Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Resumo

As técnicas de limpeza óptica estão revolucionando a forma como os tecidos são visualizados. Neste relatório, descrevemos modificações do protocolo original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-hYdrogel (CLARITY) que produz resultados mais consistentes e menos dispendiosos.

Resumo

Tradicionalmente, a visualização do tecido exige que o tecido de interesse seja seccionado e fotografado em série, sujeitando cada seção de tecido a deformações não lineares únicas, prejudicando drasticamente a capacidade de avaliar a morfologia celular, distribuição e conectividade no sistema nervoso central (SNC). No entanto, as técnicas de limpeza óptica estão mudando a forma como os tecidos são visualizados. Essas abordagens permitem investigar profundamente as preparações de órgãos intactos, fornecendo uma tremenda visão sobre a organização estrutural dos tecidos na saúde e na doença. Técnicas como o Clear-Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) atingem esse objetivo fornecendo uma matriz que se liga a biomoléculas importantes, permitindo que os lipídios espalhados de luz se difundam livremente. A remoção de lipídios, seguida pela correspondência do índice de refração, torna o tecido transparente e prontamente visualizado em 3 dimensões (3D). No entanto, a limpeza eletroforética do tecido (ETC) usada no protocolo CLARITY original pode ser difícil de implementar com sucesso e o uso de uma solução proprietária de correspondência de índice de refração torna caro o uso rotineiro da técnica. Este relatório demonstra a implementação de um protocolo de limpeza óptica simples e barato que combina CLARITY passivo para melhorar a integridade do tecido e 2,2′-tiodietanol (TDE), uma solução de correspondência de índice de refração descrita anteriormente.

Introdução

A capacidade de obter imagens de estruturas neuroanatômicas completas é imensamente valiosa para a compreensão do cérebro na saúde e na doença. Tradicionalmente, a imagem 3D requer seccionamento de tecido para fornecer a resolução axial e visualizar estruturas anatômicas profundas. Essa abordagem pode produzir conjuntos de dados de alta resolução, mas requer técnicas sofisticadas de reconstrução de imagens e é muito trabalhosa. Como resultado, tem sido limitado à imagem de pequenos volumes de tecido^1-3. O seccionamento óptico, por outro lado, é adequado para a criação de imagens 3D de alta resolução de tecidos marcados com fluorescência. Como o seccionament....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC). THY1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato ratos foram usados ​​para estas experiências, mas nenhum camundongos que expressam proteínas fluorescentes pode ser apagada e fotografada com sucesso.

1. Preparação do Tecido

Cuidado: paraformaldeído (PFA) e acrilamida são tóxicos e irritantes. Realizar experimentos utilizando estes reagentes em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).

1. Sacrificar o animal na câmara de eutanásia com ~ ....

Resultados

Visualizando a organização estrutural do cérebro é fundamental para a compreensão de como morfologia e conectividade afetar a função cerebral na saúde e na doença. técnicas de limpeza ópticas tornam possível a populações de células de imagem em 3D em tecidos intactos, o que nos permite estudar a morfologia e conectividade coesa.

Os ratinhos que expressam proteínas fluorescentes impulsionado por promotores específicos para sub-.......

Discussão

clearing passiva de tecidos de hidrogel incorporado (clareza passiva) é um método simples e barato para limpar grandes pedaços de tecido. Esta abordagem não requer equipamento específico e pode ser facilmente realizada num agitador com temperatura controlada. Durante o período de algumas semanas, mesmo grandes, tecidos altamente mielinizados, como um cérebro inteiro ou medula espinhal, vai se tornar transparente e adequado para microscopia. Embora este relatório concentrou-se a limpeza de tecidos do SNC, Clareza passiva.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Fisher	BP399-1	tampões
32% paraformaldeído (PFA)	Ciências de Microscopia Eletrônica	15714-5	perfusão e hidrogel
2,2'-tiodietanol (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	solução de correspondência de índice de refração
40% acrilamida	Bio-Rad	161-0140	hidrogel
2% bis-acrilamida	Bio-Rad	161-0142	hidrogel
VA-044 iniciador	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	hidrogel
ácido bórico	Sigma-Aldrich	B7901	tampão de limpeza
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Fisher	BP166-5	tampão de limpeza
Hidróxido de sódio	Fisher	55255-1	tampões
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	52002-100G	conservante
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	tampões
Heparina	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	perfusão
Nitrato de sódio	Fisher	BP360-500	perfusão
DAPI	Sondas Moleculares	D1306	coloração nuclear
99,9% isoflurano	Phoenix	57319-559-06	anestésico
Ácido clolórico	Fisher	A1445-500	tampões
Prato de fundo de vidro	Willco	HBSB-5040	Pratos Willco
Adesivo reutilizável	Bostick	371351	Blu-Tack
Elastômero de silicone	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
Toalhete sem fiapos	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Matriz cerebral de rato	Roboz	SA-2175	seccionamento de tecido
Lâminas matriciais	Roboz	RS-9887	seccionamento de tecido
Bomba peristáltica	Cole-Parmer	77122-24	pefusion
Microscópio confocal de varredura a laser	Microscopia	Leica	SP5
Software de imagem	Leica	LAS AF	microscopia