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Summary

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount β-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Abstract

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

Introduction

Over the past few years, there has been a widening appreciation for the influence of nerves on diseases not typically regarded as classical neuropathies^1-4. In the skin, recent experimental evidence has suggested that sensory nerves can modulate diverse pathologies ranging from psoriasis to cancer^5-9. This has been demonstrated using techniques such as surgical denervation and pharmacological inhibition of neural function in rodents. In the case of psoriasis, these studies have provided a mechanistic framework for understanding why human psoriatic plaques regress following loss of neural function^7,10-12.

Cutaneous nerves can also affect gene expression^13,14 and are critical for mechanosensing in normal skin¹⁵. In particular, touch dome (TD) epithelia are comprised of a patch of columnar epidermal cells in juxtaposition with neuroendocrine Merkel cells innervated by slowly adapting type 1 (SA1) nerve fibers^16-18. TDs mediate light touch sensation and have been shown to display Hedgehog pathway activity^5,19. TD maintenance depends on innervation^20,21, as nerves secrete Hedgehog ligands to sustain normal TDs and their associated Merkel cells¹⁹. In addition, innervation promotes Hedgehog-dependent tumor formation from TD epithelia⁵. Together, these studies reinforce the notion that intricate molecular interactions occurring between nerves and the surrounding cells in their niche are crucial for normal TD physiology as well as disease.

To interrogate the nature of these interactions, we describe here a series of in vivo techniques for manipulating gene expression in the TD, as well as for harvesting skin biopsies for TD visualization after lineage tracing. Finally, we describe procedures for performing unilateral surgical denervation, wherein nerves are removed from one side of the mouse dorsal skin, while leaving the contralateral side intact as a sham internal control. Several weeks after surgery, denervated and sham control skin are compared to assess changes that occur when nerves are ablated. Although these techniques are described in the context of normal TDs, the denervation procedure has been used to examine the requirement for nerves in mouse models of psoriasis⁶, wound healing¹³ and tumorigenesis⁵. Finally, since the skin is amenable to repeated biopsies, this provides an opportunity to monitor the long-term fates of labeled cells or to assess disease progression over multiple time points.

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com os regulamentos estabelecidos pela Universidade de Michigan Unidade de Medicina Laboratorial Animal. 1. Induzir recombinação genética em ratos Nota: O Gli1 tm3 (cre / ERT2) ALJ / J estirpe de ratinhos (Gli1-CreERT2) 13 permite a segmentação de recombinação genética induzida pelo tamoxifeno para TD epitélios. Atravesse esta estirpe com B6.129S4-Gt (ROSA) ratos repórter 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 para gerar Gli1; ​​animais LacZ para visualizar as células TD por whole-mount coloração abaixo. Preparar a solução de tamoxifeno a uma concentração de 12,5 mg / ml em óleo de milho. Em um tubo de 1,5 ml, adiciona-se a 20 mg de tamoxifen cristalinos, e, em seguida, 1 ml de óleo de milho. Firmemente fita do tubo para um misturador vortex e vortex continuamente ao mais alto ajuste à temperatura ambiente até que o tamoxifeno foi totalmente dissolvido (2-4 hr), comoconfirmado por exame do tubo sob um microscópio de dissecação para a ausência de partículas de tamoxifeno. Transferir a solução para um tubo de 15 ml e diluir o tamoxifeno para uma concentração final de 12,5 mg / ml, com o óleo de milho adicional. Misturar em vortex a solução viscosa durante mais 30 segundos adicionais. Conserva-se a solução durante até 1 semana a 4 ° C no escuro. Injectar a solução de tamoxifeno por via intraperitoneal em Gli1; ​​ratinhos LacZ, a um volume de 200 mL por 20 g de peso corporal do rato, para uma dose eficaz de tamoxifeno 2,5 mg por 20 g de peso do rato. 2. biópsias de pele de colheita Nota: Dependendo do experimento, biópsias de pele colheita vários dias ou semanas após a indução tamoxifeno. Para todas as cirurgias, siga protocolos padrão para a cirurgia de roedores, incluindo o uso de luvas estéreis, vestindo uma máscara ou cirúrgica do cabelo net, e cobrindo o animal com um campo cirúrgico esterilizado durante o procedimento. Prepare 10x solução de anestésico através da mistura de 90 mg / ml de cetamina e 6,5 mg / ml de xilazina na água. Dilui-se esta solução de 1:10 em PBS estéril imediatamente antes da utilização, e armazenar à TA no escuro durante até 8 meses. Alternativamente, anestesiar os ratos por inalação de isoflurano, começando com uma concentração de gás de 4% com oxigénio para anestesiar completamente o animal, e, em seguida, subsequentemente, reduzindo isto a 1-2% para a duração do processo. Injectar a solução de anestésico por via intraperitoneal numa dose de 200 ul por 20 g de peso corporal do rato. Verifique se o animal atingiu o plano adequado de sedação por ensaio toe pitada, e confirmar que freqüências cardíaca e respiratória são normais (aproximadamente 600 batidas e 160 respirações por minuto, respectivamente). Use um aparador elétrico para remover os pêlos do local da biópsia na pele dorsal de volta, tomando cuidado para não nick ou danificar a pele subjacente. Prepare o local da cirurgia, limpando o barbearárea de d em um sentido ântero-a-posterior usando Betadine e álcool toalhetes. Assegurar que todos os recortes de cabelo são removidos do local. Delinear o local da biópsia usando um marcador preto, colocar o animal em uma almofada de aquecimento em uma área cirúrgica asséptica, e cobrir com uma cortina cirúrgica estéril (para fins de demonstração, cortina estéril foi omitido para aumentar a visibilidade). Nota: Para obtenção de cortes longitudinais de folículos de cabelo, a mais borda da biópsia (a extremidade a ser cortada para a histologia, ~ 1 cm) deve ser executado numa direcção ântero-posterior (paralela à direcção dos folículos pilosos), parassagitais a a linha média dorsal (Figura 1A). Use um estéril # 11 bisturi para fazer uma excisão espessura total ao longo da área marcada sem danificar a fáscia muscular subjacente. Nota: O tecido da pele excisada inclui a epiderme, a derme, e a gordura subcutânea panículo carnoso. Sangramento é normalmente mínimo. achatar tele extirpou amostra de pele em uma toalha de papel seco, derme lado para baixo, aparar o excesso de toalha de papel, e armazenar a amostra em PBS frio por até 1 hora se outras amostras precisam ser coletadas. Quando estiver pronto, prossiga para Passos 3.1 ou 3.2 para processar amostras para histologia ou Passo 4 para β-galactosidase (LacZ) coloração todo-mount. Sutura fechar o local da biópsia usando 6-0 nylon, em um padrão simples interrompido espaçadas a cerca de 3 mm. Não devolva os ratos que foram submetidos a cirurgia na mesma gaiola como outros animais até após a recuperação completa. Monitorar os animais imediatamente após a cirurgia até que recupere a consciência, e também diariamente até a área cirúrgica foi curado, geralmente dentro de uma semana. Use analgésicos de acordo com orientações de cuidados de animais e uso institucional designados se os ratos apresentam sinais de dor ou angústia. Remover suturas dentro de 7-10 dias após a cirurgia. Nota: Se for necessário, preparar a solução analgésica diluindo carprofeno (50 mg / ml da solutião) 1: 100 em água estéril. Injectar a solução por via subcutânea entre as omoplatas perto da nuca do pescoço, a uma dose de 200 ul por 20 g de peso corporal (5 mg / kg de peso corporal do rato). 3. As amostras de processo para histologia Nota: Para corrigir e processar o tecido excisado, use um método abaixo dependendo da aplicação. Para gerar amostras histológicas embebidos em parafina, corrigir a pele em 3,7% de formalina em PBS O / N à temperatura ambiente e armazenar em 70% de etanol por até 2 semanas. Retire o papel toalha antes de embutir em parafina. Para a gerao de amostras histológicas congelados, submergir o tecido no frio paraformaldeído 4% em PBS e agitar suavemente durante 1 h. Remover a solução e lava-se a amostra com 3 mudas de PBS, cerca de 5 minutos cada. Em seguida, mergulhe a amostra em 30% de sacarose em PBS para cryoprotect o tecido ( "afundamento sacarose"). Incubar com agitação suave O / N a 4 ° C. No dia seguinte, retire o papel de reboqueel e aparar o excesso de tecido adiposo do lado do dérmica da pele. Incorporar o tecido directamente para outubro e armazenar o bloco congelado a -80 ° C. Nota: Após o corte, quer parafina ou amostras congeladas pode ser manchado por imuno-histoquímica para identificar TDs, células de Merkel e nervos utilizando anticorpos contra queratina 17, queratina 8 e neurofilamento, respectivamente, como descrito anteriormente 5,19. 4. As amostras Visualize por Whole-mount LacZ Coloração Prepare solução de coloração X-gal. Combinar 0,94 g de fosfato de sódio monobásico, e 2,6 g de fosfato dibásico de sódio em 250 ml de água estéril. Ajustar o pH para 7,3. Para isso, adicionar 0,5 ml de cloreto de magnésio 1 M, 0,528 g de ferrocianeto de potássio, e 0,412 g de ferricianeto de potássio. Adicionar 250 ul de octilfenil-polietileno-glicol e 125 mg de desoxicolato. A solução de base pode ser armazenado a 4 ° C durante até 6 meses no escuro. Prepare 50x banco de soluti X-galem dimetilformamida, adicionando ao frasco de estoque de X-gal para gerar uma solução a 50 mg / ml. Conserva-se a solução a -20 ° C no escuro. Imediatamente antes do uso, dilui-se solução de reserva de X-gal 1:50 em solução de base de X-gal para gerar solução de coloração. Para biópsias mais pequenos (<1 cm 2), alíquotas de 1-2 ml de solução de coloração por amostra. Fixar a amostra de pele recolhida no Passo 2.7 numa solução contendo 2% paraformaldeído / 0,2% de glutaraldeído em PBS frio durante 30 min, agitando suavemente em gelo. Para biópsias mais pequenos (<1 cm 2), utilizar 1-2 ml de solução fixadora por amostra. Nota: Como alternativa, fixar amostras em 2-4% paraformaldeído apenas, ou apenas em glutaraldeído 0,5%. condições de fixação óptimas dependem do tecido, grau de expressão de LacZ e de aplicação. Remover a solução fixadora, e lavar as amostras com 3 mudas de PBS, 5 minutos cada, num agitador à temperatura ambiente. Remover a toalha de papel por baixo da amostra e cortar excess tecido adiposo a partir de lado dérmico da pele ao agarrar a gordura com uma pinça sem corte e de corte com uma tesoura de dissecação. Submergir a amostra na solução de coloração com X-gal, e incuba-se a 37 ° CO / N. Expressão de LacZ será visível como uma mancha azul sob um microscópio de dissecação (Figura 1B). Nota: Se a intensidade do sinal é fraco, substitua a solução de coloração no dia seguinte e repetir o O / N incubação. Se a coloração de fundo é demasiado intensa, reduzir o tempo de coloração, ou incubar a amostra a temperatura ambiente em vez de 37 ° C. Remover a solução de coloração e lavar as amostras em 3 mudas de PBS contendo 3% de DMSO durante aproximadamente 5 min, agitando à temperatura ambiente. Lavar as amostras em 2-3 mudanças de etanol a 70% para 5 minutos cada. Armazene as amostras em 70% de etanol. 5. A desnervação cirúrgica Anestesiar o animal como no Passo 2.2 e raspar a pele dorsal inteiro. Prepare a área cirúrgica of a pele de volta usando Betadine e toalhetes com álcool, e cobrir o animal com um campo cirúrgico estéril (para fins de demonstração, cortina estéril foi omitido para aumentar a visibilidade). Manter o animal aquecido usando uma almofada de aquecimento durante a operação em uma área cirúrgica asséptica. Realizar uma incisão utilizando um bisturi estéril # 11 ao longo da linha média dorsal desde a base do pescoço até cerca de 0,5 centímetros acima da cauda. Usando fórceps rombas, reflectir suavemente a pele sobre o lado esquerdo longe do flanco para visualizar o tecido subjacente das almofadas de gordura escapular perto do pescoço até imediatamente acima do membro posterior. Nota: os nervos dorsais cutâneas aparecem como fios brancos que viajam caudalmente translúcida através da faseia da parede do tronco antes de fazer curvas apertadas e entrar no tecido conjuntivo frouxo debaixo da pele (Figura 2). Usando fórceps ultra-finos sob um microscópio de luz dissecando, remover os nervos exclusivamente a partir do lado esquerdo da animal localizados em locais anatômicos T3-12 por arrancar a partir de onde a segmentos de curva na parede do tronco para seus locais de entrada na pele (Figura 2). Fórceps orientar verticalmente e remover os nervos agarrando aproximadamente 0,5 cm abaixo dos seus locais de curvatura e puxando para cima, fazendo com que o nervo para esticar e separar a partir do tecido circundante (Figura 2C – E). Tenha cuidado para evitar a ruptura dos vasos sanguíneos adjacentes. Continuar até que todos os nervos que se estendem a partir da parede do tronco para a pele são removidos. Não perturbar os nervos no interior da fáscia densa da parede do tronco. Manter o tecido húmido em todo o processo por aplicação periódica de gotas de solução salina estéril a 0,9%. Como alternativa, remova nervos, segurando suas extremidades proximais perto da parede do tronco com uma pinça e cortando com uma tesoura fina. Em seguida, cortar as extremidades distais perto da pele (Figuras 2F – H). Finalmente, remova o intervening segmentos de nervo (Figura 2I). Remova todos os nervos do retalho de pele exposta no Passo 5.4. Estas fibras compreendem os ramos distais dos nervos cutâneos dorsais e aparecem como fios de ramificação brancos localizados esporadicamente dentro do tecido conjuntivo no lado dérmico do retalho de pele (Figuras 2J – K). Para remover esses galhos finos, posicione a pinça fina mais ou menos paralelo à superfície da derme, segure os nervos e arrancar para cima, para evitar perturbar os vasos sanguíneos e perfurar a pele. Continuar até que todos os nervos visíveis tenham sido removidos. Utilizando uma dissecção romba, reflectir a pele do lado direito da linha média dorsal incisão, mas não remover os nervos. Isto irá servir como o controle sham-operados contralateral. Sutura ao longo da linha média dorsal, em um teste padrão simples interrompido para fechar a incisão. Monitorar o animal durante a recuperação e pós-opertivamente como já foi demonstrado (Passos 2,8-10). Remover suturas dentro de 7-10 dias após a cirurgia. Para avaliar funcionalmente estável desnervação até várias semanas após a cirurgia, remover os pêlos da pele dorsal usando um aparelho eléctrico. Gentilmente picar a área da pele desnervado usando uma agulha hipodérmica, e observar se o animal responde, normalmente estremecendo ou virar a cabeça. Se a área da pele foi desnervado de forma estável, o animal vai exibem pouca ou nenhuma resposta. Utilizando um marcador de preto, o contorno da área de não resposta, assim como uma área de tamanho e local semelhante no lado contralateral sham. Recolha biópsias a partir destes sites que nos Passos 2.1-2.9 para análise. Observação: Como alternativa, toda a pele dorsal para trás, incluindo as regiões desnervados e operados por simulação, pode ser removido como uma única folha para montagem inteira-coloração, semelhante ao descrito no Passo 4.

Representative Results

Por ratinhos que expressam gerando tamoxifeno induzível Gli1-CreERT2 e um alelo repórter LacZ, é possível visualizar TD epitélios e rastrear o destino destas células ao longo do tempo. O procedimento de desnervação inteira normalmente pode ser concluída dentro de 1 hora por rato e deve causar desconforto mínimo para o animal. Os nossos estudos anteriores têm indicado que os nervos são cruciais par…

Discussion

Nervos desempenham funções cruciais não só na sensação, mas também no desenvolvimento de órgãos de mamíferos, manutenção e regeneração ^13,24-27. Como nervos recentemente têm sido implicados em diversas doenças de pele, as técnicas descritas aqui podem ser usadas para estudar a exigência de inervação numa variedade de modelos de doenças animais. Na verdade, a técnica desnervação unilateral permite a comparação directa da pele quer com os nervos intactos ou interromperam a partir do me…

Materials

Alcohol prep pads	PDI	B339
AnaSed (Xylazine)	Lloyd	NADA 139-236
Antibody, anti-Keratin 8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I	rat antibody, use at 1:500 concentration
Antibody, anti-Keratin 17	Cell Signaling	#4543	rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration
Antibody, anti-Neurofilament	Cell Signaling	C28E10	rabbit antibody, use at 1:500 concentration
Betadine prep pads	Medline	MDS093917
Carprofen (Rimadyl)	Zoetis
Cordless rechargable clipper	Wahl	trimmer model 8900
Corn Oil	Sigma-Aldrich	C8267
Cryostat	Leica	CM1860
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306	use at 1:1000 concentration
Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Depilatory Cream	Nair	N/A
Dimethylforamide	Sigma-Aldrich	319937
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
ImmEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Ketamine HCl	Hospira	NDC 0409-2051-05
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Micro cover glass	VWR	48404-454
Micro Slides	VWR	48311-703
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-4LP
6-0 nylon sutures	DemeTECH	NL166012F4P
Octylphenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	I8896
O.C.T. Compound	Sakura Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Pottasium ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Pottasium ferricyanide	Sigma-Aldrich	702587
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S5136
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
Ultra fine forceps	Dumont	0103-5-PO
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
X-gal	Roche	10 651 745 001	Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use