溶液中。
- 执行与步骤 3.4.2.12–3.4.2.14 相同的操作。
- 活性氧检测
- 根据以下公式配制足量（V）的活细胞染色液：培养基体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 根据供应商说明，将活性氧染料稀释于活细胞染色液中。
- 将核染料按 1:1,000 比例稀释于活细胞染色液中。向标记为“活性氧”的各板每孔中加入 50 μl 活细胞染色液；无需移除细胞培养基，于室温避光条件下孵育 30 分钟。
- 轻柔吸除培养基和染色液，每孔用 100 μl 培养基洗涤三次。
- 吸除培养基，每孔加入 100 μl 固定液，室温避光孵育 20 分钟。
- 轻柔吸除固定液，每孔用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤三次。
- 每孔加入 100 μl 洗涤缓冲液。板现已准备就绪。
- 在 1 小时内使用 HCS 读板仪进行检测。
- 谷胱甘肽含量检测
- 根据以下公式配制足量（V）的活细胞核染色液：培养基体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 将核染料（远红外）按 1:1,000 比例稀释于活细胞核染色液中。向标记为“谷胱甘肽含量”的各板每孔中加入 50 μl 活细胞核染色液；无需移除细胞培养基，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
- 根据以下公式配制足量（V）的活细胞谷胱甘肽染色液：HBSS 体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 根据供应商说明，将谷胱甘肽染料稀释于活细胞谷胱甘肽染色液中。
- 轻柔吸除培养基和核染色液，每孔用 100 μl 培养基洗涤三次。
- 吸除培养基，每孔加入 100 μl 活细胞谷胱甘肽染色液。
- 室温避光孵育 10 分钟。板现已准备就绪。
- 在 1 小时内使用 HCS 读板仪进行检测。
- 细胞凋亡检测
- 根据以下公式配制足量（V）的活细胞染色液：培养基体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 将 Caspase 染料按 1:300 比例稀释于活细胞染色液中。
- 移除细胞培养基，向标记为“细胞凋亡”的各板每孔中加入 50 μl 活细胞染色液，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
- 根据以下公式配制足量（V）的活细胞核染色液：固定液体积（μl）V = 50 × W × 1.2（W 为孔数）。
- 将核染料按 1:1,000 比例稀释于活细胞核染色液中。
- 移除活细胞染色液，每孔加入 100 μl 活细胞核染色液，室温避光孵育 30 分钟。
- 吸除固定液/核染料溶液，每孔用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤三次。
- 每孔加入 100 μl 洗涤缓冲液。板现已准备就绪。
- 在 HCS 读板仪上进行检测。
- 所有检测的准备工作
- HCS 数据分析
- 将原始数据导出为 Excel (.xls) 文件。注：原始细胞指数值按 96 孔板格式组织（与板孔分布一致），并提供给药后各时间点的每个终点。
- 使用以下公式对数值进行归一化：
其中 i 为某孔测得的原始信号值，
Vehicle 为该板上溶剂孔测得信号值的中位数，
CR 为溶剂的期望归一化中位数值（0%），
SC 为阳性对照品的期望归一化中位数值（100），
注：此步骤结束后，获得一个数据集，其中包含 96 孔板中每个位置 i 的施加浓度 ci（以对数单位表示）及其对应的归一化信号 N(i)。 - 使用四参数 Hill 方程对 (ci, N(i)) 值进行绘图和拟合。
其中零活性 S0 = 测试化合物浓度为零时的活性水平，
无限活性 Sinf = 浓度无限大时的活性水平，
AC50 = 活性达到最大水平 50% 时的浓度，
Hill 系数 n = AC50 处曲线斜率的度量，
c = 以对数单位表示的浓度，对应于剂量-反应曲线图横轴上的值。
注：AC50 是效力的度量指标，数值越低表示效力越高。
结果
RTCA
由于在未检测到毒性效应时，HCS终点指标将不具信息性，因此在RCTA中即使在最高浓度下也未显示细胞活力下降的化合物将不进行HCS测试（图3b,c,d,g,k,l,m,p）。仅在最高浓度下显示细胞活力下降的化合物（图3e,o）也被排除在HCS测试之外。最终，仅选择具有可计算LD50 （< 20 mM）的组分进行进一步的HCS分析（图3a,f,h,j,n）。符合上述标准的HPHCs包括：1-aminonaphtalene、Arsenic (V)、Chromium (VI)、Crotonaldehyde 和 Phenol。
HCS
作为质量控制（QC），首先分析阳性对照，以确保染色步骤正确执行。经阳性对照处理的细胞的代表性图像见图6。数据值如前所述以溶剂对照组为基准进行归一化。由于仅测试了三个剂量，且并非在每个时间点都考虑全部三个剂量，因此未绘制剂量-反应曲线。阳性对照的剂量选择基于前期实验（数据未显示），以确保在4小时和24小时两个时间点上，每个检测终点均能观察到适当的反应。具体而言，剂量1和剂量2用于评估4小时的效应，而剂量2和剂量3用于评估24小时的效应。若阳性对照剂量未观察到任何反应，则弃用该培养板。需注意的是，除线粒体膜电位和谷胱甘肽（GSH）含量外，所有其他检测终点均预期信号强度增加。
除苯酚外，所有化合物均诱导产生坏死表型，表现为细胞膜通透性增加（图 7a,f,h,l）。根据组蛋白 H2AX 磷酸化水平升高，1-氨基萘、六价铬、巴豆醛和苯酚被鉴定为具有遗传毒性（图 7e,j,n,p）。苯酚和 1-氨基萘可诱导严重的线粒体功能障碍（图 7b,o），其中 1-氨基萘还导致细胞色素 C 释放增加（图 7c）。检测到的caspase 3/7 活性升高表明铬暴露可引发细胞凋亡事件。在 1-氨基萘、巴豆醛和苯酚处理下也检测到氧化应激（ROS 或 GSH）的诱导（图 7d,m,q）。最后，砷通过转录因子 cJun 的磷酸化水平升高，显示出可诱导细胞应激（图 7g）。
图1. 化合物毒性分析工作流程。 a) 本研究中采用的工作流程示意图。首先，使用RTCA平台进行剂量范围探索，以选择适合后续HCS实验的剂量，从而表征化合物特异性的毒性谱。 b) 本研究的实验设计。细胞接种后24小时给予药物处理，并在接下来的24小时内持续监测阻抗值，而HCS终点指标则在给药后4小时和24小时进行检测。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. RTCA 暴露板。 首先通过五步 1:10 连续稀释制备化合物母板。随后将每种化合物（包括溶剂对照组，剂量为 0）以三复孔形式加入暴露板中，同时加入培养基和星形孢素作为对照。注意转移过程中保持剂量顺序不变，最高剂量位于第 1 行，而溶剂对照组位于第 7 行。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3. RTCA 细胞活力检测的代表性结果。 a) 1-氨基萘，b) 2-硝基丙烷，c) 乙酰胺，d) 丙酮，e) 丙烯酰胺，f) 砷 (V)，g) 苯，h) 铬 (VI)，j) 巴豆醛，k) 甲基乙基酮，l) 镍 (II)，m) 硝基苯，n) 苯酚，o) 喹啉，p) 甲苯。给药后 24 小时，计算每个剂量（包括阳性对照和溶剂对照）的曲线下面积（AUC），并将其归一化为 0 至 -100% 活性范围（y 轴），其中 0 表示溶剂对照的活性，-100 表示阳性对照的活性。随后将数值绘图，并使用四参数 Hill 方程进行拟合，在可能的情况下计算 LD50 值。浓度以对数尺度表示（x 轴）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4. HCS检测中阳性对照化合物的稀释方案。 a) 将阳性对照和溶剂加入连续稀释板中。 b) 阳性对照的连续稀释。 c) 200倍浓度的阳性对照剂量。 d-e) 将200倍浓度的阳性对照剂量在培养基中按1:40稀释，以制备含有5倍浓度剂量的阳性对照板。注意每个剂量均设三个复孔，以对应暴露板中的最终布局。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5. 高内涵筛选暴露板。 首先通过五步稀释法配制化合物母板。随后，每种化合物（包括溶剂对照，剂量为0）与阳性对照一同以三复孔形式加入暴露板中。请注意，转移过程中保持剂量顺序不变，最高剂量位于第1行，而溶剂对照位于第7行。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6. 抗体或染料染色细胞的代表性荧光图像。 a) 核参数 — 核染料：一种可穿透细胞膜的染料，可与活细胞或固定细胞中的 DNA 结合。该染色用于标记细胞核区域以识别单个细胞。b) 坏死 — 细胞膜通透性染料：基于染料检测细胞膜完整性。该试剂本身不能穿透细胞膜。在发生坏死时，细胞膜变得通透，染料进入细胞并与 DNA 结合，产生强烈的荧光信号。c) 凋亡 — 细胞色素 C：基于抗体检测细胞色素 C 的释放，这是早期凋亡的公认标志之一。在凋亡被诱导后，细胞色素 c 从线粒体释放并扩散至细胞核。d) DNA 损伤 — pH2AX：基于抗体检测组蛋白 H2AX 的磷酸化，这是双链 DNA 断裂的公认标志。e) 应激激酶 — cJun：基于抗体检测 cJun 在 Ser-73 位点的磷酸化，这是细胞应激的公认标志。f) 氧化应激 — DHE：基于染料检测超氧自由基。二氢乙啶（Dihydroethidium）本身在细胞质中发出蓝色荧光，而其氧化产物乙啶（ethidium）插入 DNA 后发出红色荧光。g) GSH — mBcl：基于染料检测游离 GSH 分子。mBcl 与 GSH 反应生成一种高度荧光的产物。h) 凋亡 — Caspase 3/7 活化：基于染料检测 Caspase 3/7 的活性。该试剂本身无荧光，含有一段四氨基酸肽可抑制其与 DNA 结合。当 Caspase-3/7 被活化后，该肽段被切割，使染料能够结合 DNA 并产生明亮的荧光信号。图中 b–h 面板显示经阳性对照处理的细胞。请点击此处查看该图的放大版本。
图7. 代表性高内涵筛选（HCS）结果。 1-氨基萘（a-e）、五价砷（f 和 g）、六价铬（h-k）、巴豆醛（l-n）和苯酚（o-q）。每种剂量下的4小时（蓝色线）和24小时（橙色线）信号均被计算，并以溶剂对照组活性（0%）为基准进行归一化。未参与曲线拟合计算的数值以灰色显示。浓度以对数尺度表示（x轴）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 检测 | 终点编号 | 生物学终点 | 细胞区室 | 输出特征 |
| 细胞毒性 | 1 | 线粒体质量 6 | 细胞质 | 斑点平均面积 |
| 2 | 线粒体膜电位 6 | 细胞质 | 斑点平均强度 | |
| 3 | 细胞色素C释放 7 | 细胞核 | 平均强度 | |
| 4 | 细胞膜通透性 8 | 细胞核 | 平均强度 | |
| DNA损伤 | 5 | 磷酸化-H2AX 9 | 细胞核 | 平均强度 |
| 应激激酶 | 6 | 磷酸化-cJun10 | 细胞核 | 平均强度 |
| ROS | 7 | ROS 11 | 细胞核 | 平均强度 |
| GSH含量 | 8 | GSH 12 | 细胞质 | 斑点平均强度 |
| 凋亡 | 9 | Caspase 313 | 细胞质 | 斑点平均强度 |
表1. 高内涵筛选（HCS）检测方法及终点指标列表。
| 溶剂 | RTCA 剂量 (µM) | LD50 | HCS 剂量 | |||||||||||
| 基于细胞活力筛选的剂量 (µM) | 3R4F (nM) | |||||||||||||
| 1-氨基萘 | EtOH | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 280 µM | 2,000 | 500 | 200 | 150 | 0.27 | |
| 2-硝基丙烷 | EtOH | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 乙酰胺 | EtOH | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 丙酮 | Water | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 丙烯酰胺 | Water | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 砷 (V) | Water | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 160 µM | 200 | 100 | 50 | 25 | 0.17 | |
| 苯 | EtOH | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 铬 (VI) | Water | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 20 µM | 100 | 50 | 20 | 10 | 0.06 | |
| 巴豆醛 | Water | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 200 µM | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2,000 | |
| 甲基乙基酮 | Water | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 镍 | Water | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 硝基苯 | EtOH | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 苯酚 | EtOH | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 2,300 µM | 5,000 | 2,000 | 1,000 | 500 | 240 | |
| 喹啉 | EtOH | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| 甲苯 | Water | 20,000 | 2,000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
表2. 处理24小时后相对LD50的已测试HPHC化合物列表。 用于高内涵筛选（HCS）分析的化合物以橙色标出，同时列出了测试剂量。3R4F剂量相当于一支参考香烟3R4F烟雾中该成分的含量。
| 检测 | 化合物 | 储存液浓度 | 溶剂 | 剂量 (µM) | ||
| 细胞活力 | Staurosporine | 10 mM | DMSO | 50 | ||
| 细胞毒性 | Valinomycin | 10 mM | DMSO | 50 | 20 | 5 |
| DNA损伤 | Paraquat | 100 mM | DMSO | 500 | 200 | 50 |
| 应激激酶 | Anisomycin | 2 mM | DMSO | 10 | 4 | 1 |
| ROS | Rotenone | 200 mM | DMSO | 1,000 | 400 | 100 |
| GSH含量 | Ethacrynic acid | 200 mM | DMSO | 1,000 | 400 | 100 |
| 细胞凋亡 | Staurosporine | 40 mM | DMSO | 200 | 50 | 20 |
表3. 各项检测所用阳性对照及其浓度列表。
讨论
近年来，人们广泛讨论了替代动物实验以及开发新型高通量检测方法的迫切需求。这促使科研人员和监管机构积极探索用于标准毒性测试的替代方法，利用能够紧密模拟靶组织生理特性的细胞检测技术。在本研究中，我们展示了将实时细胞分析仪（RTCA）与高内涵筛选（HCS）平台相结合，用于评估单一香烟烟雾成分暴露对人肺上皮细胞影响的可行性。该实验体系同样可类比应用于评估其他多种空气污染物、空气颗粒物及纳米颗粒所诱导的细胞毒性。此外，所获得的结果可与全基因组转录组学数据以及基于因果生物网络的计算方法结果进行比对。如先前报道所述，该方法使我们能够将香烟烟雾暴露引起的分子通路扰动数据5与HCS的终点指标相互印证，从而在表型水平上进一步验证这些通路的扰动效应。
作为一种流程图式检测方法，实时细胞分析能够以剂量和时间依赖的方式提供与细胞活力相关的信息，从而有助于更好地决策下游分析所需的合适剂量和作用时间点14。该分析仪的原理基于细胞在覆盖有金微电极的培养孔表面贴附和伸展时所引起的电学阻抗变化。阻抗被转换为一个无量纲参数，称为细胞指数（cell-index），可用于监测细胞的贴附、伸展、形态变化以及最终的细胞活力。尽管该技术不能提供有关细胞毒作用机制的信息，但其高灵敏度使得即使在高内涵筛选（HCS）无法获得有效信息的极低剂量下，也能检测到细胞形态的变化（数据未显示）。根据前期实验结果，我们注意到，与HCS检测终点相比，RTCA方法能够在更低的剂量下检测到细胞形态的变化。
在使用实时细胞分析仪进行初步筛选后，采用高内涵筛选（HCS）平台进一步深入分析每种有害烟气成分（HPHC）所引发的细胞毒性类型。HCS检测组合可对HPHCs在细胞区室/细胞器中的潜在影响进行表征，并识别出具有基因毒性或氧化应激效应的成分。分析结果显示，所选的HPHCs在正常人支气管上皮（NHBE）细胞中诱导出不同的毒性特征。总体而言，除苯酚外，所有化合物在最高测试剂量下均被发现可诱导细胞坏死。与潜在致癌作用一致，1-氨基萘可诱导H2AX磷酸化，作为基因毒性的标志物；然而，HCS检测组合还发现该HPHC在 mitochondrial 毒性检测中具有活性（线粒体质量增加和细胞色素C释放）以及引发氧化应激（谷胱甘肽耗竭）。同样，如先前所述，苯酚被证实可诱导线粒体功能障碍，并导致DNA损伤及谷胱甘肽耗竭。铬（VI）（被归类为I类致癌物的化合物之一）和巴豆醛也被确认具有基因毒性；特别是铬（VI）还可诱导细胞凋亡（caspase级联激活），而巴豆醛则导致活性氧（ROS）生成增加。最后，砷（V）被发现可诱导cJun磷酸化，这是应激激酶通路激活的标志。
在本研究中，我们采用原代人支气管上皮（NHBE）细胞作为肺上皮细胞的模型 体外在高内涵筛选（HCS）环境中使用这些细胞尚属首次，使得研究人员能够检测更广泛的终点指标，包括基因毒性及氧化应激标志物。本方案中描述了活细胞和固定细胞染色两种方法，体现了该技术整体上的灵活性。事实上，相同的方案可拓展应用于更广泛的检测目标，只需使用任何荧光染料或抗体即可实现。在成功实施活细胞染色方案时，需特别注意孵育时间，因为部分染料的半衰期较短，若图像采集尚未完成，荧光信号可能已减弱。此外，若更换不同类型的细胞，所有染色条件均需重新评估，因为最佳染料浓度和孵育时间可能有所不同。
在本研究中，我们描述了一种仅使用高内涵筛选（HCS）方法检测五种化合物的实验场景。根据前述的孔板布局，这些化合物在两组不同的孔板上进行给药，共计24块孔板（6个检测项目，2个时间点）。孔板数量也可进一步增加，从而实现更多化合物的同时筛选或更多终点指标的检测。然而，在实施前需注意，某些终点指标（如GSH和ROS）需要立即进行检测，因此孔板的给药应分批进行，以便为前一块孔板的检测留出时间。另一方面，采用固定细胞染色方案具有优势，因为孔板可在固定后的任意步骤暂停并堆叠存放，待后续阶段再继续完成染色流程。例如，该策略可为操作人员提供充足时间，完成所有活细胞染色孔板的操作，同时不损害数据质量。
为了通过减少培养板数量进一步优化工作流程，还可以将更多检测终点进行多重检测。例如，在本实验中，只需使用两种在不同通道发射荧光的荧光染料标记的二抗，即可同时检测DNA损伤和应激激酶。随着高内涵筛选（HCS）平台的持续发展，包括实现细胞接种、化合物稀释、给药和染色的全自动化，以及新增更多检测终点，HCS平台作为针对上皮细胞及其他细胞类型中高潜力化合物（HPHCs）的强大表型分析工具的能力将进一步拓展。
披露
所有作者均为菲利普莫里斯国际公司的员工。菲利普莫里斯国际公司是本项目的唯一资金来源和资助方。
致谢
作者感谢 Karsta Luettich 和 Grégory Vuillaume 对手稿的审阅。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cellomics ArrayScan VTI 高内涵筛选成像系统 | 赛默飞世尔科技 | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| 筛选仪（高内涵筛选，HCS） | Genedata | NA | |
| CASY细胞计数仪TTC | 罗氏 | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA 96孔板 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA 心脏温度工具 | ACEA | 2801171 | |
| 板封膜 Breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| 正常人支气管上皮细胞（NHBE） | Lonza | CC-2540 | 非吸烟的60岁白人男性供体 |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | 37℃预热 °使用前置于 C |
| ReagentPack 传代培养试剂盒 | Lonza | CC-5034 | 37℃预热 °使用前置于 C |
| 青霉素/链霉素（100倍浓缩液） | 康宁 | 30-002-CI | |
| Easy Flask 滤芯瓶盖 75 cm2 | 赛默飞世尔科技 | 12-565-349 | |
| 96孔检测板 黑色 | 康宁 | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5（用于远红光核染色） | 生物状态 | DR50200 | |
| 线粒体染料：MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| 线粒体染料：MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS染料：二氢乙啶 | Sigma | D7008 | |
| ROS染料：CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS染料：MitoSOX | 生命技术 | M36008 | |
| GSH 染料：单氯荧光素 | Sigma | 69899 | 有毒的 |
| GSH 染料：单溴二氯荧光素 | 生命技术公司 | M-1378 | 有毒的 |
| 膜通透性染料：YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | 刺激性 |
| 膜通透性染料：TO-PRO-1 | 生命技术 | T3602 | 刺激性 |
| 膜通透性染料：TOTO-1 | Life technologies | T3600 | 刺激性 |
| Caspase 染料：Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | 刺激性 |
| 抗细胞色素C抗体（小鼠） | 赛默飞世尔科技 | MA5-11823 | |
| 抗磷酸化c-Jun抗体（小鼠） | 赛默飞世尔科技 | MA5-15889 | |
| 抗磷酸化H2AX抗体（小鼠） | 赛默飞世尔科技 | MA1-2022 | |
| 山羊抗小鼠IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10x 穿孔缓冲液 | Fisher | 8408400 | |
| 4% 甲醛溶液 | Sigma | F1635 | 有毒的 |
| 10x 封闭缓冲液 | Fisher | 8408500 | |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 | Sigma | D8537 | |
| Hanks' 平衡盐溶液 | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | 有毒的 |
| 缬氨霉素 | Sigma | V0627 | 有毒的 |
| 百草枯 | Sigma | 36541 | 有毒的 |
| 茴香霉素 | Sigma | A9789 | 有毒的 |
| 依他尼酸 | Sigma | E4754 | 有毒的 |
| 1-氨基萘 | Sigma | 34390 | 有毒的 |
| 2-硝基丙烷 | Sigma | 130265 | 有毒的 |
| 乙酰胺 | Sigma | 695122 | 有毒的 |
| 丙酮 | Sigma | 650501 | 有毒的 |
| 丙烯酰胺 | Sigma | A9099 | 有毒的 |
| 砷（V） | Sigma | A6756 | 有毒的 |
| 苯 | Sigma | 12540 | 有毒的 |
| 六价铬（Cr(VI)） | Sigma | 216623 | 有毒的 |
| 巴豆醛 | Sigma | 262668 | 有毒的 |
| 甲基乙基酮 | Sigma | 34861 | 有毒的 |
| 镍 | Sigma | 203866 | 有毒的 |
| 硝基苯 | Sigma | 48547 | 有毒的 |
| 苯酚 | Sigma | P5566 | 有毒的 |
| 喹啉 | Sigma | 241571 | 有毒的 |
| 甲苯 | Sigma | 34866 | 有毒的 |
参考文献
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
重印与许可
