A fibrose sustentada com deposição de proteínas excessivas da matriz extracelular leva à cirrose. O abuso de álcool é uma das principais causas de doença hepática grave. Estabelecemos um modelo de fígado fibrótico de peixe-zebra induzido por etanol para estudar os mecanismos e estratégias de promoção da regeneração de hepatócitos após lesão induzida por álcool.
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Artigo de método
Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fibrose hepática sustentada com continuação do acúmulo de proteína da matriz extracelular (MEC) resulta na perda da competência celular do fígado, levando à cirrose com disfunção hepatocelular. Entre vários insultos hepáticos, o abuso de álcool pode levar a problemas de saúde significativos, incluindo insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular. No entanto, a identidade de fontes celulares endógenas que regeneram hepatócitos em resposta ao álcool não foi devidamente investigada. Além disso, poucos estudos modelaram efetivamente a regeneração de hepatócitos após lesões induzidas por álcool. Recentemente, relatamos o estabelecimento de um modelo de fígado fibrótico induzido por etanol (EtOH) em peixe-zebra no qual células progenitoras hepáticas (HPCs) deram origem a hepatócitos após a perda quase completa de hepatócitos na presença de estímulo fibrogênico. Além disso, por meio de telas químicas usando esse modelo, identificamos várias pequenas moléculas que aumentam a regeneração de hepatócitos. Aqui descrevemos em detalhes os procedimentos para desenvolver um modelo de fígado fibrótico induzido por EtOH e realizar triagens químicas usando este modelo em peixe-zebra. Este protocolo será uma ferramenta crítica para delinear os mecanismos moleculares e celulares de como os hepatócitos se regeneram no fígado fibrótico. Além disso, esses métodos facilitarão a descoberta potencial de novas estratégias terapêuticas para doença hepática crônica in vivo.
Introdução
Apesar da notável capacidade de regeneração de hepatócitos 1, que são o tipo de célula parenquimatosa grande do fígado, insuficiência hepática crónica prejudica essa capacidade, levando a célula progenitora hepática (HPC) regeneração dependente 2.
Lesão hepática crônica é essencialmente derivada de abuso de álcool, o vírus da hepatite C crônica (HCV) 3 e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) 4. Ele conduz a fibrose do fígado sustentada, que está associada com a acumulação de proteínas da matriz extracelular (ECM). Persistindo acumulação ECM distorce a arquitetura hepática intacta atrav....
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Protocolo
Peixe-zebra foram levantadas e criados usando um protocolo padrão que atenda aos critérios dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovado pelo Instituto de Tecnologia da Geórgia Institutional Animal Care e do Comitê Use.
1. Preparação de Soluções
- Prepare 20 L de água de ovo (intercambiável usado com "médio embrião ') para manter peixe-zebra embrionária / larval. Dissolver 1,5 g CaSO 4 e 6 g de sal do mar instantânea oceano em 250 ml de água destilada. Despeje em um garrafão cheio com 20 L de água destilada e agite.
- Prepare 1 L (PTU) solução estoque-2-tioureia 1-fenil (20x). Dissolve-se 0,6 g de pó PTU em 1 L de água destilada....
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Resultados
A Figura 1 mostra o desenvolvimento de um modelo de fígado de fibrose induzida por etanol no peixe-zebra larval. Para otimizar um protocolo para expor larvas do peixe para EtOH, primeiro avaliou a toxicidade EtOH. 2,5 dias pós-fertilização (DPF) larvas foram expostas a concentração de EtOH a 1%, 1,5%, ou 2% durante 24 horas seguido por um tratamento de 24 horas de EtOH / MTZ concomitante. A exposição a 2% de EtOH causaram elevada mortalidade, enquanto quase todas as larv.......
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Discussão
Observamos mediada por HPC regeneração de hepatócitos no fígado recuperando-tratada MTZ EtOH /, sugerindo que, mesmo na presença de uma quantidade substancial de proteínas de ECM, incluindo o tipo I fibrilar colagénio, os HPCs conservam a sua competência para regenerar como hepatócitos. A única MTZ-tratamento não aumentar a deposição das proteínas da MEC significativamente, ao passo que o único tratamento EtOH não induziu activação de HPC 15. Ao utilizar o tratamento combinado de EtOH / MTZ, fomos capazes de .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte por doações do GTEC (2731336 e 1411318), o NIH (K01DK081351), ea NSF (1.354.837) para CHS Agradecemos Alem Giorgis para a leitura crítica do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sulfato de cálcio hemi-hidratado (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| Ácido 1,4-piperazinadietanossulfônico (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)- N,N,N′,N′ < / em>-ácido tetracético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 prova |
| de formaldeído | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazol (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-fenil-2-tioureia (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| éster etílico de ácido 3-amino benzóico (Tricocaína) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Comprimido de solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Amresco | E404 | Dissolva um comprimido com 100 ml de água destilada |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Albumina de soro bovino | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Baixo ponto de fusão agarose | Amresco | BP165 | |
| Selleck Chemicals | L2100 | 10 Estoque mM na Biblioteca DMSO | |
| ActiProbe-1K | Timtec | ActiProbe-1K | 10 Estoque mM em DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolver com DMSO para 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve com DMSO para 10 Anticorpo |
| anti-colágeno I | Abcam | ab23730 | Use a 1:100 para imunocoloração, reage com peixes |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Sondas moleculares | A31573 | Use a 1:200 para imunocoloração Meios de |
| montagem (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Placa de Petri de 100 mm | VWR | 25384-088 | |
| 24 poços placa | VWR | 10062-896 | |
| Fórceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Lâmina de vidro | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Vidro de cobertura | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Filme plástico | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Folha de alumínio | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Microscópio estéreo | Leica | M80 | |
| Microscópio de epifluorescência | Leica | M205 FA | |
| Microscópio confocol | Zeiss | LSM700 |
Referências
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
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Reimpressões e permissões
