Desenvolvimento e Caracterização de In Vitro Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca 2+] i E óxido nítrico Produção

Summary

As células endoteliais primárias da veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas até a confluência dentro de um dispositivo de rede microfluídica. A junção celular endotelial e as distribuições de F-actina foram ilustradas e as mudanças na concentração de cálcio intracelular e na produção de óxido nítrico em resposta ao trifosfato de adenosina (ATP) foram quantificadas em tempo real em níveis celulares individuais.

Abstract

As células endoteliais (ECS) que revestem as paredes dos vasos sanguíneos in vivo estão constantemente expostos a fluir, mas ECs cultivadas são cultivadas em condições estáticas e exibem um fenótipo pró-inflamatória. Embora o desenvolvimento de dispositivos microfluídicos foi abraçado pelos engenheiros mais de duas décadas, as suas aplicações biológicas permanecem limitados. Um modelo in vitro de microvasos mais fisiologicamente relevante validada por aplicações biológicas é importante para avançar no campo e colmatar as lacunas entre in vivo e in vitro. Aqui, apresentamos os procedimentos detalhados para o desenvolvimento da rede microvascular cultivadas utilizando um dispositivo microfluídico com uma capacidade de perfusão de longo prazo. Nós também demonstrar as suas aplicações para medições quantitativas de mudanças induzidas pelo agonista na CE _i e óxido nítrico (NO) ^{[2 +} Ca] em tempo real usando confocal e microscopia de fluorescência convencional. A rede microvascular formadotrabalho com perfusão contínua mostrou cruzamentos bem desenvolvidos entre ECs. distribuição VE-caderina estava mais perto do que a observada em microvasos intactas do que monocamadas CE estaticamente cultivadas. ATP induzida por aumentos transitórios na CE [Ca ^2+] _i e produção de NO foram quantitativamente medido a níveis de células individuais, que validaram a funcionalidade dos microvasos cultivadas. Este dispositivo de microfluidos permite ECs a crescer sob um fluxo fisiologicamente relevante bem controlado, o que faz com que o ambiente de cultura celular mais perto in vivo do que os que, em culturas 2D estáticos convencionais. O projeto de rede de microcanais é altamente versátil, e o processo de fabricação é simples e repetível. O dispositivo pode ser facilmente integrado ao sistema microscópico confocal ou convencional que permite imagens de alta resolução. Mais importante ainda, porque a rede de microvasos em cultura pode ser formada por CEPs primárias humanas, esta abordagem irá servir como uma ferramenta útil para investigar comopatologicamente componentes do sangue alterados a partir de amostras de pacientes afetam ECs humanos e fornecer informações sobre questões clínicas. Ele também pode ser desenvolvido como uma plataforma para o rastreio de drogas.

Introduction

As células endoteliais (ECS) que revestem as paredes dos vasos sanguíneos in vivo estão constantemente expostos a fluir, mas ECs cultivadas são cultivadas em condições estáticas e exibem um fenótipo pró-inflamatório ^1,2. A tecnologia de microfluidos permite que um fluido controlado com precisão através de uma microescala geometricamente limitado (sub-milímetros) canais ^3, o que proporciona a oportunidade para células de cultura, especialmente para células endoteliais vasculares, a crescer sob condições de fluxo desejadas. Estas características tornam as condições de cultura de célula mais perto in vivo do que as culturas de cél....

Protocol

1. fabricação de dispositivos microfluídicos

1. Fabrication fotolitografia padrão de um SU-8 molde 50 Mestre
   1. Limpe o wafer de silício antes de spin-coating. Lavar uma bolacha de silício de 2 polegadas nua com acetona durante 15 minutos, seguido de álcool isopropílico (IPA) durante 15 min. Desidratar a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento a 150 ° C durante 1 h. Após a desidratação, arrefecer a bolacha à temperatura ambiente.
   2. Spin-coat a bolacha de silício com SU-8 fotorresiste. Adicionar 2 ml de SU-8 foto-resistente sobre a bolacha. Rampa, o wafer de 500 rpm a 100 rpm aceleração / s por 10 seg, seguido de 1000 rpm a 300 rpm acelera....

Results

Esta seção mostra alguns dos resultados obtidos com a rede microvascular cultura desenvolvida com este protocolo. O padrão de microcanais é uma rede ramificada de três níveis (Figura 1A). Neste design, a 159 m de largura ramos canal mãe em duas 126 mm canais de largura, e ramos de novo em quatro 100 mm canais filha de largura. Uma simulação numérica 3D foi realizada para estimar as distribuições de tensões de cisalhamento sob a taxa de fluxo de 0,35 mL / min (Fig.......

Discussion

Neste artigo, apresentamos protocolos detalhados para o desenvolvimento da rede microvascular culta, a caracterização das junções CE e citoesqueleto distribuição de F-actina, e as medições quantitativas da CE [Ca ^2+] _i e produção de NO utilizando um dispositivo microfluídico. O dispositivo microfluídico perfusão fornece um modelo in vitro que permite uma simulação perto dos in vivo geometrias microvasculares e condições de fluxo de cisalhamento. Uma vez que a rede de microva.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Acetona	Fisher Scientific	A929
Punção de biópsia	Miltex	33-31 AA
Albumina bovina	MP Biomedicals	810014
Extrato de cérebro bovino (BBE)	Lonza	CC-4098
Lamínula Fisher	Scientific	12-542C
DAF-2 DA	Calbiochem	251505
Dextran	Sigma-Aldrich	31390
Antícorpo Secundário Anti-Cabra IgG (H+L) Tecnologias	Vida	Útil A-11055
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190-250
DRAQ5 (coloração de núcleos)	Cell Signaling Technology	4084
Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Soro Fetal Bovino	Gibco	16000-044
Fibronectina	Gibco	PHE0023
Fluo-4 AM	Life technologies	F-14201
Gelatina de pele suína	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Gentamicina (50 mg/ml)	Gibco	15750-078
Lamínula de vidro	Fisher Scientific	12-548B
Pippetette de vidro Pasteur	VWR	14672
Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suína	Sigma-Aldrich	H3393-10KU
Solução salina tamponada HEPES	Lonza	CC-5024
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)	Lonza	CC-2517
Álcool isopropílico (IPA)	VWR	89125
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	25030-081
			solução de ringer para mamíferos
NaCl (132 mM)	Fisher Scientific	S671-3
KCl (4,6 mM)	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM)	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4 · 7H2O (1.2 mM)	Fisher Scientific	M63-500
Glicose (5.5 mM)	Fisher Scientific	BP350-1
NaHCO3 (5.0 mM)	Fisher Scientific	S233-500
Sal de Hepes (9.1 mM)	Research Organics	6007H
Ácido de Hepes (10.9 mM)	Research Organics	6003H
MCDB 131 Meio de Cultura	Life technologies	10372-019
Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Ciências	15710
Faloidina (coloração F-actina)	Sigma-Aldrich	P1951
Phosphate Buffered Saline	Life technologies	14040-133
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Bisturi	Exel Int	29552
Fita adesiva	3M	34-8711-3070-3
Bolacha de silício	VWR	14672
SU-8 fotorresistente	MicroChem	SU-8 2050 Y111072
Revelador SU-8	Frascos	de cultura de tecidos
	Sigma-Aldrich	Z707503-100EA
Triton X-100	Chemical Book	T6878
Solução de neutralizador de tripsina	Gibco	R-002-100
Solução de tripsina / EDTA (TE)	Gibco	R-001-100
Tubulação	Cole-Parmer	Tubulação microbore de PTFE, 0,012" ID x 0,030" OD
VE-caderina	Santa Cruz Biotechnology	SC-6458
Nome do Equipamento	Empresa	Número de Catálogo	Comentários/Descrição
Biossegurança Capa laminar	NuAire	NU-425 Classe II, Tipo A2
Câmera CCD	Hamamatsu	ORCA
Microscópio confocal	Leica	TCS SL
Dessecador	Bel-Art	F42022
Placa de aquecimento	Wenesco	HP-1212
Incubadora	Forma Scientific	3110
Forno Isotemp	Barnstead	3608-5
Litografia bancada	Karl Suss	MA6 Microscópio óptico de litografia
	Nikon	L200 ND & Diaphod 300
Obturador para a câmera CCD	Sutter Instrument	Lambda 10-2
Limpador de plasma	PVA TePla / Harrick plasma	M4L / PDC-32G
Spin coater	Brewer Science	Cee 200X
Sistema de bomba de seringa	Harvard Apparatus	703005
Nome do Software< / strong>	Empresa	Número de catálogo	Comentários/Descrição
Software CAD	Autodesk	AutoCAD 2015
Software de simulação CFD	COMSOL	COMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Imagens adquirem e analisam para produção de NO	Universal Imaging	Metafluor