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Summary

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Abstract

pesquisa exossomo nos últimos três anos tem muito alargou o âmbito para a identificação e caracterização de biomarcadores e seus usos terapêuticos.

Os exossomas foram recentemente mostrado para conter microARNs (miRs). Mirs-se ter surgido como biomarcadores valiosos para fins de diagnóstico. Como a coleta da amostra em clínicas e hospitais é bastante variável, o isolamento miRNA de bile toda varia substancialmente. Para atingir perfis de miARN robustos, precisos e reprodutíveis a partir de amostras biliares recolhidos de uma maneira simples necessário o desenvolvimento de um protocolo de alta qualidade para isolar e caracterizar os exossomas a partir de bílis. O método requer diversas centrifugações e um passo de filtração com um passo final de ultracentrifugação para sedimentar os exossomas isolado. microscopia eletrônica, Western blot, citometria de fluxo e multi-parâmetro de nanopartículas análise óptica, quando disponíveis, são passos de caracterização cruciais para validar a qualidade do exosomes. Para o isolamento de miARN a partir destes exossomas, spiking com o lisado, um miARN sintético não específico de uma espécie, como Caenorhabditis elegans, ou seja, Cel-miR-39, é importante para a normalização da eficácia da extracção do ARN. O isolamento de exossoma a partir do fluido bílis após este método permite que a miARN bem sucedida de perfis a partir de amostras biliares armazenados durante vários anos a -80 ° C.

Introduction

Como outros fluidos biológicos, ou seja, leite materno, plasma ou urina, na bílis contém exossomas, lípidos ricos vesículas ^1-4. Exossomos podem induzir ou alterar funções biológicas em células receptoras ^{5, 6,} uma forma de comunicação célula-célula que pode ser parte da sua função normal ^{4, 7-9.} Exossomos podem conter espécies de miRNA que podem fornecer uma valiosa fonte de biomarcadores para o diagnóstico ^10. perfis miARNs ganharam substancial atenção nos últimos anos como marcadores de diagnóstico e de prognóstico para uma variedade de doenças ^11-14.

si miARN pode ser encontrado em fluidos biológicos, possivelmente libertados por células mortas e a quantidade de células vertente pode ser grandemente influenciado por uma doença subjacente. O perfil de miRNA de exossomos não reflete necessariamente o perfil de miRNA da célula originária ^{6, 10, 15-17,} ainda exossomos podem transportar assinaturas miRNA que pode ser característica da ce parentalll como uma célula tumoral. Exossomas derivado de tumor foram identificados no plasma de doentes com adenocarcinoma do pulmão, cancro da próstata e outros tumores ^{8, 16, 18.}

O objetivo deste método é o isolamento fiável e robusta de exossomos de espécimes biliares humanos, em grande parte independentes dos seus procedimentos de manuseio anteriores. Foi desenvolvido para utilizar biliar como uma fonte segura de miARN potencial para o diagnóstico de doenças do ducto biliar, tais como colangiocarcinoma ^19. É constituída por vários passos de centrifugação com o aumento das velocidades de isolar exossomas e pode ser aplicável a outros fluidos biológicos.

Protocol

A obtenção da bile de pacientes por colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE) requer a aprovação de um protocolo de estudo seres humanos pela Institutional Review Board. Todo o trabalho aqui apresentado foi aprovado pela Johns Hopkins University Institutional Review Board.

1. exossomo Isolamento da Bile

1. Execute colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE). Colocar o paciente em decúbito dorsal e entubar.
   1. Passar um duodenoscópio através da boca do paciente e inseri-lo na segunda parte do duodeno e identificar a papila.
   2. Seletivamente canular do ducto biliar comum através da inserção de um lúmen triplo sphincterotome pré-carregado com um fio-guia hidrofílico 0,035 polegadas (0,9 mm).
   3. Avançar o fio-guia sob orientação fluoroscópica ao ducto hepático esquerdo, uma vez na ocasião, pode ser difícil diferenciar o ducto cístico do ducto hepático direito, em seguida, avançar osphincterotome 5 cm no ducto biliar para adquirir uma posição estável.
   4. Remova o fio-guia, anexar uma seringa de 10 ml para a porta de fio guia através do bloqueio Luer e aspirar a bile usando 10 ml de pressão negativa.
   5. Retire a seringa contendo a bile para prosseguir com a CPRE por reinserir o fio-guia e injeção de contraste através da porta de injeção para opacificar da árvore biliar.
   6. Transferir a bílis recolhido para um tubo de 15 ml em gelo e manter em gelo até estar pronto para prosseguir com o passo de centrifugação.
      Cuidado: Use luvas para proteger a si mesmo e as amostras! Tratar a bile como uma fonte potencial de infecção, pois ele pode conter partículas virais de hepatite A!
   7. Manter a amostra (s) em gelo. Ou prosseguir com o passo 1.2 ou centrifugar a 500 xg, a 4 ° C durante 10 min e, em seguida, congelar a -80 ° C até à sua utilização.
      Nota: As amostras armazenadas dessa maneira por vários anos têm sido rotineiramente utilizado com bons resultados ^19.
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   8. Transferir 400 ul da bílis para um tubo de microcentrífuga e recolher as células e os resíduos celulares por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
   9. Remover o sobrenadante por pipetagem, transferir para um tubo de microcentrífuga fresco e centrifuga-se a amostra (s) a 16500 xg durante mais 20 min a 4 ° C para limpar o sobrenadante ainda mais de detritos. Descartar os tubos na resíduos de risco biológico. Alternativamente, girar as amostras em uma ultracentrífuga vez.
   10. Recolhe-se o sobrenadante e filtrá-la numa câmara de biosegurança com uma seringa através de um filtro de membrana de 0,2 m de polietersulfona (PES) que tem boas taxas de fluxo e de baixa ligação às proteínas para remover quaisquer partículas maiores do que 200 nm para a esquerda.
   11. Pipeta-se o sobrenadante filtrado para ultracentrífuga tubos e adicionar PBS de modo a que os tubos são mais do que 2/3 cheio. Se os tubos contêm menos líquido do que isso, os tubos entrará em colapso durante a centrifugação! Os tubos podem ser lavado, esterilizado e reutilizado várias vezes.
   12. Pellet os exossomas através de ultracentrifugação a 120000 xg durante 70 min a 4 ° C. Após centrifugação a aparência na parte inferior do tubo de ultracentrífuga para ver, por vezes, pequenos peletes amarelos; estes são os exossomos.
   13. Descartar o sobrenadante por decantação-lo com cuidado e desinfectar os resíduos através da adição de água sanitária para uma concentração final de 10% v / v e deixe repousar por 20 min.
   14. Para as experiências de jusante, quer processar o pelete (s) em um pequeno volume da solução apropriada (isto é, o ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão para o isolamento de proteína, tampão de lise de ARN para o isolamento MIR) ou que ressuspender em 50-150 ul de fosfato tamponada salino (PBS), que pode ser armazenado a -80 ° C para uso futuro (quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR) ou a extracção de proteínas, etc.) ou utilizados para a caracterização da preparação exossomo por TEM ou óptica nanopartícula .

   2. Identificação por exossomoMicroscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) ou CryoEM

   1. Ressuspender vesículas extracelulares em 100 ul de PBS por pipetagem. Idealmente, os exossomas usar que não foram armazenados a -20 ° C ou -80 ° C, especialmente quando se realiza o isolamento para a primeira vez.
   2. Adsorver uma alíquota de 20 ul (cerca de 2 ug) a 400 grelhas de cobre revestidas com carbono Parlodion malha durante 2 min e deixa-se secar à temperatura ambiente.
   3. Corrigir o exosoma em 1% (v / v) de glutaraldeído (EM-grau) durante 5 min à temperatura ambiente, colocando gotas cuidadosamente sobre a preparação seca.
   4. Lavam-se as grades, duas vezes com água durante 5 minutos e, em seguida, contrastar VE mancha com ácido fosfotúngstico a 1% (PTA) durante 30 seg.
   5. Aquisição de imagens com um microscópio electrónico com uma voltagem de aceleração de 80 kV de partida com ampliações de 20,000X e aumentando a 100,000X quando a determinação do tamanho das partículas.
      Nota: Outras preparações como camadas sobre 200 cobre ou níquel redes de malha revestido de carbono Formvar e li coloração contrasteKe 1% ou 2% de acetato de uranilo durante 10-15 min, também são possíveis.
   6. Para CryoEM, misturar uma alíquota de 20 ul (cerca de 2 ug) com 60 ul de proteína G de ouro de 10 nm (proporção 1: 3). Isso vai ajudar a determinar o diâmetro exosome.
   7. Transferir as amostras para grades de carbono holey descarregada-glow C-flat e remover o excesso de líquido borrando. Congelar as grades mergulhando-as imediatamente em etano líquido.
   8. Montar as grelhas num cryoholder em azoto líquido.
   9. Adquirir as imagens em 200 kV, com ampliações de 20,000X e 100,000X.

   3. Identificação exossomo por Multi-parâmetro nanopartículas análise óptica

   1. Ressuspender as exossomas isolado em 100 ul de PBS por pipetagem.
   2. Diluir exossomas em 600 ul de PBS em várias proporções diferentes (como 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 e 1: 1200).
   3. Visualizar os exossomas por espalhamento de luz laser com o instrumento e software apropriado em tempo real de acordo com a Fábricasprotocolo de rer ^20.
   4. Aumentar o nível da câmera no modo de captura até que as partículas tornam-se visíveis, em seguida, ajustar o foco para fazer as partículas parecer suave.
   5. Enquanto no modo padrão, diminua a câmera para o nível mais baixo que as partículas ainda pode ser visto, se necessário, ajustar obturador da câmera e ganho para alcançar este objectivo.
   6. Verificar visualmente para garantir 20-100 partículas são visíveis na tela, se não liberar a unidade e ajustar a diluição em PBS.
   7. Em seguida, ajuste a duração de captura para entre 30-60 seg. Depois que o vídeo é capturado, ajustar os parâmetros de processamento até que todas as partículas são identificados na tela e processar o arquivo de vídeo.

   4. exossomo Caracterização por Western Blot

   1. Lyse exossomo pelotas de 2-5 ml de bile em 100 ul de ensaio radioimunoprecipita�o gelada (RIPA) tampão com um inibidor da protease pipetando cima e para baixo completamente e misture lisados ​​vigorosamente por 30 segundosnum vortex para solubilizar as proteínas de forma eficaz.
   2. Embora a maior parte das vezes não é necessário, usar-pulso sonicação das amostras em gelo com pulsos de 2 para 10 segundos cada para assegurar a lise completa.
   3. Peletizar o material insolúvel por centrifugação a 15.000 xg, a 4 ° C durante 5 min e transferir o sobrenadante para um tubo limpo.
   4. Determinar a concentração de proteína com um método de escolha (isto é, ácido bicinconínico (BCA), de Coomassie, Lowry modificado, 660 nm, ensaio de proteína, etc.) de acordo com o protocolo do fabricante. O método não é tão importante, desde que o mesmo método é utilizado de forma consistente para obter resultados que podem ser comparados através de experiências.
   5. Carga de 50 mg de proteína por amostra em tampão de Laemmli após o aquecimento da amostra a 95 ° C durante 5 min num poço de um gel de poliacrilamida para electroforese (PAGE).
   6. Electroforese as amostras sobre as PRINCIPAL géis durante 1,5 h e transferir as proteínas separadas para uma membrana de nylon.
   7. Bbloquear a membrana (s) com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 0,1% (TBS-T) durante 1 hora, depois incubar com anticorpos específicos de exossoma como anti-CD63 e anti-GST-101, a uma diluição de 1: 500 de um modo preferido O / N a 4 ° C.
   8. Lavam-se as membranas com TBS-T 3 x 10 min, depois incubar com um apropriado, combinando anticorpo secundário conjugado com HRP em 5% de leite magro em TBS-T, durante 1-2 horas à temperatura ambiente.
   9. Lava-se a membrana (s) 3 x 5 min com TBS-T e detectar as proteínas específicas com reagentes de quimioluminescência de acordo com o protocolo do fabricante.
   10. Imagem as membranas com uma película ou um sistema de imagem digital, de acordo com o protocolo do fabricante.

   5. MicroRNA Isolamento dos isolados exossomas

   Nota: Isolamento de exossomas a partir de miARN biliares é levada a cabo usando um isolamento miARN modificado baseado em um kit disponível comercialmente, mas qualquer outro método de isolamento de RNA pode ser usada ou adaptada.

   1. Adicionar 300 &# 181; l lise / tampão de construção para o sedimento exossomo (isolado a partir de 400 ul biliar), vortex, pipeta ou passar através de uma agulha / seringa para lisar completamente as exossomas para obter um lisado homogénea.
   2. Adicionar 1/10 volume de (30 ul) de miARN homogeneizado aditivo, e misturar bem com vortex ou invertendo o tubo várias vezes.
   3. Incubar a mistura durante 10 min em gelo.
   4. Adicionar um volume de ácido-fenol: clorofórmio igual ao homogenato inicial (300 ul).
   5. Adicionar 5 uL de 5 fmol / ul CEL-miR 39 e vortex durante 30-60 seg.
   6. Centrifugar durante 5 minutos a 10000 xg à temperatura ambiente para separar a fase aquosa (superior) e as fases orgânicas (inferior).
   7. Aspirar cuidadosamente a fase superior por pipetagem e transferência para um novo tubo ao anotar o volume transferido. Descarte a fase orgânica no recipiente de lixo orgânico apropriado.
   8. Para enriquecimento em pequenos RNAs adicionar 1/3 de volume de 100% de etanol à fase aquosa recuperada e misturar por vortex completamente ou invertendo a TUser várias vezes.
   9. Pipetar a mistura lisado / etanol para o cartucho de filtro, até 700 uL de cada vez.
   10. Centrifugar os cartuchos de 15 segundos a um máximo de 10.000 xg ou aplicar vácuo para passar a mistura através do filtro.
   11. Recolher o filtrado e se a mistura lisado / etanol superior a 700 l, transferir o flow-through para um tubo novo e repita o procedimento para recolher todos os filtrados. Estes filtros contém fracções desprovidas de ARN pequenos RNAs e pode ser utilizado para recuperar estes ARN maiores.
   12. Adicione 2/3 volume de RT 100% de etanol ao filtrado total e misturar bem em vórtice.
   13. Pipeta a mistura filtrado / etanol para um segundo elemento do filtro. Como antes o volume máximo que pode ser aplicado ao mesmo tempo é de 700 uL.
   14. Centrifugar durante 15 segundos a 10.000 xg ou aplicar de vácuo tal como descrito no passo 5.10.
   15. Descartar o flow-through, e repetir até que todos mistura filtrado / etanol foi filtrada.
   16. aplicar 70081; l de solução de lavagem miARN 1 para o cartucho de filtro, centrifuga-se durante 5-10 seg ou aplicar vácuo e descartar o fluxo de passagem.
   17. Lavar o filtro com solução de lavagem 500 ul 2/3 como feito no passo 5.16.
   18. Repetir a lavagem uma segunda vez com 500 ul de solução de lavagem 2/3 como no passo 5.16, descartar o fluxo de passagem e colocar o filtro para trás no tubo de recolha.
   19. A rotação do cartucho do filtro durante 1 min a 10000 xg para remover todo o líquido residual a partir do filtro.
   20. Transferir o cartucho de filtro num tubo de colheita fresco e aplicar 100 ul de água quente livre (95 ° C) de nuclease para o centro do filtro.
   21. Gire os conjuntos para 20-30 seg a velocidade máxima para recuperar o RNA.
   22. Recolhe-se o eluato e usar imediatamente ou armazenar a -80 ° C.

Representative Results

Discussion

Para utilizar de forma confiável exosomes isoladas de bile, é importante empregar métodos de alta qualidade consistente de isolamento para obter amostras de alta qualidade em troca. A metodologia definida neste trabalho é uma forma bem estabelecida para isolar exossomos e miRNA de bílis humana. Ele destaca várias etapas cruciais na caracterização dos exossomos isolados, que no mínimo deve incluir microscopia eletrônica ou óptica de nanopartículas e Western blot.

O passo mais importante no isolamento de exossomas, pelo menos quando se trata de estabilidade miARN, é processar biliar fresco o mais rapidamente possível. O armazenamento prolongado de bílis toda a RT ou até mesmo um único ciclo de congelação-descongelação pode reduzir significativamente o teor de miARN enquanto, em contraste os exossomas isoladas são muito estáveis ​​mesmo quando armazenados a temperatura ambiente ou submetidos a vários ciclos de congelamento-descongelamento. Enquanto as amostras em questão ter sido armazenado a -80 ° C, isolamento de exossomas e miRNA de bílis pode ser realizado com grande reprodutibilidade para identificar assinaturas de miARN nas amostras. Recomenda-se começar inicialmente com bile fresca para garantir a integridade miRNA adequada. Esta é uma consideração importante quando se tenta construir-se um conjunto de amostras biliares ao longo do tempo, como seria o caso para as amostras do paciente. Ele permite um para processar amostras que foram recolhidos ao longo de meses ou mesmo anos a ser processados ​​e avaliados ao mesmo tempo.

Isto melhora grandemente a utilização da bílis para fins de diagnóstico, quer para olhar para as assinaturas de miARN que confirmam a presença de um estado de doença como o cancro ou a resposta de uma doença de intervenções terapêuticas. De facto, os resultados a partir de amostras clínicas foram utilizados para estabelecer as assinaturas de miARN como biomarcadores para colangiocarcinoma ^19.

O primeiro passo de centrifugação remove células intactas que estão presentes na bílis. Na segunda, celular centrifugação maior velocidade debRIS, corpos apoptóticos e outros organelos maiores são sedimentadas. Para assegurar que apenas partículas menor do que 200 nm são recolhidas na etapa de ultracentrifugação, o passo de filtração com filtro de ligação de uma proteína de baixa é importante. Alguns protocolos omitir este passo, mas nós pensamos que é necessário. Após a ultracentrifugação a 120000 xg, o sedimento obtido contém exossomas bastante puros que podem ser processados ​​imediatamente ou após ressuspensão em PBS ser armazenado a -80 ° C. Uma limitação deste método é que o sedimento obtido só é altamente enriquecido em exossomas, mas isso é verdade para outros métodos de enriquecimento, tais como exclusão de tamanho e precipitação polimérico. O processamento adicional pode implicar um outro passo de purificação por gradiente de sacarose ou de ligação a esferas magnéticas revestidas com anticorpo. Se a fonte dos exossomas (como, por exemplo, plasma) contém precipita como resultado da coagulação, esta purificação adicional pode ser necessário uma vez que estas partículas podem muitas vezes ter o tamanho de exossomas.Em particular, a imuno-purificação conduz a uma preparação mais marcador enriquecido exossoma. A desvantagem é que esta reduz ainda mais a quantidade de exossomos e / ou miRNA presente, e para a maioria dos fins não justifica o tempo eo processo que consome recursos. Se, no entanto, a análise de mancha de Western detecta a presença de contaminação de proteína de microssoma através de um retículo endoplasmático, tais como calnexina, purificação adicional, em particular imuno-isolamento baseado, é aconselhável. Na nossa experiência isso raramente é o caso para a bílis, se utiliza uma fonte de outros fluidos biológicos de um passo de purificação de base imune, recomenda-se.

O uso de ultracentrifugação diferencial para isolar e enriquecer exossomas a partir de fluido biliar é um método relativamente rápido e de baixo custo. Enquanto isso requer a utilização de uma ultracentrifugadora, de preferência com um rotor de balanço do balde, estes dispositivos são comumente encontrados em muitas instituições. A purificação adicional por meio de centrifugação de densidade são pose com o mesmo equipamento e os tubos são reutilizáveis ​​várias vezes após a limpeza e esterilização. Embora a precipitação à base de polímero requer apenas o uso de microcentrífugas ou centrífugas padrão para sedimentar os precipitados a uma velocidade de 10000 x g ou menos, geralmente de co-isola contaminantes não vesiculares, incluindo lipoproteínas. Enquanto as lipoproteínas não estão geralmente presentes na bílis, o custo dos polímeros muitas vezes patenteadas fazer o isolamento caro em comparação. Os polímeros também são por vezes incompatíveis com aplicações a jusante, tais como espectrometria de massa, mas quando a análise a jusante é compatível com o polímero (ARN ou isolamento de proteínas), o método é fácil, rápida e não requerem equipamento específico.

cromatografia de exclusão de tamanho tem a desvantagem de tempos de execução longos ea exigência de equipamento especial, mas permite a separação precisa de partículas de grandes e pequenos. Purificação por imunoafinidade produz o maior purity de vesículas exosomal e até mesmo permite o isolamento de frações exosomal específicos, tais como epitelial derivada, mas isso vem com o custo de produção total. Além disso, ela é limitada a pequenos volumes de amostras que necessitam de um primeiro passo de enriquecimento se um grande volume está a ser processado e os exossomas isoladas podem perder a actividade funcional ou exibem função biológica alterada devido aos anticorpos ligados.

É importante ter em conta a aplicação a jusante (s) e a disponibilidade de equipamento especializado no que se refere ao isolamento de exossomas. A caracterização das partículas isoladas enriquecidas / é importante, independentemente do método de isolamento utilizado. Ultracentrifugação tem sido até agora um "padrão ouro" usada por muitos laboratórios devido ao seu enriquecimento robusto e rápido (e de baixo custo, se uma ultracentrífuga está disponível) de partículas exosomal.

Materials

0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter	Corning	431229
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes 	Beckman Coulter	331374
SW40Ti rotor	Beckman Coulter
LM10-HS 	Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software 	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
Complete Protease Inhibitor	Roche distributed by Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871