Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.
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Artigo de método
Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga
Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso de xenoenxertos derivados de pacientes para modelar cânceres forneceu informações importantes sobre a biologia do câncer e a capacidade de resposta a medicamentos. No entanto, eles são demorados, caros e trabalhosos. Para superar esses obstáculos, muitos grupos de pesquisa recorreram a culturas esferóides de células cancerígenas. Embora úteis, os esferoides ou agregados tumorais não replicam as interações célula-matriz encontradas in vivo. Como tal, as abordagens de cultura tridimensional (3D) utilizando um andaime de matriz extracelular fornecem um sistema de modelo mais realista para investigação. A partir de xenoenxertos subcutâneos ou intracranianos, o tecido tumoral é dissociado em uma única suspensão celular semelhante às neuroesferas de células-tronco cancerígenas. Essas células são então incorporadas a uma matriz extracelular derivada de humanos, biogel humano 3D, para gerar um grande número de microtumores. Curiosamente, os microtumores podem ser cultivados por cerca de um mês com alta viabilidade e podem ser usados para testes de resposta a medicamentos usando ensaios de citotoxicidade padrão, como brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e imagens de células vivas usando Calcein-AM. Além disso, eles podem ser analisados por imuno-histoquímica ou colhidos para perfil molecular, como perfil cinômico de alto rendimento baseado em matriz, que também é detalhado aqui. Os microtumores 3D, portanto, representam um sistema modelo versátil de alto rendimento que pode replicar mais de perto a biologia tumoral in vivo do que as abordagens tradicionais.
Introdução
Os tumores cerebrais primários mais comuns intracranianas malignos são astrocitomas grau III e grau IV glioblastoma multiforme (glioblastoma ou GBM). Estes tumores oferecer prognósticos pobres com sobrevida de um ano médio entre 12 - 15 meses, com terapias atuais para GBM no 1-3 EUA. multimodalidade terapias incluem cirurgia, radiação, e quimioterapia, incluindo temozolomida (TMZ) e agentes alvo-quinase. sinalização cinase é frequentemente desreguladas na MBG, incluindo subconjuntos de tumores com amplificação ou mutações de activação do Factor de Crescimento Epidérmico receptor (EGFR), os aumentos no Crescimento Derivado de Plaquetas do Receptor do Factor (PDGFR) de sinalização, o aumento da fosfatidil-inositol-3-quinase (PI3K) e tumor angiogénico apoio sinalização através do factor de Crescimento endotelial Vascular receptor (VEGFR), bem como outras vias de cinase orientada 4-6. Current in vitro e em modelos in vivo freqüentemente perdem estas alterações representativos 7. Além disso, a caracterização genética não ofereceu os benefícios esperados que podem refletir o fato de que as alterações genéticas e epigenéticas nem sempre prever as mudanças no nível de atividade da proteína, onde a maioria das quinase agentes visando atuar diretamente, e onde terapias com outros mecanismos de ação pode agir indiretamente.
A linha de células imortalizadas tradicional que pode ser várias passagens ad infinitum tem sido o padrão para testes de drogas devido à sua facilidade de manutenção e reprodutibilidade. No entanto, este modelo sofre de um ambiente de crescimento alta de nutrientes (e artificial) que seleciona para as células que diferem muito do tumor original crescendo rapidamente. Como tal, tem havido um interesse considerável no desenvolvimento de sistemas modelo mais realistas que reflectem um sistema biológico do tumor mais complexo como está presente no paciente. xenoenxertos de tumor desenvolvido directamente a partir de um tumor primário crescido em ratos ( "xenoline," xenoenxerto derivado do paciente ou PDX) provide um sistema modelo mais reflexivo, particularmente no contexto de cancro terapêutica, como eles são sentidos para prever de forma mais confiável de sucesso clínico. 8 Apesar da biologia mais reflexivo, esses modelos são caros e são difíceis de estabelecer e manter. Além disso, eles não são passíveis de estudos de alta produtividade. A necessidade de melhor desenvolver modelos biológicos que refletem com mais precisão as alterações moleculares nos tumores primários, e ao perfil e testar esses modelos utilizando medidas diretas de atividade quinase, não substituto marcadores genéticos, é claro.
É bem reconhecido que ao contrário de duas dimensões (2D) culturas em monocamada, 3D ou modelos de ensaio multicelulares pode fornecer mais fisiologicamente relevantes terminais 9-11. cultura 3D abordagens comuns envolvem microve�ulos revestido de matriz e formação esferóide celular. esferóides de tumor pode ser gerado através da agregação celular utilizando balão giratório, placa pHEMA e pendurando técnicas de gota. Limitações para tabordagens stas incluem: incapacidade de algumas células para formar esferóides estáveis, a variabilidade no crescimento e desafios com mistura de tipos celulares. Em alternativa, muitos sintético (hidrogel, polímero) e animal derivada de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz de sarcomas de rato, o colagénio de bovino) matrizes têm sido desenvolvidos para a cultura 3D estuda 12-14. Matriz de rato EHS é extensivamente utilizado, mas conhecido para promover o crescimento e a diferenciação celular in vitro e in vivo 15.
A fim de replicar a biologia do tumor 3D, um sistema de biomatriz humano foi desenvolvido pelo Dr. Raj Singh et ai. 16. O biogel humana livre de fator natural, permite o crescimento de cultura de andaimes 3D (esferas, discos), que suportam o cultivo de longo prazo de vários tipos de células. Uma série de projetos 3D cultura Biogel humana são estabelecidos para estudar o crescimento do tumor, aderência, angiogênese e invasão propriedades. Vantagens e propriedades de Biogel humano quando comparado com comumgéis EHS rato estão resumidas na Tabela 1 e Tabela 2.
| Fonte: | Âmnions Humano (tecido em pool) livre de patógenos, o IRB-exempt / aprovado |
| Natureza ECM: | Não desnaturada Biogel (GLP-produção) |
| Chave componentes: | Col-I (38%), a laminina (22%), Cl-IV (20%), COL-III (7%), entactina HSPG & (<3%) |
| -GF livre: | Indetectável EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogênico, não-tóxico) |
Tabela 1: Propriedades de Biogel Humano, em comparação com comuns EHS Gel.
| Biogel humana | géis EHS |
| matriz natural do ser humano | matriz do mouse reconstituído |
| crescimento e diferenciação celular controlada | Pode promover o crescimento e diferenciação celular |
| a expressão do gene fisiológica | a expressão do gene variável |
| 3D tecido-como modelo de cultura | modelo de cultura à base de chapa |
Tabela 2: Vantagens de Biogel Humano, em comparação com comuns EHS Gel.
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Protocolo
NOTA: Todas as avaliações de terapia de xenotransplante foram feitas usando um modelo de tumor ortotópico de glioblastoma em um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal.
1. Isolamento de células derivadas de GBM xenoenxertos de doentes
- Preparação dos Reagentes
- Re-constituem colagenase-I em água estéril até uma concentração de 5 mg / ml e de filtro estéril. Armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 ° C (concentração final é de 50 ug / ml em 100 ml de solução enzimática).
- Dissolve-se 100 ug Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) em 2 mL estéril tamponada com fosfato salino (PBS). Armazenar em 100 ul (5 ug / 100 ul) alíquotas a -20 ° C para uma concentração final de 10 ng / ml.
- Dissolve-se 100 ug de FGF-β em 2 ml de PBS estéril. Armazenar em 100 ul (5 ug / 100 ul) alíquotas a -20 ° C para uma concentração final de 10 ng / ml.
- Adicionar a garrafa seguinte a um 500 ml de Neurobasal MedIA (NBM) para preparar completa NBM: 10 ml de B-27 sem suplemento de vitamina A, 5 ml de suplemento de N2, com 100 ul de EGF, 100 ul de factor de crescimento fibroblástico (FGF) -Basic, 5 mL de anfotericina B, 0,5 ml de gentamicina, 5 ml L-glutamina.
- Preparar a solução de enzima fresca através da combinação de: 98,5 ml de PBS, 1 ml de colagenase-1, 0,5 ml de 10x de tripsina / EDTA e esterilizar por filtração através de filtro de poro de 0,22 um.
- Preparar ou obter um pequeno volume estéril de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) / meio de cultura celular F12 com soro fetal bovino a 7% (FBS) e 1x PBS sem cálcio ou magnésio.
- Desagregação do tumor
NOTA: rato nu / nu atímicos previamente injectados com células de tumor no flanco direito e deixou-se a partir de uma massa de tumor palpável é necessário para este procedimento. Nos exemplos mostrados aqui, usamos xenotransplante de células GBM derivado do paciente, JX10 e JX12 17.- Esterilizar área de trabalho por pulverização clorexidina 2% e configurar sagacidade área de trabalhoinstrumentos necessários h / fontes incluindo mandril descartável, fórceps, bisturi, uma placa de Petri de vidro, a solução de enzima, PBS, e clorexidina (Ver Figura 2a).
- Euthanize rato / camundongos portadores de um tumor no flanco. Alvo para uma taxa de deslocamento / min 20% de CO 2 utilizando 30% de CO 2. Após o rato mostra paragem respiratória, manter o fluxo de CO 2 durante cerca de 1 min (normalmente de 3 minutos no total). Os ratos são removidos da câmara e deslocamento cervical é realizada como uma confirmação eutanásia secundário. Pulverizar o animal com 3% de clorexidina para higienizar a pele.
- Enquanto segura o mouse constante, fazer incisão na pele semi-circular ~ 1,5 cm de massa tumoral (flanco implantado tumor) utilizando um bisturi estéril descartável com lâmina # 11 começando cranial à massa tumoral e incisão em direção à barriga do rato e ao redor à extremidade caudal.
- Reflita pele sobre a massa tumoral usando os dedos com tração suave na extremidade caudal da incisão e, em seguida, empurrar na pelesuperfície para elevar tumor ter melhor acesso sem tocar o tumor (ver Figura 2B).
- Use dissecção romba com uma pinça para gentilmente massa tumoral livre da parede peritoneal e da pele (ver Figura 2C).
- massa tumoral de transferência com uma pinça para placa de Petri de vidro estéril (não utilize pratos de plástico para evitar a quebra durante a picagem) e descartar corretamente carcaça e colocar estes instrumentos de lado.
- Use novo conjunto de instrumentos esterilizados (bisturi com # 11 lâmina, pinça semi-curvo) para debridar tecido tumoral de tecido necrosado e anfitrião membranoso tumor cobrindo tecido conjuntivo.
- Coloque solução de 15 ml de enzima em uma ventilada trypsinizing-frasco estéril com barra de agitação e começar a agitar lentamente no capô.
- Num prato de Petri de vidro esterilizada, lavar tumores colhidos 3 - 5 vezes com PBS estéril para remover o excesso de sangue (possa derramar ou utilizar a seringa para lavá-los com o PBS). Incline ligeiramente prato e pipeta ou aspirar o material de lavagem. mince finely usando duas lâminas de bisturi # 11 (veja a Figura 2D).
- Adicionar 14 ml de solução de enzima para tumor picada e pipeta suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes. Transfira a mistura para ventilada trypsinizing balão e agitar lentamente durante 20 min. Prepare 5 tubos cónicos de 50 ml por adição de 1,5 ml de FBS a cada um, a fim de neutralizar a tripsina no passo 1.2.11.
- Após 20 min, recolher 14 ml de solução de células da garrafa trypsinizing e adicionar a um tubo com FBS. Adicionar solução de enzima 14 ml fresco no balão e continuar agitação.
- Centrifugar as células recolhidas a 150 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Adicionar 45 ml de completa NBM ao sedimento, misture delicadamente, e repetir a centrifugação para enxaguar a soro. Re-suspender sedimento em 5 ml NBM completa e mantenha em gelo.
- etapas de colheita de células repita para um total de 5 colheitas, combinando todas as células colhidas em um único tubo cônico no gelo.
- Coloque um filtro celular de 40 um sobre a parte superior de um tubo de 50 ml. Prep tele célula filtro pela passagem de 10 ml de DMEM / F12 + 7% de FBS e, em seguida, por meio de lavagem com 10 ml de PBS.
- Adiciona-se lentamente a suspensão de células de filtro, permitindo que a escorrer através (Ver Figura 2M). Levante cuidadosamente a aba do filtro de células entre cada adição nova para quebrar qualquer vácuo e permitir que as células suspensas para passar livremente (veja a Figura 2 N).
- Centrifugar a suspensão de células filtrada como anteriormente. Re-suspender em 10 ml completa NBM e contar para determinar o número total de células viáveis utilizando 0,04% de azul de tripano e um hemocitómetro. células no gelo segure até que a geração microtumor.
2. Tissue Alternate Desagregação Protocolo
- Automated Dissociator tecido e o sistema de desagregação.
- Coloque o tubo de desagregação no Dissociator celular, selecione a opção "Tumor _02_02" programa e começar a pressionar e correr para 32 seg. tubo de transferência para rotador, coloque em 37 ° C incubadora por 40 min.
- Centrifugar as células suspensas-a 150 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Enquanto centrifugação das células, os reagentes acima definido para o tratamento da suspensão de células. Adicionar 10 ml NBM sem soro e suspensão suavemente triturado.
- Após centrifugação, obter um pellet de células contendo ~ 10 - 30 x 10 6 células viáveis (~ 0,3 mL). Re-suspendeu o sedimento em 10 ml de NBM isento de soro (Ver Figura 2O). Determine as células viáveis por ensaio de exclusão (veja o passo 3.2.2).
3. Microtumor Generation
- Preparação dos Reagentes
- Prepare completa NBM como em 1.1.4 e preparar neutralizado Alta Densidade Biogel humana (HuBiogel) (HDHG a 3 mg / ml) por protocolo interno. Biogel matrizes similares podem ser usadas também.
- Microtumor Produção e Cultura
- Obter células PDX recentemente dissociados como a suspensão de célula única em completa NBM, em gelo.
- Misture a célula suspension com um volume igual de solução de azul de tripano (0,4% em PBS) e analisar usando hemacitómetro para determinar o número de células e a viabilidade por exclusão com azul de tripano 18. Retirar o volume necessário para gerar 50.000 células / microtumor onde o volume = (50.000 células / * # tumor tumores) / (contagem de células viáveis / 1 ml) e colocar num tubo cónico de fresco.
- Concentra-se as células por centrifugação a 150 xg, durante 8 minutos, à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células com solução HDHG gelada num rácio final de 1 parte em células de FBS e 4 partes HDHG.
- Usar uma pipeta de canais múltiplos electrónico para dispensar 10 ul por mistura pino célula-HDHG sobre uma placa de aço com 96 pinos (com revestimento hidrofóbico) para gerar microtumors (2 mm grânulos cada um contendo 50.000 células).
- Coloque grânulos tumorais 3d dentro incubador de cultura de tecido (37 ° C, 5% de CO2, humidificada) durante 15 minutos para gelificar os grânulos.
- Depois de a gelificação, transferir os microtumors (10 μ; L) para uma câmara de cultura de suspensão por encomenda (50 ml) ou prato grande volume de cultura (10 cm) contendo completa NBM utilizando a pipeta multi-canal electrónico e personalizado pino do dispositivo.
- Depois de 1 - 2 dias em cultura de tecidos incubadora, transferir microtumors para placas de cultura de 96-poços contendo / poço usando uma de boca larga distribuição de pipeta e executar vários protocolos de ensaio e de análise de 50 ul de NBM.
- Tratamento de Drogas e Manutenção de microtumors
- Selecione concentrações finais para testes de drogas.
NOTA: Se a droga tem eficácia conhecida em cultura 2D, 2x seleccione o IC50 como a concentração de dose média e seleccionar três diluições em série acima e abaixo por um total de 5 doses. Por exemplo, se o IC 50 é de 9 pM para o fármaco em cultura 2D, seleccionar 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM e 162 uM concentração final como para o teste de droga. - Preparar a solução de dosagem de drogas 2x em completa NBM de sulfoxi dimetilde (DMSO) de ações. Diluir solução de dosagem em meio DMSO a 1% para preparar uma dose de 5, 3 vezes diluições em série.
- Adicionar 50 ul de solução de dosagem para a microtumor poços contendo 50 uL em placas de ensaio para atingir uma concentração final de DMSO de 0,5%. Repita o procedimento para cada repetição (por exemplo, 4) em cada dose do medicamento determinado em 3.3.1.
- Manter em culturas de 37 ° C, 5% de CO2, humidificada de cultura de tecidos incubadora de 1 - 14 dias. culturas de alimentação duas vezes por semana, renovando meios de comunicação e solução de droga como acima.
- Selecione concentrações finais para testes de drogas.
4. Análise morfológica e fenotípica de Microtumors
- Determinar a morfologia das células na microtumors utilizando coloração de células vivo padrão.
- Prepare Estoque 1 mM de calceína-AM em DMSO. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
- Em intervalos de cultura desejadas (1, 7, e 14 dias), adicionar solução de Calceina-AM preparado em PBS (sem Ca / Mg) para placa de 96 poços durante 1 uM de concentração final.
- Incubar20 minutos num banho a 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada, e imagem usando um microscópio de fluorescência a 2X, 4X, e 10X (excitação: 450-490 nm passa-banda, emissão: 515 nm passe longo, dicróico de 500 nm) .
- Crescimento Microtumor / ensaio de proliferação
- Dissolve-se pó de MTT em PBS (sem Ca / Mg) para preparar estoque de 12 mM. filtro estéril, alíquota, e armazenar a -20 ° C.
- Em intervalos desejados de cultura (1, 7, e 14 dias), adicionar 20 ul de solução de MTT a placa de 96 poços em 100 ul de volume de cultura. Incubar 2 h numa incubadora de cultura de tecidos.
- Preparar a solução de lise fresca de SDS a 10% em HCl 0,01 M e adicionar valor igual ao volume de cultura de placas. Incubar as placas selado durante a noite em 37 ° C incubadora.
- Ler a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de lamelas.
- Microtumor preparação para a análise Kinomic
- Preparar tampão de lise por pré-refrigeração a 4 ° C e em seguida adicionando uma proporção de 1: 100 de cada Pro 100xtein Fosfatase Inibidor (PPI) e 100x Proteína Inibidor de Protease (PI). Misture bem e manter em gelo.
- Transferência microtumors 2 para cada um dos três 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Remover o sobrenadante e adicionar 40 ul de tampão de lise contendo PPI e PI a cada tubo e lise durante 30 min a 4 ° C.
- amostras de pipetas vigorosamente para quebrar os grânulos tumorais. Centrifuga-se a 16000 xg durante 10 min a 4 ° C As amostras e armazenar a -80 ° C até à análise kinomic.
5. Kinomic Profiling de Microtumors
- A proteína de tirosina-quinase (PTK) perfilamento
- Reagentes de descongelamento (10x proteína cinase (PK) de tampão e 2% de albumina de soro bovino (BSA)) a 4 ° tampão C Carga PK (300 ul de estoque de tampão 10x PK em 2,7 ml de dH2O) para a seringa na posição # 2 sobre a caracterização plataforma.
- Abra o programa de software de ensaio de cinase e carregar o arquivo protocolo de PTK e pressione "Iniciar", anotando amostras dentro softwsão programa depois de chips de digitalização. Colocar fichas na plataforma de perfis e de carga 25 ul de 2% albumina sérica bovina (BSA) por matriz e pressione LOAD para iniciar o protocolo controlado por software de bloqueio etapa.
- Dilui-se 6 uM de estoque de 100 mM de ATP, com 54 uL de dH2O para fazer 10 mM de trifosfato de adenosina (ATP). Quando o software começa o 3º e etapa de lavagem final (visível na tela) trazem 15 ug de lisado trouxe até 28 ul com dH2O, misturar e adicionar à matriz.
- Prepare PTK mix master (MM) (para até 12 amostras). Adicionar 32,6 uL de dH2O para reconstituir ditiotreitol (DTT) e adiciona-se 6 ul de DTT, e 60 ul de solução 10x PK, para o tubo de PTK-MM1 (já contém 60 ul de BSA a 10x).
- Espere até prompt de 'Load' no software de ensaio de cinase aparece em seguida, adicione 126 mL de PTK-MM1, aditivo PTK 60 ul e 60 ul 10 mM ATP para MM2 (contém previamente aliquotas anticorpo PY20 FITC 4,5 ul) e misturar.Adicionar 16 ul desta mistura de PTK mestre para cada tubo de amostra e mistura lisado pipeta de 5 vezes.
- Certifique-se de tampa de vidro é limpo e, em seguida, adicionar 35 mL de lisado / master mix por matriz, feche a tampa do carrossel, e pressione o botão LOAD.
- Serina / treonina quinase (STK) Profiling:
- reagentes de descongelamento (10x tampão PK, 10x tampão STK, e 2% de BSA) a 4 ° C. PK tampão de carga (300 ul em 2,7 ml de dH 2 0) para a posição da seringa # 1, 01:10 tampão e STK (300 ul em 2,7 ml de dH 2 0) para a posição da seringa 2 #.
- Abra o programa de software de computador de ensaio de cinase e carregar o arquivo de protocolo STK e prima START, anotando amostras dentro do programa depois de chips de digitalização. Colocar fichas na plataforma de perfis e de carga 25 ul de BSA a 2% por matriz e pressione LOAD para começar a etapa de protocolo de bloqueio controlado por software.
- Diluir 6 M de ATP 100 mM com 54 mL dH2O Durante final (3º) mix etapa de lavagem2 ug de lisado e trazer até 32,6 ul com dH2O, misturar e adicionar à matriz.
- Faça STK mistura principal: Adicionar 70 ul 10x PK ao tubo STK-MM1 (contém 7 ul 100x BSA), e depois adicionar 42 mL de dH2O ao tubo STK-MM1.
- Espere até prompt de 'Load' no software de ensaio de cinase, em seguida: Adicionar 18 ul de ATP 10 mM a STK-MM1, e adicionar 9 ul MM1 para cada ligado amostra. Misture bem.
- Certifique-se de tampa de vidro é limpo e adicionar 35 ul de lisado / master mix por matriz, feche a tampa do carrossel, e pressionar LOAD.
- Durante definitiva (3ª) LAVAGEM adicionar anticorpo secundário 1,05 ul STK-FITC ao tubo DMAB (contém 3,03 ul STK mistura anticorpo primário), adicione 39,6 ul AB Buffer para DMAB, adicione 356,0 mL de dH2O para DMAB, adicionar 30 mL de DMAB para cada matriz, e pressione CARGA .
- Análise de Dados 19,20 Kinomic
- Abra o software de análise e carregar a imagem Análise App. Secionar pasta de imagens contendo imagens de matriz inteira com código de barras e com carimbo de tempo para os dados PTK ou STK, o número combinado arquivo de layout matriz selecione artigo (86.312 de PTK e 87102 para STK), ea carga gerada anteriormente matriz anotação Arquivo.
- Verifique gridding correta de todas as imagens e executar Tempo de Exposição Escala App. Estatisticamente comparar valores log2 transformado exposição / inclinação, e validar com pré-lavagem curvas cinéticas 19-21.
- Executar o software de previsão quinase a montante para consultar perfis kinomic alterados entre as condições para cinases a montante 22,23.
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Resultados
Mostrámos que o sistema de cultura 3D Biogel suporta o crescimento a longo-termo e função de vários tipos de células. Neste projeto colaborativo, xenolines GBM derivado do paciente (PDX) são utilizados para a produção de centenas de microtumors. As células dissociadas (3 x 10 5) ou neuroesferas (40 - 50) foram incluídos em grânulos Biogel (2 mM) e após a gelificação rápida que são cultivadas num biorreactor de costume NB-media preenchido. foram determinados a viabilidade celul...
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Discussão
As etapas críticas no âmbito do protocolo predominantemente relacionados com microtumor geração, bem como a administração de drogas e de manutenção. Porque as contas microtumor são frágeis e facilmente rasgado, extremo cuidado é necessário em ambas as fases de desenvolvimento de um ensaio e manutenção. Se ocorrer um erro durante qualquer um destes processos, a interpretação experimental pode ser comprometida, causando extensão ou repetição desnecessária dos experimentos ou mesmo exclusão de dados.
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Divulgações
R.S. e R.S.S. são funcionários da Vivo Biosciences. J.C.A. é parcialmente financiado pelo UAB Kinome Core.
Agradecimentos
Suportado pelo NIH conceder R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), prêmio Tumor SPORE Brain (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) e contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00.026).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Colagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Tripsina EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Suplemento | Life Technologies | 17502-048 | 1x concentração final |
| Suplemento B-27 sem Vitamina A | Life Technologies | 12587-010 | 1x concentração final |
| FGF humano recombinante-basic | Life Technologies | PHG0266 | concentração final |
| de 10 ng/mlHumano recombinante | EGF Life Technologies | PGH0315 | concentração final de 10 ng/ml |
| L-Glutamina | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | concentração final de 2 mM |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µ g/ml de concentração final |
| Penicilina Estreptomicina | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicilina G, 100 µ g/ml Concentração final de estreptomicina |
| Gentamicina | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml concentração final |
| MTT | Life Technologies | M6494 | preparado para 5 mg/ml em PBS e filtrado estéril, 1 mg/ml em poço |
| SDS | Fisher | BP166 | para tampão de lise MTT, preparado para 10% em 0,01 M HCl, 5% em HCl de poço |
| Fisher | A144SI-212 | para tampão de lise MTT, preparado para 0,01 M com SDS, 5 mM em poço | |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM em estoque DMSO, 2 µ M em solução de coloração PBS, 1 µ M em |
| bem Halt' s Coquetel de inibidores de proteína fosfatase | Pierce ThermoScientific | 78420 | Proporção 1:100 em MPER |
| Inibidor de Protease da Halt's Protein | Pierce ThermoScientific | 87786 | Proporção 1:100 em MPER |
| Reagente de Extração de Proteína de Mamíferos (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | para dissolução de calceína AM e compostos |
| salina tamponada com fosfato sem Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluído a 1x com água ultrapura MiliQ e filtrado estéril (para cultura de células) |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluído a 1x com água ultrapura MiliQ (para lavagem pré-fixação) |
| Formalina tamponada neutra a 10% Protocolo | 032-060 | ||
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| Alta densidade Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Inibidor de proteína fosfatase de Halt | Pierce | 78420 | |
| Inibidor de protease de proteína de Halt | Pierce | 87786 | |
| Reagente de extração de proteína de mamífero (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Proteína tirosina quinase (PTK) Array Chip de perfil | PamGene | 86312 | |
| Tampão PTK quinase | PamGene | 36000 | 300 µ l 10x estoque de buffer PK em 2.7 ml dH2O, número de catálogo do kit de reagentes PTK |
| ATP | PamGene | 36000 | número de catálogo para kit de reagentes PTK |
| PY20- anticorpo conjugado com FITC | PamGene | 36000 | número de catálogo para kit de reagentes PTK |
| Aditivo PTK | PamGene | 32114 | |
| Tubo PTK-MM1 (10x BSA) | PamGene | 36000 | número de catálogo para kit |
| de reagentes PTKChip de perfil de matriz de serina/treonina quinase (STK) | PamGene | 87102 | |
| Tampão de quinase STK | PamGene | 32205 | para kit de reagentes STK |
| Mistura de anticorpos primários STK (tubo DMAB) | PamGene | 32205 | para kit de reagentes STK |
| Anticorpo secundário conjugado com FITC | PamGene | 32203 | |
| Tubo STK-MM1 (100x BSA) | PamGene | 32205 | número de catálogo para kit de reagentes STK |
| Tampão de anticorpos STK | PamGene | 32205 | número de catálogo para kit de reagentes STK |
| Equipamento | |||
| #11 Lâminas, estéreis | Fisher | 3120030 | |
| #3 cabos de bisturi, estéreis | Fisher | 08-913-5 | |
| placas de Petri de vidro de 100 mm | Fisher | 08-748D | |
| Pinça semicurvada | Fisher | 12-460-318 | |
| Frasco de tripsinização | Fisher | 10-042-12B | |
| Agitador magnético | Fisher | 14-490-200 | |
| Barra de agitação de 3/4" | Fisher | 14-512-125 | |
| Filtro de célula B-D | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Tubo de centrífuga | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 software de análise kinômica | PamGene | ||
| Evolve | PamGene | ||
| UpKin App (previsão de quinase upstream) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Sistema de Cultura de Células Rotativas (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | com HARV descartável de 10 ml |
Referências
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