O objetivo deste protocolo é avaliar a pressão arterial sistêmica em camundongos conscientes em movimento livre usando dispositivos de radiotelemetria implantáveis.
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Artigo de método
Longo prazo medição de pressão arterial em ratos movimentando-se livremente utilizar telemetria
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante o desenvolvimento de novos agentes vasoativos, monitorização da pressão sanguínea arterial é crucial para avaliar a eficácia dos novos medicamentos propostos. De fato, a pesquisa com foco na descoberta de novos alvos terapêuticos potenciais usando ratos geneticamente modificados exige uma avaliação fiável e de longo prazo da variação da pressão arterial sistêmica. Atualmente, o padrão ouro para a obtenção de medidas de longo prazo da pressão arterial em ratos ambulatoriais utiliza rádio-transmissores implantáveis, que exigem canulação da artéria. Esta técnica elimina a necessidade de tethering, restringindo ou anestesiar os animais que introduzem o stress e artefatos durante a amostragem de dados. No entanto, a monitorização da pressão arterial em ratos através de cateterismo pode ser bastante desafiador, devido ao pequeno tamanho das artérias. Aqui nós apresentamos um guia passo-a-passo para ilustrar as passagens-chave cruciais para a implantação subcutânea bem sucedida de rádio-transmissores e artéria carótida cannulation em ratinhos. Nós também incluímos exemplos de atividade pressão arterial a longo prazo retiradas de ratos movimentando-se livremente após um período de recuperação pós-cirurgia. Após este procedimento permitirá gravações de pressão arterial direta de confiança de vários animais ao mesmo tempo.
Introdução
A hipertensão arterial é um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares, sem dúvida, é um grande problema de saúde pública tanto nos países desenvolvidos e em desenvolvimento 1. Vários modelos animais de hipertensão experimentais têm sido desenvolvidos para imitar respostas hipertensivas, como as observadas em humanos 2. Entre outros, o mouse ambulatório representa um excelente modelo para o estudo da gênese e progressão da hipertensão permitindo a análise in vivo das consequências da exposição crônica à hipertensão.
Pressão arterial (PA) de monitoramento em camundongos tem ajudado os pesquisadores a desvendar vários mecanismos envolvidos na fisiologia e fisiopatologia de doenças como hipertensão e insuficiência cardíaca 3, 4. Com efeito, a manipulação do genoma de ratinho permitiu a geração de modelos transgénicos ou alvejado para o gene apropriado para o estudo da hipertensão 5, 6. No entanto, mesmo a manipulação suavede ratos conscientes induz excitações que podem potencialmente causadores de artefatos durante a aquisição de dados, enquanto o uso de sedação ou tranquilizantes afetar profundamente a pressão arterial 7. Estes aspectos são particularmente importantes e devem ser levados em consideração ao tentar monitoramento BP longo prazo.
Existem várias maneiras de gravar BP em ratos, e uma comparação entre as técnicas mais comuns atualmente disponíveis tem sido discutido em outra parte 8, 9. No entanto, as recomendações da AHA de medição BP concluiu que a medição intra-arterial da pressão arterial são geralmente preferidos devido à sua capacidade para medir directamente PA ao longo de um período prolongado de tempo 10. Radiotelemetria juntamente com medida direta da pressão arterial é o método state-of-the-art para monitorar as funções fisiológicas no acordado e movendo-se livremente animais de laboratório, minimizando o estresse e artefatos ambientalmente associados 9, 11.Radiotelemetria oferece a capacidade de recolher automaticamente a pressão arterial, freqüência cardíaca, temperatura corporal e atividade animal provenientes de vários animais conscientes.
Embora esta metodologia está se tornando muito popular em muitos laboratórios, implantação de rádio-telemetria em camundongos pode ser tecnicamente desafiadora. Aqui, mostramos um protocolo passo-a-passo que ilustra como a implantação de um transdutor de pressão em ratinhos. A técnica envolve a inserção subcutânea da sonda no corpo do rato, canalizar o cateter para o pescoço e para a frente perto do arco aórtico através da artéria carótida esquerda. dados remotamente capturados são mostrados ao vivo no monitor do computador. Os dados também são armazenados para análise "off-line".
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Protocolo
declaração de ética: Todos os procedimentos com animais mencionados neste vídeo-artigo foram revistos e aprovados pela Comissão de animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade de Tennessee Health Science Center.
Nota: Utilize instrumentos de microcirurgia estéreis durante todo o procedimento cirúrgico. Os instrumentos cirúrgicos podem ser esterilizadas utilizando um esterilizador de infravermelhos a uma temperatura de esterilização óptima de 1500 ° F (815,6 ° C). Telémetros pode ser reutilizado, no entanto, antes de o introduzir no animal certificar-se para esterilizar todo o transmissor de acordo com as instruções do fabricante e que a ponta do cateter foi novamente cheio com um gel especial fornecida pelo fabricante.
1. Animais Experimentais
- Obter uma aprovação IACUC para todos os experimentos que serão executadas. Consulta com IACUC institucional é altamente recomendado em relação aos requisitos para uso de analgésicos no pós-operatório após este procedimento.
- Manter os animais em cquartos controlados por limate com uma temperatura ambiente de 21 ° C, 60% de humidade relativa, e um ciclo de luz-escuro de 12 h com livre acesso a comida e água.
Observação: Uma vez que o corpo do ratinho tem para acomodar a sonda de telemetria (approximatively 1 cm de diâmetro x 2 cm de comprimento), é preferível utilizar ratinhos que pesam de 20 g ou mais.
2. Anestesia e Preparação operativo
- Pesar o rato usando uma balança de precisão e registar o peso. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente.
- Colocar o animal na câmara de indução e fechá-lo. Ajustar a taxa de fluxo de oxigênio em 0,5 L / min e definir concentração de isoflurano em 4-5%.
- Quando o mouse perde a consciência, coloque-o em uma placa de aquecimento corporal mantida a 36-37 ° C. Manter a anestesia via nosecone com o conjunto de isoflurano a 2% (manter a taxa de fluxo de 0,5 L / min).
- Preparar as regiões de operação, removendo o cabelo da parte de trás do pescoço e tele aspecto ventral do pescoço, aplicando creme de depilação.
- Tratar o local da incisão com 3 aplicações de paramentação (solução de betadine) alternando com álcool isopropílico 70%.
3. Cirurgia
- Posicione o mouse na posição supina. Verifique se há reflexos comprimindo o pé, e ajustar a anestesia até que não haja resposta. Realizar uma incisão na linha média, aproximadamente, 1 cm abaixo do pescoço do rato com um bisturi. No lado esquerdo do corte criar um espaço subcutâneo, separando cuidadosamente a pele a partir do tecido conjuntivo subjacente.
- Virar o mouse e usar um bisturi para fazer uma incisão na pele de aproximadamente 1,5 cm de lado dorsal deixou para trás a escápula. Criar uma bolsa subcutânea ao longo do flanco do animal grande o suficiente para acomodar o dispositivo. Insira o transmissor no bolso.
- Insira uma pequena pinça hemostática na incisão para trás e manobrá-lo por via subcutânea para a anteriorabertura do pescoço. Usando a pinça hemostática-inserido, suavemente compreender um tubo de polietileno não-tóxico (4 cm de comprimento x 1 mm de diâmetro).
- Puxar a hemostática de volta através do túnel para a incisão lateral na parte de trás até que o tubo se projecta a partir de ambos incisão abdominal e dorsal, libertar o tubo a partir da pinça hemostática. A partir da parte traseira, inserir o sensor de cateter para dentro do tubo de túnel a ponta do cateter de detecção de pressão através do pescoço. Do anterior do pescoço, puxar e retirar o tubo de polietileno e fechar a incisão dorsal utilizando grampos metálicos.
- Separe cuidadosamente as glândulas mandibulares, utilizando aplicadores com ponta de algodão estéril e retirar a glândula mandibular esquerda, utilizando uma estadia gancho elástico. Usando uma pinça curva de ponta fina, localize a artéria carótida ao longo do lado esquerdo da traquéia. Mantenha o local da cirurgia estéril, colocando e garantir uma cortina estéril.
- Cuidadosamente isolar o vaso do tecido circundante e suavemente separar onervo vago (de cor esbranquiçada) que está ao longo da artéria carótida de distância a partir da artéria. Tenha cuidado para não cortar ou danificar o nervo ou artéria.
- Passe três pedaços de não-absorvível 7-0 sutura abaixo da seção artéria carótida isolado. Amarre a sutura craniana para fechar o fluxo de sangue. Puxar o fio de sutura que está mais próxima do esterno para ocluir temporariamente o fluxo de sangue a partir da aorta.
- Faça um nó frouxo usando a sutura do meio. Isto irá ser utilizado para segurar o cateter no vaso. Corte uma pequena incisão na artéria entre o crânio e as suturas esternais usando micro-tesoura.
- Agarre o cateter com uma pinça especial de punção embarcação, tendo o cuidado de não apertar o cateter para evitar a perda de gel da sonda. Gentilmente, pegue a artéria com uma ponta fina curvas pinças pinças, recuperar o cateter, e inseri-lo no vaso através da pequena incisão.
- Apertar o nó de sutura meio ao redor da artéria e gentilmente avançar o gatoheter. Gentilmente liberar a sutura que é proximal ao esterno e continuar a avançar o cateter para a aorta transversal.
- Observar a marca no cateter que dá um índice aproximado de quão longe o cateter tem de ser inserido. Uma vez que o ponto é atingido, apertar ligeiramente inferior tanto a sutura e a parte superior em torno do cateter. O cateter é fixado ao da artéria carótida por nós de sutura.
- Feche a incisão na pele com os não-absorvível 5-0 sutura. Uma vez fechado, selar a incisão com adesivo de tecido.
4. Medidas de recuperação e BP cirúrgicos
- Monitorar animais de perto para o retorno de posturas e comportamentos normais. Durante a 24 horas pós-cirurgia analgesia período de administrar como dirigido por um veterinário equipe.
- Uma vez que os animais se recuperaram (5 - 7 dias após a cirurgia), abrigá-los individualmente em uma gaiola regular de rato colocado em cima do prato receptor de telemetria.
- Vire o tr implantadoansmitters "ON" e "OFF" usando um dispositivo magnético brevemente posicionado perto do animal a partir do lado de fora da gaiola.
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Resultados
Os dados podem ser adquiridos à distância através de um receptor; traços são visualizados na tela do computador para controle de qualidade (Figura 1a). Detalhes como ID animal, pressão diastólica e pressão arterial sistólica também são mostrados (Figura 1b). Arterial BP podem ser gravadas continuamente (24/7), ou por curtos intervalos programados (ou seja, 60 seg aquisição a cada hora). Os dados podem ser automaticamente armazenada num disco ríg...
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Discussão
Implantável radio-telemetria tem melhorado significativamente ao longo da última década; o tamanho da sonda menor faz o implante menos traumática para o animal, a vida da bateria prolongada ajuda a reduzir os custos e frequências Telemeter independentes eliminar crosstalk entre receptores. Telemetria é considerado o método state-of-the-art para a recolha de uma grande variedade de parâmetros fisiológicos de se mover livremente animais sem os artefatos associados com o uso da contenção, a interação humana, ou anestesia q...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH / NHLBI) [Grant no. HL114869] e o apoio da UTHSC ao SM.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de anestesia para pequenos animais | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, EUA | Sistema de anestesia para pequenos animais de baixo fluxo | |
| Aquecedor de almofadas e termômetro de camundongo | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, EUA | permite monitorar a temperatura corporal e o controle homeotérmico em pequenos animais | |
| Microscópio binocular | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, EUA | Corpo binocular KSCXTS-1121 | com haste de suporte e |
| pinça de hemostático | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, EUA | INS750451 | usado para prender vasos sanguíneos ou marcar suturas Pequenos |
| clipes de metal, 7 mm, aço inoxidável | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, EUA | INS750344 | usado para fechamento da pele |
| Solução Betadine | Purdue Products L.P., Stamford, CT, EUA | NDC-67618-150-01 | Solução tópica de iodopovidona a 10% |
| Solução salina normal | Abott Laboratories | 04930-04-10 | necessária para evitar a secagem do tecido. |
| Nair (Loção removedora de pelos) | necessária para remoção de pelos do local da incisão/cirurgia | ||
| Sutura de seda Braide | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, EUA | Tamanho 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Etanol | 2716 | 70% etanol para desinfecção | |
| Tesoura de mola | Ferramenta de Ciências Finas | 15000-10 | para dissecção menor |
| Tesoura (inclinada para o lado) | Ferramenta de Ciências Finas | 14063-011 | No. 3 punho |
| Lâmina | 2976-0 | Pinça nº 10 | |
| (curva) | Ferramenta de Ciências Finas | 11150-10 | para segurar tecido |
| Fórceps (reto) | Ferramenta de Ciências Finas | 11151-10 | para segurar tecido |
| Porta-agulhas | Ferramenta de Ciência Fina | 12002-12 | para sutura |
| Nariz de agulha fina Fórceps | Ferramenta | ||
| Fina Isoflurano | Henry Schein Saúde Animal, Melville, Nova York, EUA | um agente anestésico geral por inalação | |
| Esterilizador Benchmark | Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, EUA | B1000 | esteriliza ferramentas cirúrgicas em 5-10 segundos usando almofadas de gaze de aquecimento infravermelho |
| Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | para uso para limpeza de feridas, preparação, esfregar ou curativo Dispositivo de | |
| Telemetria | Data Sciences International, St. Paul, MN, EUA | DSI-PA-C10 | para registrar a pressão arterial em ratos em movimento livre |
| Sistema receptor de telemetria acoplado a um PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, EUA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Reunião, PA USA | BTPE-90 | |
| Pinça de Canulação de Vaso, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | pinça de canulação de vaso especial |
| Adesivo de tecido | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | usar para fechar feridas menores, muitas vezes eliminando a necessidade de suturas e/ou bandagens |
| Balança de pesagem | Balança de laboratório analítica de precisão | BB300 |
Referências
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- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
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- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H. Models of experimental hypertension in mice. Hypertension. 28 (6), 1064-1069 (1996).
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al. Arterial Pressure Monitoring in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 105-122 (2011).
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- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
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Reimpressões e permissões
