Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Ling Li; Klaus B. Piontek; Vivek Kumbhari; Masaharu Ishida; Florin M. Selaru

doi:10.3791/54036

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Artigo de método

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

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DOI:

10.3791/54036

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13 de junho de 2016

Ling Li¹ , Klaus B. Piontek¹ , Vivek Kumbhari¹ , Masaharu Ishida² , Florin M. Selaru¹

¹Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Surgery, Tohoku University

Neste artigo

Resumo

O líquido biliar é uma fonte valiosa de vesículas/exossomos extracelulares que contêm biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa um método robusto para isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo perfis de miRNA.

Resumo

pesquisa exossomo nos últimos três anos tem muito alargou o âmbito para a identificação e caracterização de biomarcadores e seus usos terapêuticos.

Os exossomas foram recentemente mostrado para conter microARNs (miRs). Mirs-se ter surgido como biomarcadores valiosos para fins de diagnóstico. Como a coleta da amostra em clínicas e hospitais é bastante variável, o isolamento miRNA de bile toda varia substancialmente. Para atingir perfis de miARN robustos, precisos e reprodutíveis a partir de amostras biliares recolhidos de uma maneira simples necessário o desenvolvimento de um protocolo de alta qualidade para isolar e caracterizar os exossomas a partir de bílis. O método requer diversas centrifugações e um passo de filtração com um passo final de ultracentrifugação para sedimentar os exossomas isolado. microscopia eletrônica, Western blot, citometria de fluxo e multi-parâmetro de nanopartículas análise óptica, quando disponíveis, são passos de caracterização cruciais para validar a qualidade do exosomes. Para o isolamento de miARN a partir destes exossomas, spiking com o lisado, um miARN sintético não específico de uma espécie, como Caenorhabditis elegans, ou seja, Cel-miR-39, é importante para a normalização da eficácia da extracção do ARN. O isolamento de exossoma a partir do fluido bílis após este método permite que a miARN bem sucedida de perfis a partir de amostras biliares armazenados durante vários anos a -80 ° C.

Introdução

Como outros fluidos biológicos, ou seja, leite materno, plasma ou urina, na bílis contém exossomas, lípidos ricos vesículas ^1-4. Exossomos podem induzir ou alterar funções biológicas em células receptoras ^{5, 6,} uma forma de comunicação célula-célula que pode ser parte da sua função normal ^{4, 7-9.} Exossomos podem conter espécies de miRNA que podem fornecer uma valiosa fonte de biomarcadores para o diagnóstico ^10. perfis miARNs ganharam substancial atenção nos últimos anos como marcadores de diagnóstico e de prognóstico para uma variedade de doenças ^11-14.

si miARN pode ser enc....