Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.
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Artigo de método
Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga
Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso de xenoenxertos derivados de pacientes para modelar cânceres forneceu informações importantes sobre a biologia do câncer e a capacidade de resposta a medicamentos. No entanto, eles são demorados, caros e trabalhosos. Para superar esses obstáculos, muitos grupos de pesquisa recorreram a culturas esferóides de células cancerígenas. Embora úteis, os esferoides ou agregados tumorais não replicam as interações célula-matriz encontradas in vivo. Como tal, as abordagens de cultura tridimensional (3D) utilizando um andaime de matriz extracelular fornecem um sistema de modelo mais realista para investigação. A partir de xenoenxertos subcutâneos ou intracranianos, o tecido tumoral é dissociado em uma única suspensão celular semelhante às neuroesferas de células-tronco cancerígenas. Essas células são então incorporadas a uma matriz extracelular derivada de humanos, biogel humano 3D, para gerar um grande número de microtumores. Curiosamente, os microtumores podem ser cultivados por cerca de um mês com alta viabilidade e podem ser usados para testes de resposta a medicamentos usando ensaios de citotoxicidade padrão, como brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e imagens de células vivas usando Calcein-AM. Além disso, eles podem ser analisados por imuno-histoquímica ou colhidos para perfil molecular, como perfil cinômico de alto rendimento baseado em matriz, que também é detalhado aqui. Os microtumores 3D, portanto, representam um sistema modelo versátil de alto rendimento que pode replicar mais de perto a biologia tumoral in vivo do que as abordagens tradicionais.
Introdução
Os tumores cerebrais primários mais comuns intracranianas malignos são astrocitomas grau III e grau IV glioblastoma multiforme (glioblastoma ou GBM). Estes tumores oferecer prognósticos pobres com sobrevida de um ano médio entre 12 - 15 meses, com terapias atuais para GBM no 1-3 EUA. multimodalidade terapias incluem cirurgia, radiação, e quimioterapia, incluindo temozolomida (TMZ) e agentes alvo-quinase. sinalização cinase é frequentemente desreguladas na MBG, incluindo subconjuntos de tumores com amplificação ou mutações de activação do Factor de Crescimento Epidérmico receptor (EGFR), os aumentos no Crescimento Derivado de Plaquetas do Receptor ....
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Protocolo
NOTA: Todas as avaliações de terapia de xenotransplante foram feitas usando um modelo de tumor ortotópico de glioblastoma em um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal.
1. Isolamento de células derivadas de GBM xenoenxertos de doentes
- Preparação dos Reagentes
- Re-constituem colagenase-I em água estéril até uma concentração de 5 mg / ml e de filtro estéril. Armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 ° C (concentração final é de 50 ug / ml em 100 ml de solução enzimática).
- Dissolve-se 100 ug Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) em 2 mL estéril tamponada com fosfato salino....
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Resultados
Mostrámos que o sistema de cultura 3D Biogel suporta o crescimento a longo-termo e função de vários tipos de células. Neste projeto colaborativo, xenolines GBM derivado do paciente (PDX) são utilizados para a produção de centenas de microtumors. As células dissociadas (3 x 10 5) ou neuroesferas (40 - 50) foram incluídos em grânulos Biogel (2 mM) e após a gelificação rápida que são cultivadas num biorreactor de costume NB-media preenchido. foram determinados a viabilidade celul.......
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Discussão
As etapas críticas no âmbito do protocolo predominantemente relacionados com microtumor geração, bem como a administração de drogas e de manutenção. Porque as contas microtumor são frágeis e facilmente rasgado, extremo cuidado é necessário em ambas as fases de desenvolvimento de um ensaio e manutenção. Se ocorrer um erro durante qualquer um destes processos, a interpretação experimental pode ser comprometida, causando extensão ou repetição desnecessária dos experimentos ou mesmo exclusão de dados.
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Divulgações
R.S. e R.S.S. são funcionários da Vivo Biosciences. J.C.A. é parcialmente financiado pelo UAB Kinome Core.
Agradecimentos
Suportado pelo NIH conceder R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), prêmio Tumor SPORE Brain (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) e contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00.026).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Colagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Tripsina EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Suplemento | Life Technologies | 17502-048 | 1x concentração final |
| Suplemento B-27 sem Vitamina A | Life Technologies | 12587-010 | 1x concentração final |
| FGF humano recombinante-basic | Life Technologies | PHG0266 | concentração final |
| de 10 ng/mlHumano recombinante | EGF Life Technologies | PGH0315 | concentração final de 10 ng/ml |
| L-Glutamina | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | concentração final de 2 mM |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µ g/ml de concentração final |
| Penicilina Estreptomicina | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicilina G, 100 µ g/ml Concentração final de estreptomicina |
| Gentamicina | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml concentração final |
| MTT | Life Technologies | M6494 | preparado para 5 mg/ml em PBS e filtrado estéril, 1 mg/ml em poço |
| SDS | Fisher | BP166 | para tampão de lise MTT, preparado para 10% em 0,01 M HCl, 5% em HCl de poço |
| Fisher | A144SI-212 | para tampão de lise MTT, preparado para 0,01 M com SDS, 5 mM em poço | |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM em estoque DMSO, 2 µ M em solução de coloração PBS, 1 µ M em |
| bem Halt' s Coquetel de inibidores de proteína fosfatase | Pierce ThermoScientific | 78420 | Proporção 1:100 em MPER |
| Inibidor de Protease da Halt's Protein | Pierce ThermoScientific | 87786 | Proporção 1:100 em MPER |
| Reagente de Extração de Proteína de Mamíferos (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | para dissolução de calceína AM e compostos |
| salina tamponada com fosfato sem Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluído a 1x com água ultrapura MiliQ e filtrado estéril (para cultura de células) |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluído a 1x com água ultrapura MiliQ (para lavagem pré-fixação) |
| Formalina tamponada neutra a 10% Protocolo | 032-060 | ||
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| Alta densidade Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Inibidor de proteína fosfatase de Halt | Pierce | 78420 | |
| Inibidor de protease de proteína de Halt | Pierce | 87786 | |
| Reagente de extração de proteína de mamífero (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Proteína tirosina quinase (PTK) Array Chip de perfil | PamGene | 86312 | |
| Tampão PTK quinase | PamGene | 36000 | 300 µ l 10x estoque de buffer PK em 2.7 ml dH2O, número de catálogo do kit de reagentes PTK |
| ATP | PamGene | 36000 | número de catálogo para kit de reagentes PTK |
| PY20- anticorpo conjugado com FITC | PamGene | 36000 | número de catálogo para kit de reagentes PTK |
| Aditivo PTK | PamGene | 32114 | |
| Tubo PTK-MM1 (10x BSA) | PamGene | 36000 | número de catálogo para kit |
| de reagentes PTKChip de perfil de matriz de serina/treonina quinase (STK) | PamGene | 87102 | |
| Tampão de quinase STK | PamGene | 32205 | para kit de reagentes STK |
| Mistura de anticorpos primários STK (tubo DMAB) | PamGene | 32205 | para kit de reagentes STK |
| Anticorpo secundário conjugado com FITC | PamGene | 32203 | |
| Tubo STK-MM1 (100x BSA) | PamGene | 32205 | número de catálogo para kit de reagentes STK |
| Tampão de anticorpos STK | PamGene | 32205 | número de catálogo para kit de reagentes STK |
| Equipamento | |||
| #11 Lâminas, estéreis | Fisher | 3120030 | |
| #3 cabos de bisturi, estéreis | Fisher | 08-913-5 | |
| placas de Petri de vidro de 100 mm | Fisher | 08-748D | |
| Pinça semicurvada | Fisher | 12-460-318 | |
| Frasco de tripsinização | Fisher | 10-042-12B | |
| Agitador magnético | Fisher | 14-490-200 | |
| Barra de agitação de 3/4" | Fisher | 14-512-125 | |
| Filtro de célula B-D | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Tubo de centrífuga | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 software de análise kinômica | PamGene | ||
| Evolve | PamGene | ||
| UpKin App (previsão de quinase upstream) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Sistema de Cultura de Células Rotativas (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | com HARV descartável de 10 ml |
Referências
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults.....
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Reimpressões e permissões
