Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Published: July 2, 2016 doi: 10.3791/54048
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

Met de snelle ontwikkeling van stamcel-gebaseerde gentherapieën tegen HIV, er dringende taak een diermodel om de hematopoëtische differentiatie en het immuunsysteem van de genetisch gemodificeerde cellen te bestuderen. Het gehumaniseerde beenmerg / Liver / Thymus (BLT) muismodel maakt volledige reconstructie van een menselijk immuunsysteem in de omtrek, die T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten omvat. De menselijke thymus implantaat worden ook thymus selectie van T-cellen autologe thymusweefsel. Naast de studie van HIV-infectie, het model staat als een krachtig hulpmiddel om differentiatie, ontwikkeling en functionaliteit van cellen afkomstig van hematopoietische stamcellen (HSCs) te bestuderen. Hier beschrijven we de constructie van gehumaniseerde niet-obese diabetische (NOD) -severe gecombineerde immuundeficiënte (SCID) -gezamenlijke gammaketen knockout (c γ - / -) -Bone merg / Liver / Thymus (NSG-BLT) muizen met HSCs getransduceerd met CD4 chimere antigen receptor (CD4CAR)lentivirus vector. We laten zien dat de CD4CAR HSCs succes kunnen differentiëren in meerdere lijnen en anti-HIV-activiteit. Het doel van de studie is het gebruik van NSG-BLT muismodel als een in vivo model van technisch immuniteit tegen HIV te tonen. Het is vermeldenswaard dat, omdat lentivirus en menselijk weefsel wordt gebruikt, experimenten en operaties moeten worden uitgevoerd in een klasse II bioveiligheid kast in een Biosafety Level 2 (BSL2) met speciale voorzorgsmaatregelen (BSL2 +) faciliteit.

Introduction

Ondanks het succes van gecombineerde anti-retrovirale therapie, HIV-infectie blijft een levenslange aandoening. De cellulaire immuunrespons tegen HIV speelt zeer belangrijke rol bij de controle van HIV-replicatie. Recente ontwikkelingen in stamcellen manipulatie toegestaan ​​voor de snelle ontwikkeling van gentherapie benaderingen voor behandeling van HIV 1-3. Dientengevolge is het belangrijk om een goede diermodel waarmee in vivo studie van de effectiviteit van celgebaseerde therapieën tegen HIV.

Die met HIV in diermodellen is gecompliceerd door het feit dat het virus infecteert alleen menselijke cellen. Om deze beperking te omzeilen, hebben wetenschappers hun toevlucht tot het gebruik van de ziekte van modellen zoals de Simian Immunodeficiency Virus (SIV) bij Rhesus makaken 4,5. Helaas zijn er grote beperkingen in dit model te wijten aan de inherente verschillen tussen de soorten en de verschillen tussen SIV en HIV. Daarnaast zijn er slechts zeer gespecialiseerde faciliteiten capable ondersteuning van het werk met niet-menselijke primaten en elke makaak vergt een grote investering. Aldus, is er dringend behoefte aan een model dat het menselijke immuunsysteem, dat gevoelig is voor HIV-infectie / pathogenese gebruikt en minder financieel onbetaalbaar.

De niet-obese diabetische (NOD) -severe gecombineerde immuundeficiënte (SCID) -gezamenlijke gammaketen knockout (c γ - / -) (of NSG) Blood / Liver / Thymus (BLT) gehumaniseerd muismodel steeds bewezen als een belangrijk instrument HIV-infectie te bestuderen. Door het implanteren van hematopoietische stamcellen (HSC) en foetale thymus, de muizen in staat zijn om te ontwikkelen en te herhalen een menselijk immuunsysteem 1-3. Een type stamcel gentherapie behelst 'ombuigen perifere T-cellen targeten HIV door herprogrammering hematopoëtische stamcellen (HSC) te differentiëren tot antigeen-specifieke T-cellen. We hebben eerder aangetoond dat techniek HSCs met een moleculair gekloneerde anti-HIV-specifieke T cel rereceptor (TCR) tegen SL9 epitoop (aminozuren 77-85, SLYNTVATL) van HIV-1 Gag kunnen stamcellen te sturen naar de vorming van rijpe T-cellen die HIV replicatie in de gehumaniseerde NSG-BLT muismodel 6 onderdrukken. Het nadeel van het gebruik van een moleculair gekloneerd TCR is dat het beperkt is tot een specifiek humaan leukocyt antigeen (HLA) subtype dat de toepassing van deze therapie wordt beperkt. Chimere antigeenreceptoren (CAR), anderzijds, kan universeel toegepast op alle HLA-subtypes. Initiële studies werden uitgevoerd onder toepassing van een CAR geconstrueerd met de extracellulaire en transmembrane domeinen van humaan CD4 gefuseerd aan het intracellulaire signalering ζ domein van CD3 (aangeduid als de CD4ζCAR). CD4ζCAR expressie op CD8 T-cellen kunnen herkennen HIV envelop en leiden tot een cytotoxische T-celreactie die vergelijkbaar is met die gemedieerd wordt door een T-celreceptor 7. We hebben onlangs aangetoond dat humane HSCs instelbaar onder CD4ζCAR, die vervolgens kunnen differentiëren in verschillende hematopoietische lineages, waaronder functionele T-cellen kunnen onderdrukken HIV replicatie in de gehumaniseerd muismodel 8. Met de snelle vooruitgang in chimeer antigen receptor therapieën voor kanker 9 en de verdere karakterisering van potente breed neutraliserende antilichamen tegen HIV 10-12 dat de constructie van enkelketenige antilichamen CARs mogelijk is waarneembaar dat vele nieuwe kandidaat constructen naast CD4ζCAR , wordt gegenereerd en getest op stamcel gebaseerde gentherapie van HIV ziekten en andere ziekten. Daarnaast kan de gehumaniseerde NSG-BLT muismodel die deze antigeen-specifieke voertuigen ook een nuttig instrument een grondig onderzoek in de humane T cel responsen in vivo. Belangrijker ons protocol verschilt van eerdere werkwijzen beschreven voor de constructie van gehumaniseerde van BLT muizen 13-15, dat de HSCs in gelatineuze eiwitmengsel wordt gebruikt in plaats van foetale lever stammen 16. Dit protocol beschrijft: 1) de bouw van humanized BLT gemanipuleerde muizen met CD4ζCAR; en 2) karakterisering van de differentiatie van de genetisch gemodificeerde cellen; en 3) karakterisering van de functionaliteit van de genetisch gemodificeerde cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethic Verklaring: Menselijk foetaal weefsel werd verkregen van Geavanceerde Biosciences middelen of via Novogenix en werd verkregen zonder identificerende informatie en leverde IRB goedkeuring voor het gebruik ervan niet nodig. Dierproeven in dit manuscript beschreven werd uitgevoerd in het kader van de schriftelijke toestemming van de University of California, Los Angeles, en (UCLA) Animal Research Committee (ARC) in overeenstemming met alle federale, provinciale en plaatselijke richtlijnen. Concreet werden deze studies uitgevoerd onder strikte overeenstemming met de richtlijnen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Research Council en de erkenning en de richtlijnen van de Vereniging voor de evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care (AALAC) uitgevoerd International onder UCLA ARC Protocol Number 2010-038-02B. Alle operaties werden uitgevoerd onder ketamine / xylazine en isofluraananesthesie en alle inspanningen werden gedaan om dieren pijn en ongemak te minimaliseren.

1. Constructie van gehumaniseerd gemanipuleerde muizen met CD4 Chimère Antigeen Receptor

  1. Het verwerken van Foetale Thymus en het isoleren van CD34 + HSC uit foetale lever
    1. thymus Processing
      1. Voorzichtig te wassen de thymus in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, in een 15 ml conische buis. Herhaal wasstap 3-4 keer.
      2. Voeg 7 ml RPMI media + 10% FBS + pen / strep. Giet alles in een steriele 100 mm petrischaal.
      3. Gebruik scalpels de thymus in kleine stukjes van ongeveer 1 mm2. Plaats elk thymus stuk in een enkel putje op een 96-wells plaat. Met gebogen stompe tang bij het overbrengen thymus stukjes van de 96-well plaat.
        1. Voeg een kleine hoeveelheid medium (100 - 200 pl) aan alle putjes, zodat het weefsel niet uitdroogt. Visualiseren onder de microscoop (Thymi hebben lobben en eruit moet zien zakken van de cellen).
          LET OP: Gooi alle stukken die twijfelachtige kijken op welke manier;er vaak bindweefsel en dit moet niet worden geïmplanteerd.
      4. Verwijder de bevestigde thymus stukken en plaats ze allemaal in een T25 celkweek kolf. Voeg 7 ml RPMI-medium aangevuld met 10% FBS en 450 ug / ml piperacilline / tazobactam en amfotericine B. schud fles te mengen. Cultuur de kolf gedurende de nacht bij 37 ° C / 5% CO2.
        OPMERKING: Deze stap is nodig om bacteriële besmetting van het weefsel te voorkomen.
      5. (Optionele stap) Bevries de thymus voor toekomstig gebruik. Equilibreren de stukjes in 90% menselijk AB serum met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 10 min. Vries ze met een snelheid van 1 ° C / min tot -50 ° C, dan is een snelle afkoeling tot -150 ºC. Als u klaar bent om te ontdooien, snel ontdooien in een 37 ° C waterbad en voorzichtig te wassen 3x in RPMI compleet medium zonder DMSO.
    2. lever Processing
      1. Voorzichtig te wassen de lever in PBS in een 50 ml conische buis. Herhaal wasstap 3-4 keer.
      2. Voeg 10 ml (Iscove's gemodificeerd Dulbecco's Media) IMDM medium om de 50 ml conische buis. Giet alles in een 100 mm steriele petrischaal.
      3. Homogeniseer het leverweefsel met behulp van twee scalpels. Snijd de lever in kleine stukjes van ongeveer 3 mm2. Knip en eventuele witte bindweefsel weggooien.
      4. Gebruik 10 ml injectiespuit voorzien van een 16 gauge stompe naald tot het nemen van de lever stukjes en media. Vervolgens transfer naar een 50 ml conische buis.
      5. Voorzichtig resuspendeer de media en weefsel schorsing en verdrijven 5-7 keer om het weefsel volledig te homogeniseren.
      6. Bereid 10 ml IMDM-medium aangevuld met enzymen: 500 U / ml collagenase, 2400 U / ml hyluronidase en 300 U / ml DNase en 450 ug / ml piperacilline / tazobactam en amfotericine B. Filtreer de media via een 0,22 urn filter dan voeg de media naar de lever suspensie.
      7. Cap de 50 ml conische buis met de lever schorsing en sluit goed af met zelfdichtende film zoals Parafilm to voorkomen lekken. Roteren in een buis rotator in de incubator bij 37 ° C gedurende 90 min.
      8. Filter de verteerde celsuspensie door een 100 micrometer cel zeef in een verse 50 ml buis.
        LET OP: Voeg PBS om de schorsing van het totale volume tot 50 ml te brengen. Dit ene in twee buizen van 50 ml buisjes die elk 25 ml celsuspensie.
      9. Langzaam en voorzichtig ondertapijt de cellen in elke buis met 10 ml dichtheidscentrifugatie media (bijvoorbeeld Ficoll). Spin op 1.200 g gedurende 20 min zonder rem. Let op: alle in dit protocol vermelde centrifugeren wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (25 ºC).
      10. Haal de interface (bijv., Buffy coat) van elke buis en transfer naar twee aparte buizen van 50 ml. Breng het volume van elke buis interface tot 50 ml met PBS. Spin bij 300 xg gedurende 7-10 min. Zuig supernatant zorgvuldig.
      11. Combineer de twee pellets. Was drie keer met 50 ml PBS dat 2% FBS. Spin bij 300 xg gedurende 7-10 mIedere keer terwijl voorzichtig afzuigen van de supernatant.
      12. Resuspendeer de pellet in 50 ml RPMI medium + 10% FBS. Tellen cellen met behulp van hemocytometer op dit moment alvorens tot celsortering.
      13. Sorteren CD34 + cellen onmiddellijk met CD34 sorteren Kit (bijv., CD34 microkorrels), volgens het protocol van de fabrikant.
        LET OP: Als alternatief kunnen de cellen worden gekweekt in RPMI media + 10% FBS op 1 miljoen / ml 's nachts.
      14. Save zowel CD34 + en CD34-fractie.
        OPMERKING: Bij deze stap kunnen CD34 + en CD34- cellen worden ingevroren behulp Bambanker vriesmedium of andere media bevriezen. Freeze 1 ml 4-6 x 10 6 CD34 + cellen per buis en vries 1 ml van 40 - 60 x 10 6 CD34-cellen per buis.
  2. Transductie van CD34 + cellen
    1. Bereken het aantal transductie putten vereiste van een 6 goed weefselkweek plaat. 1 goed kan worden gebruikt om te transduceren tot 8 x 10 6 cellen. Voorelke BLT muis, zal 0,5 x 10 6 CD34 + worden geïmplanteerd samen met CD34-cellen en thymus eronder nier capsule en 0,5 x 10 6 CD34 + cellen intraveneus worden geïnjecteerd. Het aantal CD34 + cellen te gebruiken wordt bepaald door het aantal muizen (1 miljoen cellen per muis).
    2. Coat het benodigde aantal putjes van een niet-weefselkweek behandelde plaat met 6 putjes met 1,25 ml recombinant humaan fibronectine oplossing (bv., Retronectin) (20 ug / ml in PBS) in elk putje. Bedek de plaat en laat het gedurende 2 uur bij kamertemperatuur bewaard in een schone bioveiligheid kast.
    3. Aspireren fibronectine oplossing uit bronnen en voeg 1,25 ml FACS buffer (PBS met 4% FBS) in elk putje voor het blokkeren. Laat de plaat bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 30 min.
    4. Zuig FACS buffer en wassen putten eenmaal met PBS.
    5. Houd PBS in de beklede putjes totdat de plaat is klaar voor gebruik. Bewaar de plaat staan ​​bij 4 ° C gedurende de nacht, zo niet onmiddellijk wordt gebruikt.
    6. Plaat CD34 + cellen in infectiemedium (2% menselijk serumalbumine in Yssel's serumvrij T-celmedium) in fibronectine-oplossing beklede putjes (~ 2 x 10 6 cellen / ml) en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    7. Gebruik een pipet om lentivirale vector aan de putjes toe te voegen bij een multipliciteit van infectie (MOI) tussen 2 - 10 Meng en incubeer overnacht bij 37 ° C.
      LET OP: De titer van de lentivirus vector gebruikt moet van te voren worden vastgesteld.
    8. Oogst de cellen de volgende dag door voorzichtig schrapen de bodem van de putjes met een cel schraper. Verzamel cellen tellen met hemocytometer op dit moment.
    9. Om cellen te bereiden op het implantaat, combineer 0,5 x 10 6 getransduceerde CD34 + cellen met 4,5 x 10 6 CD34-cellen per muis, aliquot in steriele 1,5 ml schroefdop buizen. Spin de cellen neer op 300 xg om ze pellet, aspireren supernatant. Spin ze weer bij 300 g en zuig eventuele resterende supernatant met behulp van een P10 pipet en opzuigen zeer carefully. Houd de droge korrels op het ijs gedurende het onderzoek. Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de cellen levensvatbaar zijn, gebruik maken van de gepelleteerde cellen en het uitvoeren van de operatie binnen 2-3 uur.
    10. Om cellen te bereiden voor injectie, spinnen 0,5 x 10 6 getransduceerde CD34 + cellen per muis om ze pellet, aspireren supernatant. Resuspendeer cellen in 100 ul RPMI media per muis en blijf op ijs.
    11. Transductie efficiëntie controleren aliquot ~ 1 x 10 5 niet-getransduceerde en getransduceerde CD34 + cellen uit elke conditie plekken in 200 pl cytokine medium (RPMI medium met 10% FBS, aangevuld met 100 ng / ml humaan IL-3, IL-6 SCF) in 96-well plaat gedurende 5-7 dagen bij 37 ° C.
      OPMERKING: Cellen die in deze stap wordt niet gebruikt voor chirurgie, maar dat transductie Voor een succesvolle en de vector niet toxisch voor stamceltransplantatie overleving en vernieuwing. Transductie efficiëntie kan worden gecontroleerd door te kijken naar genexpressie van de vector (bijv. GFP en CD4) en geanalyseerd door flowcytometrie.
  3. Tissue Transplantaties naar genetisch gemanipuleerde muizen Construct
    1. Op dezelfde dag voorafgaand aan de operatie uit te voeren total body bestraling van de NOD.Cg- Prkdc scid Il2rg t m1Wjl / SZJ (NSG) immuungecompromiteerd muizen met een Cesium-137 bestraler en een dosering van 2,7 Gy (270Rad).
      LET OP: De NSG muizen zijn ernstig verzwakt immuunsysteem. Dus hun huisvesting en onderhoud moeten voldoen aan de hoogste norm voor de gezondheid en behandeld door hoog opgeleid personeel.
    2. Pour thymus stukken en medium uit de kolf in een 60 mm schaal. Giet PBS in een 60 mm schaal, die wordt gebruikt om de trochar reinigen en houden de nier nat.
    3. Chill positieve verplaatsing pipet tips door ze te plaatsen in de open 1,5 ml steriele schroefdop buizen op ijs. Blijf op ijs met de gedroogde celpellets en geleiachtige eiwitmengsel, zoals Matrigel.
      NB: Het is belangrijk om de geleiachtige eiwitmengsel en eventuele buizen of tips te houden datzal raken het koud te allen tijde tot de naald implantaat wordt geladen.
    4. Verdoven de muizen: Weeg muizen individueel en opnemen gewichten; oor punch de muizen ze tellen. Injecteren intraperitoneaal met 15 gl ketamine (2,6 mg / ml in zoutoplossing) / xylazine (100 mg / ml in zoutoplossing) per gram lichaamsgewicht). Leg de muizen terug in de kooi en wacht tot hij volledig kan worden verdoofd.
      OPMERKING: Controleer de verdoving niveau van de muis door te knijpen een poot. Als de muis reflex flinches toedienen 25-50% van de oorspronkelijke hoeveelheid ketamine / xylazine de muis verder verdoven. Wacht tot het niet reflexmatig terugdeinzen om de operatie uit te voeren.
    5. Met behulp van de Oster clipper (scheerapparaat), scheren de linker kant van elke muis van heup tot schouder tussen het midden van de rug en de maag. Subcutaan injecteren 0,3 ml van de verdunde Carprofen (6 mg / kg) in de schouder van het dier of inguïnale driehoek (been put). Met behulp van een wattenstaafje, zet een kleine daling van kunsttranenop elk oog en leg de muis op zijn kant terug in de kooi.
      OPMERKING: Beperk chirurgie prep een kooi (ongeveer 4-5 muizen) per keer.
    6. Spoel de canule van de 16 gauge kanker implantaat naald (trocar) met PBS. Met een paar gebogen stompe tang, plaats een stuk thymus van 60 mm schaal in de opening van de canule van de trocar net binnen de opening, trek terug op de trocart om het weefsel te zuigen in de canule.
    7. Gebruik een positieve verplaatsing pipet en een gekoelde tip om 5 ul van koude geleiachtige eiwit mengsel in de buis gebracht met een gedroogde celpellet (CD34 + en CD34-mengsel geïmplanteerde cellen) en roer voorzichtig om celsuspensie te genereren. Niet pipet op en neer. Pipetteer de gelatineuze proteïnemengsel / celsuspensie in de opening van de canule en trek terug op de trocart om de naald te laden.
      OPMERKING: Het wordt aangeraden om een ​​helper om de pipet te laden terwijl één manipuleert het implantaat naald hebben.
      8. <li> Veeg het geschoren gebied van de muis met Povidonjodium en vervolgens veeg het gebied met een alcoholdoekje drie keer. Bepaal de donkerste plek onder de huid. Dit geeft de locatie van de milt. De nier is ongeveer 5 mm dorsaal de milt. Til de huid met gebogen pincet en een 15 mm lange incisie met chirurgische schaar in de huid parallel aan de milt. Maak dan een vergelijkbare verlaging van het buikvlies laag onder. Bij mannen dient de nieren gemakkelijk zichtbaar zijn, en kan eenvoudig worden geëxtrudeerd door op de buik. U kunt de nier met een hemostaat of een paar gebogen stompe tang ondersteunen. Bij vrouwen, de eierstokken hebben de neiging om de nier van eenvoudige extractie blokkeren. Met behulp van een hemostat, pak de eierstok en zorgvuldig bloot uit de nier.
    8. Gebruik de naald getipt tang om een ​​klein gaatje te plukken aan het achterste einde van de nier capsule.
      LET OP: Gebruik deze naald getipt tang om biologisch gevaarlijk materiaal te verwerken.
    9. Schuif het implantaatnaald in het gat en langs de nier tot aan de opening van de canule volledig onder de nier capsule.
    10. Voorzichtig extrusie van het weefsel onder de nier capsule, en trek de naald terug te krabbelen. De thymus stukken kunnen sticky dus gebruik maken van een gebogen pincet om ervoor te zorgen dat de thymus stuk komt niet uit met de naald te zijn.
    11. Til het buikvlies met de tang en voorzichtig gebruik maken van de hemostaat om de nier terug te duwen op zijn plaats. Bind een dubbel-geknoopt steek in het buikvlies met behulp van 4-0 Vicryl absorbeerbare hechtingen. Gebruik twee autoclips wond clips om de huid te sluiten.
    12. Meng de getransduceerde CD34 + cellen die gereserveerd werden voor injectie en opname 100 pi (0.5x10 6 cellen) in een insulinespuit. Injecteer deze cellen in de muis door retro-orbitale veneuze injectie of andere routes van intraveneuze injectie. Met behulp van een wattenstaafje, zet een kleine daling van kunsttranen op elk oog en leg de muis op zijn kant weer in een kooi.
    13. Zodra alle muizen bEen geïmplanteerde, bevestigen dat de dieren weer bij bewustzijn en ambulating normaal voor hen verlaten.
    14. Postoperatieve zorg: De dag na de operatie, subcutaan injecteren 0,3 ml verdunde Carprofen (6 mg / kg) en 1,2 ml steriele zoutoplossing in elke muis. 2 en 3 dagen na de operatie, subcutaan injecteren 1,5 ml steriele zoutoplossing in elke muis. Controleer de muizen en de insnijdingen gedurende 10-14 dagen na de operatie. Verwijder de autoclips en wegen van de muizen na 10-14 dagen. LET OP: Muizen zijn traag na bestraling en de injectie van zout voorkomt dat de dieren steeds uitgedroogd.
    15. Na 8-10 weken, check het aanslaan door bloeden de muizen en het uitvoeren van FACS analyse van het perifere bloed, kleuring voor markers zoals CD45, CD3, CD4, CD8, en alle genen van de vector moeten verwoorden.

2. Karakterisering van Differentiatie en Ontwikkeling van Gene gemodificeerde cellen

  1. karakterisering vanGene gemodificeerde cellen uit perifeer bloed
    1. 8 - 10 weken na transplantatie verkrijgen 50-100 pi muizenbloed van retro-orbitale bloeding. Plaats in microcentrifuge buisjes die 10 pl EDTA. Centrifugeer cellen bij 350 g gedurende 3 min. Verzamel plasma. Invriezen bij -80 voor ELISA analyse of viral load test als de muis HIV geïnfecteerd.
    2. Voeg 2 ml oplossing NH4Cl (83%) om rode bloedcellen te lyseren. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (25 ° C). Na de incubatie, voeg 10 ml RPMI 10% FBS aan de buis te vullen. Spin bij 300 xg gedurende 5 minuten. Zuig supernatant zorgvuldig. Cellen klaar zijn voor immuno-kleuring en flowcytometrie-analyse en andere testen.
      OPMERKING: Markers van verschillende hematopoëtische cellijnen, activatie en fenotypische merkers voor naïeve of geheugencellen kan worden gemeten om de 2 weken voor en na HIV-infectie door flowcytometrie. Poorten worden gecreëerd door de gekleurde cellen met isotype controles. Het wordt aanbevolen om healt vlekhy menselijke PBMCs en het gebruik dat als een positieve controle. Als alternatief kunnen muizen worden gedood en tot 1 ml perifeer bloed te verkrijgen bij hartpunctie die voldoende cellen zal zorgen voor meerdere panelen doorstroomanalyse 17.
  2. Karakterisering van Gene gemodificeerde cellen van milt, thymus en beenmerg
    1. Harvest milt, thymus en beenmerg van de gehumaniseerde BLT Muizen
      1. Euthanaseren muizen met een overdosis van isofluraan. Bevestig euthanasie met secundaire cervicale dislocatie. Spray het oppervlak van het karkas met 70% ethanol om bont te houden van het vasthouden aan weefsels. Vastpinnen de ledematen op een wax dissectie lade.
      2. Gebruik chirurgische schaar, opengesneden de huid, en vervolgens dwars door de peritoneale laag om de lichaamsholte bloot te leggen.
      3. Verwijder de milt behulp van een tang. Verwijder de thymus implantaat op de nier met behulp van pincet en schaar. Doe de thymus implantaat en de milt in geëtiketteerde buizen Containing 5 ml PBS.
      4. Vanaf medio buik snijden en de huid te verwijderen uit het distale deel van de muis over de onderste ledematen.
      5. Afgesneden van de spieren van de onderste ledematen met een schaar en zorgvuldig ontwrichten de heupkom van het heupgewricht. Verwijder de femur en de tibia en plaats ze in een buis met 5 ml PBS.
    2. Isolatie van Splenocyten
      1. Plaats een 100 urn cel zeef op een 50 ml conische buis. Bevochtig de zeef met 3 ml RPMI medium aangevuld met 10% FBS en Pen / Strep (RPMI compleet medium).
      2. Plaats de milt op de cel zeef. Met de rubber zuiger van een 10 ml injectiespuit, wrijf de milt te dissociëren door de zeef in de 50 ml buis.
      3. Spoel de cel zeef met 5 ml RPMI compleet medium 4 tot 5 keer.
      4. Spin cellen bij 300 xg gedurende 10 min.
      5. Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 5 ml rode bloedcel lysisbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur temperatuur gedurende 10 min. Voeg 20 ml RPMI compleet medium en centrifugeren bij 300 xg gedurende 7 min.
      6. Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml RPMI volledige media en weer te filteren door middel van een 100 um cel zeef. Aantal cellen gebruikt hemocytometer.
        OPMERKING: De cellen kunnen worden gebruikt voor ex vivo assays, flow analyse en rendabele wijze kunnen worden ingevroren voor later gebruik. Voordat celtelling, kan trypan blauw worden gebruikt om het aantal levensvatbare cellen te bepalen.
    3. Isolatie van Human Thymocyten van Implant
      1. Plaats de thymus in 5 ml PBS in een putje van een plaat met 6 putjes. Het gebruik van schone stompe pincet en schaar knippen de thymus in kleine stukjes.
      2. Plaats een gesteriliseerde roestvrijstalen gaas plein in de put. Met de rubber zuiger van een 10 ml injectiespuit, wrijf de thymus stukken op de roestvrijstalen gaas te splitsen de thymus.
      3. Resuspendeer cellen goed en stam door een 100 um cel zeef. Spin cellen bij 300 xg gedurende 10 min.Te schorten cellen in 10 ml RPMI volledige media. Wanneer er klontjes zichtbaar zijn, langs de gesuspendeerd-cellen door middel van een cel zeef opnieuw.
      4. Aantal cellen gebruikt hemocytometer.
        OPMERKING: De cellen kunnen worden gebruikt voor stroomanalyse en rendabele wijze ingevroren voor later gebruik.
    4. Isolatie van Cellen van Bone Marrow
      1. Schoon en steriliseer mortier en een stamper met 70% ethanol. Leg het bovenbeen en onderbeen in de mortel. Voeg 5 ml koude PBS. Gebruik een stamper om de botten te verpletteren tot het PBS wordt lichtroze en bewolkt.
      2. Pipetteer de vloeistof uit het filter mortier en door een 50 uM cel zeef geplaatst op een 50 ml conische buis. Was mortel met 5 ml PBS en herhaal vijf keer totdat PBS duidelijk wordt.
      3. Spin cellen neer op 300 xg gedurende 7 min. Zuig supernatant en resuspendeer in 10 ml RPMI volledige media.
      4. Aantal cellen gebruikt hemocytometer.
        OPMERKING: De cellen kunnen worden gebruikt voor ex vivo assays, flow-analyse en kunnen levensvatbaar bevroren fof later te gebruiken.

3. Functionele karakterisering van Gene gemodificeerde cellen

  1. HIV-infectie en Controle van het virale replicatie Over Time
    1. Na bevestiging van het menselijke immuunsysteem reconstitutie injecteren gewenste hoeveelheid HIV-virus via retro-orbitale veneuze injectie met een insulinespuit. Na een HIV-infectie, het verzamelen van 100 ul perifere bloed via retro-orbitale bloeding om de 2 weken.
    2. Harvest plasma door de stappen in deel 2.1.1 - 2.1.2. Voor HIV viral load-test, uittreksel viraal RNA met behulp van RNA-extractie kit volgens de instructies van de fabrikant en meet viral load door real-time RT-PCR met geschikte primer en probe sets voor het hiv-virus gebruikt 4,8,18,19.
    3. Om cel geassocieerde HIV RNA te meten en te identificeren cellen die actief zijn besmet met HIV, de eerste uit te voeren RBC lysis volgende stappen 2.1.2
    4. Resuspendeer cel suspensie in 1; Ml PBS, verdeel gelijkmatig in twee buizen. Spin bij 300 xg gedurende 5 minuten. Zuig supernatant.
    5. Om cel geassocieerde RNA meten extraheren RNA gebruikmakend van RNA extractie kit volgens instructies van de fabrikant en voert real-time RT-PCR met behulp van geschikte primer en probe sets.
      Opmerking: Het is van belang dat de primer / probe de lentivirus gebruikt om gewijzigde stamcellen niet herkent
    6. Meten HIV geïnfecteerde cellen door stroming, resuspendeer cellen in de andere buis 50 gl FACS buffer en uitvoeren oppervlak vlek met gewenste antilichaam zoals anti-CD45, anti-CD4 en anti-CD3. Na de aanslag op het oppervlak, fix en doorlaatbaar cellen en intracellulair vlek voor gag expressie met behulp van anti-Gag antilichaam (kloon KC57). Voeren flowcytometrie.
  2. Ex Vivo Cytokine Assay van de Gene gemodificeerde cellen van Splenocyten
    1. Harvest splenocyten van muizen zoals beschreven in paragraaf 2.2.2.
    2. Bereid doelcellen. Om de functionele testenheid van CD4 chimere antigen receptor gemodificeerde T-cellen, gebruikt HIV geïnfecteerde T1-cellen als doelwit cellen. Infect T1 cellen met HIV 3 dagen voor de cytokine assay bevestigt HIV infectie door het kleuren van de cellen intracellulair met anti-HIV-gag-antilichaam (kloon KC57). Gebruik T1 geïnfecteerde cellen als controle doelcellen.
    3. Co-incubeer splenocyten met doel of controle cellen bij 1: 1 verhouding overnight. Voor het beste resultaat, het uitvoeren van een titratie (1: 1, 1: 3, 1: 9) van de effector (splenocyten) versus doelcellen (geïnfecteerde T1s). Zo mengen 0,9 miljoen splenocyten in 0,25 ml RPMI volledige media, voeg 0,9, 0,3 of 0,1 miljoen besmette T1 of niet-geïnfecteerde T1s opnieuw gesuspendeerd in 0,25 ml RPMI volledige media.
    4. De volgende ochtend, voeg eiwittransport remmer gedurende 6 uur om eiwittransport te remmen en uitvoeren kleuring extracellulaire merkers en intracellulaire expressie van cytokines zoals eerder beschreven 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont een overzicht van het construeren humanized BLT muizen met gemodificeerde stamcellen. 10 weken na de implantatie werden de muizen gedood om de differentiatie en ontwikkeling van genetisch gemanipuleerde cellen te evalueren. Zoals getoond in figuur 2, zijn meerdere lymfoïde weefsel (bloed, milt, thymus en beenmerg) geoogst uit een muis die was gemodificeerd met CD4ζCAR. De CD4ζCAR gebruikt in dit protocol bevat CD4 chimere antigen receptor en GFP dat door anti-CD4 antilichaam en de expressie van GFP 8 kan worden gedetecteerd. De cellen werden geïsoleerd en gekleurd met antilichaam tegen humaan CD45 en anti-CD4 antilichaam en geanalyseerd door flowcytometrie. GFP en CD4 dubbele positieve cellen werden gedetecteerd, waaruit de aanwezigheid van CD4CAR + cellen in meerdere lymfeweefsel.

De differentiatie van de genetisch gemanipuleerde cellen te onderzoeken, splenocyten werden gekleurd met antilichamen tegen humaan CD45 (lymfocyten), CD3 (T-cellen), CD19 (B-cellen), CD14 (monocyten en macrofagen) en CD337 (NK-cellen). Zoals getoond in figuur 3, CD4ζCAR hematopoietische stamcellen differentiëren in meerdere lijnen.

Om te onderzoeken of CD4CAR gemodificeerde cellen zijn functioneel, we splenocyten gezamenlijk geïncubeerd met doelcellen die CD4CAR cellen zou herkennen (HIV geïnfecteerde of niet-geïnfecteerde cellen T1 T1-cellen als controle). Cellen werden overnacht samen geïncubeerd en het eiwit transport inhibitor werd toegevoegd gedurende nog 6 uur. Daarna werden de cellen gefixeerd en gepermeabiliseerd kleur wordt intracellulaire expressie van cytokinen zoals IFNy en TNFa. Zoals getoond in figuur 4, CAR tot expressie brengen geproduceerd grotere hoeveelheid IFNy en TNFa met geïnfecteerde cellen T1.

load / 54048 / 54048fig1.jpg "/>
Figuur 1: Overzicht van de bouw van gehumaniseerd BLT muizen met gewijzigde stamcellen FT:. Foetale thymus. FL:. Foetale lever Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. CD4 chimere antigen receptor gemodificeerde cellen kan worden gedetecteerd in verschillende lymfoïde weefsels muis met CD4CAR gemodificeerde HSCs werden gedood 10 weken na operatie en verschillende lymfoïde weefsels werden geoogst en de cellen werden gekleurd met anti-humaan CD45 en anti-humaan CD4 antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 3:.. CD4 chimere antigen receptor gemodificeerde cellen kunnen differentiëren in meerdere lijnen Splenocyten van CD4CAR gemodificeerde muizen werden geoogst en gekleurd met antilichamen tegen humaan CD45, CD3, CD19, CD14 en CD337 en geanalyseerd door flowcytometrie Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

figuur 4
Figuur 4:. Ex vivo cytokine assay van CD4 CAR + T-cellen Splenocyten van HIV geïnfecteerde CD4CAR muizen werden gestimuleerd met ofwel HIV geïnfecteerde of niet-geïnfecteerde T1 cellen en hun intracellulaire productie van cytokine wordt getoond. Klik hier om viewa grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met CAR en HSC-gebaseerde engineered immuniteit stroomversnelling naar klinische studies, is het belangrijk om een ​​goede diermodel zorgvuldig worden afgewogen differentiatie en functie van deze gemanipuleerde cellen. In dit protocol beschrijven we de methoden voor de bouw en het testen van vermenselijkte muizen met genetisch gemodificeerde stamcellen engineered tegen HIV. Het is belangrijk om efficiënte transductie van stamcellen voorafgaand aan transplantatie. Vanwege het vermogen van T-cellen te prolifereren bij herkenning van doelcellen, lage stamcellen modificatie voldoende waren om een sterke respons tegen HIV-replicatie 8 te genereren.

Niettemin, de hoge mate van stamcellen modificatie te bereiken, raden we u aan getransduceerde CD34 + cellen in gelatine-achtige proteïne mengsel met autologe thymus in plaats van lever en thymus brokken voor muizen een operatie die elders 13-15 had beschreven. Gelatineuze eiwitmengsel een solubilized weefsel basaal membraan rijk aan extracellulaire matrix eiwitten. Onder normale fysiologische omstandigheden, gelatineuze eiwitmengsel polymeriseren tot een gereconstitueerd, biologisch actieve en stabiele matrix die doeltreffende hechting en differentiatie van de stamcellen 20 zou kunnen veroorzaken. Menselijke cel reconstructie kan worden gecontroleerd door retro-orbitaal bloeden en flowcytometrie 6-8 weken na de ingreep. Opdat de vector niet toxisch voor stamceltransplantatie overleving en vernieuwing, wordt aanbevolen om de vector in CD34 + cellen voorafgaand aan het experiment titreren zoals beschreven in 1.2.6.

De capaciteit van de NSG-BLT muismodel mucosale infectie, consistente viremie en cellulaire immuunreacties ondersteuning maakt het een zeer bruikbaar model om HIV immuun pathologie en cellen gebaseerde therapieën te bestuderen voor de behandeling van HIV-infectie 1. Belangrijker, T-cellen gegenereerd uit de NSG-BLT muizen worden geselecteerd in de autologe thymusweefsel, waarbij de onderzoeker het lot bestuderenvan genetisch gemanipuleerde stamcellen na thymus selectie 8,21. Met de beschreven methode, zijn we in staat om 40% -90% consequent krijgen menselijk afweersysteem cel reconstructie geweest. Lage niveaus van menselijke cel reconstitutie kan het gevolg zijn van meerdere factoren, waaronder de vaardigheden van de persoon die de operatie en de kwaliteit van de weefsels voor transplantatie. Om hoog menselijke cel herstel werd bereikt, is het belangrijk om de transplantaten stevig onder de nier capsule geplaatst waarborgen. Daarnaast is het sterk aan te raden om elke thymus implantaat voorbereid voor een operatie onder lichte microscoop te onderzoeken en gooi twijfelachtige stukken.

Hoewel het gehumaniseerde BLT muismodel is een veelbelovend instrument voor het bestuderen van gemanipuleerde immuniteit tegen HIV (beoordeeld in 1,15,22), het heeft zijn eigen beperkingen. Namelijk, heeft dit model niet volledig nabootsen menselijke perifeer immuunsysteem. Studies hebben aangetoond verminderde ontwikkeling van hyper-gemuteerd-class geschakelde IgG AntiboDY 1,23. Bovendien, het gebruik van immuun-deficiënte muizen is technisch uitdagend en het houden van deze muizen gezond vergt aanzienlijke middelen en training. Subtiele opportunistische infecties kunnen als belangrijke verschillen tussen de monsters te manifesteren en potentieel negatieve gevolgen voor de experimenten. Daarom is het belangrijk om goed voorbereid faciliteiten en adequaat opgeleid personeel om de integriteit van de toekomstige gegevens 1,24 handhaven. Met deze beperkingen in het achterhoofd, het gehumaniseerde NSG-BLT muismodel biedt nog steeds een belangrijk instrument voor de studie van stamcellen gebaseerde gemanipuleerd immuniteit, zoals blijkt uit deze voorbeelden 4,8.

Met de trend ontwikkelen chimeer antigen receptoren op basis van HIV breed neutraliserende antilichamen 10 en modificatie van de signaleringsdomein efficiënter CAR 25 kan dit model en protocol worden gebruikt voor het karakteriseren en onderzoeken van de functionaliteit van de genetisch gemanipuleerde cells met een nieuwe generatie auto's. Bovendien kan dit model potentieel geschikt voor studies op het immuunsysteem gebaseerde therapie (zoals remmende receptor blokkade) in combinatie met gemanipuleerde immuniteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD34 microbead kit Miltenyi 130-046-702 For sorting human CD34+ progenitor cells
Bambanker Wako 302-14681 For freezing cells
QIAamp Viral RNA kit  Qiagen 52904 For measuring viral load in the serum
MACSQuant Flow Cytometer Miltenyi For flow analysis
BD LSRFortessa™ BD biosciences For flow analysis
Hyaluronidase Sigma H6254-500MG  For tissue digestion
Deoxyribonuclease I       Worthington LS002006  for tissue digestion
Collagenase Life technology 17104-019  for tissue digestion
CFX Real time PCR detection system Biorad For measuring viral load and gene expression
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Thermo Fisher Scientific 10378016 For culturing cells
Piperacillin/tazobactam Pfizer Zosyn Anti-fungal
Amphotericin B (Fungizone antimycotic) Thermo Fisher Scientific 15290-018 Anti-fungal
Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units Becton Dickinson 427631  For surgery
Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case       Medline DYNJP2707  For surgery
Sutures, 4-0, vicryl           Owens and Minor 23000J304H   For surgery
Alcohol prep pads           Owens and Minor 3583006818 For surgery
Gloves, surgical, 6 1/2 Owens and Minor 4075711102 For surgery
Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium Gemini Bio-products 400-102 For CD34+ cell transduction
Human Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9511 For CD34+ cell transduction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  2. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
  3. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  4. Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
  5. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  6. Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
  7. Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
  8. Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  9. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
  10. Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
  11. Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
  12. West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
  13. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  14. Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  15. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  16. Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
  17. De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
  18. Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  19. Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  20. Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
  21. Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
  22. Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
  23. Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
  24. McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
  25. Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).

Tags

Geneeskunde gehumaniseerde BLT muis chimere antigen receptor HIV non-obese diabetische menselijke leukocyt antigen hematopoietische stamcellen
Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, A., Rezek, V., Youn, C., Rick, … More

Zhen, A., Rezek, V., Youn, C., Rick, J., Lam, B., Chang, N., Zack, J., Kamata, M., Kitchen, S. Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (113), e54048, doi:10.3791/54048 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter