Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Summary

As técnicas de limpeza óptica estão revolucionando a forma como os tecidos são visualizados. Neste relatório, descrevemos modificações do protocolo original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-hYdrogel (CLARITY) que produz resultados mais consistentes e menos dispendiosos.

Abstract

Tradicionalmente, a visualização do tecido exige que o tecido de interesse seja seccionado e fotografado em série, sujeitando cada seção de tecido a deformações não lineares únicas, prejudicando drasticamente a capacidade de avaliar a morfologia celular, distribuição e conectividade no sistema nervoso central (SNC). No entanto, as técnicas de limpeza óptica estão mudando a forma como os tecidos são visualizados. Essas abordagens permitem investigar profundamente as preparações de órgãos intactos, fornecendo uma tremenda visão sobre a organização estrutural dos tecidos na saúde e na doença. Técnicas como o Clear-Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) atingem esse objetivo fornecendo uma matriz que se liga a biomoléculas importantes, permitindo que os lipídios espalhados de luz se difundam livremente. A remoção de lipídios, seguida pela correspondência do índice de refração, torna o tecido transparente e prontamente visualizado em 3 dimensões (3D). No entanto, a limpeza eletroforética do tecido (ETC) usada no protocolo CLARITY original pode ser difícil de implementar com sucesso e o uso de uma solução proprietária de correspondência de índice de refração torna caro o uso rotineiro da técnica. Este relatório demonstra a implementação de um protocolo de limpeza óptica simples e barato que combina CLARITY passivo para melhorar a integridade do tecido e 2,2′-tiodietanol (TDE), uma solução de correspondência de índice de refração descrita anteriormente.

Introduction

A capacidade de obter imagens de estruturas neuroanatômicas completas é imensamente valiosa para a compreensão do cérebro na saúde e na doença. Tradicionalmente, a imagem 3D requer seccionamento de tecido para fornecer a resolução axial e visualizar estruturas anatômicas profundas. Essa abordagem pode produzir conjuntos de dados de alta resolução, mas requer técnicas sofisticadas de reconstrução de imagens e é muito trabalhosa. Como resultado, tem sido limitado à imagem de pequenos volumes de tecido^1-3. O seccionamento óptico, por outro lado, é adequado para a criação de imagens 3D de alta resolução de tecidos marcados com fluorescência. Como o seccionamento óptico é inerentemente tridimensional, não requer computação extensiva para produzir um volume de imagem 3D. No entanto, o espalhamento de luz e a opacidade do tecido limitam a profundidade na qual os tecidos podem ser seccionados opticamente. A profundidade da imagem é limitada a cerca de 150 μm na microscopia confocal de varredura a laser e a menos de 800 μm usando microscopia de excitação de dois fótons^4-8.

Para superar essas limitações, várias técnicas de limpeza óptica foram desenvolvidas recentemente e depois refinadas para permitir a imagem microscópica profunda de tecidos intactos. O uso de álcool benzílico e benzoato de benzila (BABB) para tornar transparentes os tecidos fixados foi uma das primeiras abordagens⁹. No entanto, essa abordagem foi limitada pela extinção da fluorescência nas amostras e limpeza incompleta de estruturas altamente mielinizadas¹⁰. Refinamentos dessa técnica, como a imagem 3D de órgãos limpos com solvente (3DISCO), levaram a uma limpeza muito rápida e completa do tecido, mas ainda sofrem de perda rápida de sinais fluorescentes, especialmente a proteína fluorescente amarela (YFP) ¹⁰ . Soluções de limpeza à base de água, como Sca/e¹¹ e SeeDB¹², preservam os sinais fluorescentes, mas não limpam completamente os tecidos altamente mielinizados. Clear , Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) é uma nova tecnologia de limpeza óptica promissora que parece superar as limitações das soluções de limpeza à base de água desenvolvidas anteriormente¹³. Em contraste com outras técnicas de limpeza óptica, o Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-hYdrogel (CLARITY)¹⁴ incorpora o cérebro em uma matriz porosa que fornece integridade estrutural a proteínas, ácidos nucléicos e pequenas moléculas, deixando os lipídios não ligados. Os lipídios são então removidos eletroforeticamente, culminando em um cérebro opticamente limpo que pode ser facilmente visualizado e igualmente facilmente sondado usando técnicas comumente disponíveis.

A limpeza eletroforética do tecido (ETC) é usada para remover lipídios de tecidos embebidos em hidrogel em CLARITY, no entanto, o ETC pode ser difícil de implementar de forma consistente e os tecidos sujeitos a eletroforese podem exibir distorção tecidual, escurecimento, perda de fluorescência e reatividade de anticorpos. A eliminação passiva de lipídios evita essas limitações, mas requer tempos de limpeza aumentados^15-17. A limpeza passiva também permite a limpeza de um grande número de amostras em paralelo, uma vez que não é limitada pelo número de aparelhos ETC disponíveis. A diminuição da concentração de paraformaldeído e a exclusão da bisacrilamida do hidrogel levaram a grandes aumentos na velocidade de clareamento em detrimento de uma maior expansão tecidual¹⁶. Alternativas mais baratas para a solução de correspondência do índice de refração usada na técnica CLARITY original foram desenvolvidas^17-19. O 2,2'-tiodietanol (TDE) é um agente de limpeza cerebral barato e rápido que reverte parte da expansão tecidual que ocorre durante a remoção de lipídios¹⁸. Este relatório incorpora a limpeza passiva do tecido embebido em hidrogel e o uso de TDE como uma solução de correspondência de índice de refração para a técnica CLARITY original para produzir um protocolo altamente reprodutível e barato para a limpeza óptica do sistema nervoso central do camundongo.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC). THY1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato ratos foram usados ​​para estas experiências, mas nenhum camundongos que expressam proteínas fluorescentes pode ser apagada e fotografada com sucesso.

1. Preparação do Tecido

Cuidado: paraformaldeído (PFA) e acrilamida são tóxicos e irritantes. Realizar experimentos utilizando estes reagentes em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).

1. Sacrificar o animal na câmara de eutanásia com ~ 1 ml de isoflurano até que a respiração cessa (~ 2-3 min).
2. Usar uma bomba peristáltica ajustado para ~ 5 ml / min para perfundir intracardial o rato com uma solução de perfusão (Tabela 1), a 4 ° C até que o sangue é limpo a partir de tecidos (5 - 10 min).
3. Alterar o perfusato a solução fixadora (Tabela 1)a 4 ° C até que o pescoço e a cauda endureceram significativamente (5-10 min).
4. Terminar a perfusão e decapitar o animal. Cuidadosamente dissecar o cérebro do crânio removendo primeiro o tecido conjuntivo em torno do crânio e em seguida a remoção de osso a partir da superfície ventral do crânio e o levantamento do cérebro para fora (Figura 1a), tal como descrito em ^20.
   Nota: Dê um cuidado especial para a remoção de osso que circunda os lobos flocculonodular do cerebelo e os bulbos olfatórios.
   1. Dissecar a medula espinal a partir da coluna vertebral através da inserção suavemente a ponta de uma fina, tesoura afiada entre a medula espinal e a coluna vertebral e o corte dos segmentos de coluna vertebral individuais embora, tal como descrito em ^21.
5. Hemisect o cérebro, colocando-o numa matriz de plástico de cérebro de ratinho e de corte ao longo da linha média com uma lâmina de matriz.
6. Adicionar cada hemisfério e da medula espinhal para separar 50 ml banheira de centrífugaES com ~ 40 ml de solução de hidrogel (Tabela 1). A partir deste ponto tampa para a frente os tubos com folha de alumínio para proteger os fluoróforos durante todas as etapas subseqüentes.
7. Incubar o tubo que contém a amostra em hidrogel a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 7 dias.

2. Polimerização

1. Descartar ~ 25 ml de hidrogel, preservando a amostra e ~ 25 ml de hidrogel no tubo de centrifugação.
2. Desoxigena-se a amostra removendo a tampa e a colocação do tubo de centrífuga frasco em exsicador e ligar o frasco a vácuo. Aplicar vácuo durante pelo menos 10 minutos para permitir que os gases dissolvidos a sair da solução e formar bolhas. Agite suavemente para desalojar as bolhas.
3. Substituir o vácuo no frasco exsicador com gás de azoto a 100% durante 2-3 min. Uma vez que a pressão equaliza (uma vez que a parte superior do frasco exsicador pode ser aberto), rapidamente tampa do tubo para evitar a reintrodução de oxigénio.
4. Polímeroize o hidrogel através da colocação do tubo com a amostra num banho de água a 37 ° C durante 3 h até que a polimerização esteja completa. Hidrogel polimerizado irá assumir uma consistência (Figura 1b) do tipo gel. Nota: Uma pequena quantidade de hidrogel não polimerizada no topo é aceitável.
5. Usar uma espátula para remover a amostra polimerizada a partir do tubo de centrifugação, depois cortar o excesso de hidrogel a partir da amostra.
6. Remover o hidrogel restante, colocando a amostra num fiapos e limpar esfregando suavemente e rolando o tecido nele, deixando para trás apenas uma fina camada de hidrogel polimerizado na amostra.

3. Lipid Remoção

Nota: tecido limpou-Lipid é frágil, punho com cuidado. Use um filtro de células durante a drenagem do tubo para evitar a perda de amostra. Além disso, a amostra irá inchar durante o processo de limpeza, no entanto, o inchaço pode ser invertida durante o processo de harmonização do índice de refracção.

Cuidado: SodiUM sulfato de dodecilo (SDS) e ácido bórico são irritantes. Realizar experimentos utilizando-os em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).

1. Transferir a amostra polimerizada para um tubo de centrífuga de 50 ml limpos e adicionar 45 ml de tampão de compensação (Tabela 1). Incubar a 45 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). Alterar o tampão por dia durante um período inicial de 7 dias por vazamento fora do buffer de compensação usado para resíduos químicos e adicionando ~ 45 ml de tampão de compensação fresco. Mantenha os tubos de centrífuga contendo as amostras cobertas de folha de alumínio para proteger os fluoróforos.
2. Após os primeiros 7 dias, incubar a amostra a C e troca de compensação tampão 40 ° a cada 2 - 3 dias. Continue compensação até que todos os lipídios são dissolvidos e tecido atinge a transparência (Figura 1c). Isto vai ser de 4 - 6 semanas para um hemisfério cerebral do rato e 2 - 4 semanas para uma medula espinal.
3. Uma vez que o tecido é limpo, transferiramostra para um novo tubo de centrífuga de 50 ml e lava-se 4 vezes em PBST (Tabela 1), a 40 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 24 horas para remover o SDS residual.

4. Coloração Molecular

Cuidado: 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) é um irritante e quaisquer experiências utilizando deve ser realizada em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).

1. Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 15 ml limpos e encher-se com 1 ug / ml de DAPI em PBST 1x, pH 7,5. Incubar à temperatura ambiente (TA) durante 24 horas. Mantenha os tubos de centrífuga contendo as amostras cobertas de folha de alumínio para proteger os fluoróforos.
2. Lavar 3 vezes em PBST à temperatura ambiente durante pelo menos 6 h / lavagem.

5. Índice de Refração Matching

Cuidado: 2,2? Tiodietanol (TDE) é um irritante e quaisquer experimentos utilizando-should ser realizada em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).

1. Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 15 ml limpos e encher-se com 30% (v / v) em PBS 1x TDE, pH 7,5. Incubar a 40 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 24 h.
2. Troca TDE 30% com 63% (v / v) em PBS 1x TDE, pH 7,5. Incubar a 40 ° C com agitação suave durante 24 horas.
   Nota: A amostra vai encolher volta ao tamanho de aproximadamente originais.
3. Sobre uma superfície plana, limpo rolar um pedaço de adesivo reutilizável para um cilindro com diâmetro uniforme apenas ligeiramente maior do que a espessura da amostra.
4. Colocar o cilindro de adesivo reutilizável em um círculo aberto (~ 25 mm de diâmetro interno com uma pequena abertura na parte superior) em um 40 mm prato de vidro de fundo. Se correcções devem ser feitas, remover o cilindro a partir do vidro e cortado com uma lâmina de barbear.
5. Utilizar uma ponteira P1000 pipeta para criar um selo entre o adesivo reutilizável e vidro porrolando-o em torno do rebordo exterior do cilindro.
6. Lugar ~ 100 mL de 63% TDE para o prato de vidro e se espalhou para cobrir a superfície de vidro dentro do círculo de adesivo reutilizável.
7. Usando uma espátula, coloque cuidadosamente a amostra no meio do círculo, tomando cuidado para não formar bolhas.
8. Pipeta mais 100 ul de 63% TDE diretamente sobre a amostra, em seguida, coloque imediatamente a 40 milímetros circular tampa de vidro sobre o adesivo reutilizável.
9. Usando o indicador, médio e anelar de ambas as mãos, pressione cuidadosamente ao redor do perímetro do círculo até que a tampa de vidro fez contato com a amostra.
10. Lentamente trazer o fundo da placa de vidro para uma posição vertical de descanso de encontro a uma superfície, em seguida, adicionar 63% TDE com uma pipeta até que a solução atinge a pequena abertura na parte superior. Usar um cotão livre limpe para secar a ponta da pipeta de modo a que a solução não goteje sobre o vidro. Para evitar bolhas na câmara, não esvaziar a pipeta de todo o caminho.
11. Paraa pequena abertura, adicionar de elastómero de silicone para delimitar o círculo e criar uma câmara fechada. Espere 5 minutos para secar antes de imagem.

6. Microscopia

Cuidado: Os lasers usados ​​em confocal, iluminação plano único e microscopia folha de luz são muito poderoso e pode causar cegueira. Quaisquer experiências utilizando lasers deve ser realizada após o treinamento extenso e com grande cuidado e proteção para os olhos adequada.

1. Coloque a câmara de imagem com a amostra dentro no palco de um microscópio de varredura a laser confocal.
2. Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais). Para ligar o laser de argônio de excitação, clique na guia de configuração na parte superior do programa, em seguida, no ícone do laser. Verifique a caixa ao lado de argônio para energizar o laser e mover a escala deslizante para 30%. Observar o ponteiro lentamente aquecer para a posição seleccionada.
   1. Retornar à guia adquirir no topo. Na caixa grande "Configurações caminho do feixe &# 34; ir para a carga / salvar caixa de configuração e selecione o menu drop-down para selecionar um canal de comprimento de onda adequado para a imagem YFP (527 nm).
3. Selecione objectivos adequados para imagiologia por localizar a hiperligação vermelho escrito "objetivo: objeto atual" abaixo da caixa de configurações do canal. Ao clicar na guia abre todos os objetivos disponíveis e uma selecção irá girar automaticamente a torre.
   1. Utilização objectivos (por ex., 10X), com um raio grande de trabalho (maior do que a espessura do tecido a ser visualizado, por exemplo: 11 mm) e uma grande abertura numérica (por ex., 0,3) para maximizar no plano resolução de imagem e minimizar espessura de corte óptico.
4. Na coluna à esquerda da menus drop-down, abra o "XY: resolução" janela para definir matriz de aquisição, chamado de "formato", a 1.024 x 1.024 ou um valor adequado para o limite de resolução lateral do objectivo. Defina o fator de zoom mais baixo possível (por exemplo., 10,7).
5. Na mesma janela, jogo 8 média de linha e um quadro de parâmetros médios por cair para baixo os menus marcados individualmente em conformidade. Use valores grandes para uma alta relação sinal-ruído e valores pequenos para a aquisição rápida.
   Nota: 8 médias de linha e uma média quadro vai adquirir imagens de um hemisfério do cérebro do rato de alta qualidade em aproximadamente 4 horas.
6. Localize a amostra usando os controles do estágio. Uma vez que um campo representativo é visível, definir o ganho e offset.
   Nota: O ganho e offset variará substancialmente com base no tipo de tecido, fluoróforos, e / ou característica anatômica a ser trabalhada. Para YFP, definir valores de 760-780 para o ganho e de -1,0 para -1,5 para o deslocamento.
7. Selecione "varredura telha" e selecione os limites da região de interesse. Definir os limites superior e inferior do z-stack a ser adquirido. Definir a espessura da secção óptica baseado em secção de limite de resolução óptica do objectivo.
   Nota: Um objetivo dolimite de resolução óptica secção é definida principalmente pela sua abertura numérica. A maioria dos softwares de controle microscópio irá calcular automaticamente um valor apropriado para o objetivo que está sendo usado. Para uma objectiva 10X com uma abertura numérica de 0,3 que seria de aproximadamente 11 uM.
8. Iniciar a aquisição.
   Nota: Isso pode demorar vários horas.
9. Coletar imagens de alta resolução usando objectivos maior ampliação de regiões específicas de interesse.

Results

Visualizando a organização estrutural do cérebro é fundamental para a compreensão de como morfologia e conectividade afetar a função cerebral na saúde e na doença. técnicas de limpeza ópticas tornam possível a populações de células de imagem em 3D em tecidos intactos, o que nos permite estudar a morfologia e conectividade coesa.

Os ratinhos que expressam proteínas fluorescentes impulsionado por promotores específicos para sub-...

Discussion

clearing passiva de tecidos de hidrogel incorporado (clareza passiva) é um método simples e barato para limpar grandes pedaços de tecido. Esta abordagem não requer equipamento específico e pode ser facilmente realizada num agitador com temperatura controlada. Durante o período de algumas semanas, mesmo grandes, tecidos altamente mielinizados, como um cérebro inteiro ou medula espinhal, vai se tornar transparente e adequado para microscopia. Embora este relatório concentrou-se a limpeza de tecidos do SNC, Clareza passiva...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Fisher	BP399-1	tampões
32% paraformaldeído (PFA)	Ciências de Microscopia Eletrônica	15714-5	perfusão e hidrogel
2,2'-tiodietanol (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	solução de correspondência de índice de refração
40% acrilamida	Bio-Rad	161-0140	hidrogel
2% bis-acrilamida	Bio-Rad	161-0142	hidrogel
VA-044 iniciador	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	hidrogel
ácido bórico	Sigma-Aldrich	B7901	tampão de limpeza
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Fisher	BP166-5	tampão de limpeza
Hidróxido de sódio	Fisher	55255-1	tampões
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	52002-100G	conservante
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	tampões
Heparina	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	perfusão
Nitrato de sódio	Fisher	BP360-500	perfusão
DAPI	Sondas Moleculares	D1306	coloração nuclear
99,9% isoflurano	Phoenix	57319-559-06	anestésico
Ácido clolórico	Fisher	A1445-500	tampões
Prato de fundo de vidro	Willco	HBSB-5040	Pratos Willco
Adesivo reutilizável	Bostick	371351	Blu-Tack
Elastômero de silicone	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
Toalhete sem fiapos	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Matriz cerebral de rato	Roboz	SA-2175	seccionamento de tecido
Lâminas matriciais	Roboz	RS-9887	seccionamento de tecido
Bomba peristáltica	Cole-Parmer	77122-24	pefusion
Microscópio confocal de varredura a laser	Microscopia	Leica	SP5
Software de imagem	Leica	LAS AF	microscopia