A desnervação cirúrgica cutânea: um método para testar o requisito para os nervos no mouse modelos de doença de pele

Summary

Este artigo inclui protocolos detalhados para marcação genética de pele de camundongo, denervação cirúrgica, biópsia de pele e visualização de epitélios marcados por coloração de β-galactosidase de montagem total. Esses métodos podem ser usados para testar a necessidade de nervos em modelos de camundongos de pele normal e patológica.

Abstract

Os nervos somatossensoriais cutâneos funcionam para detectar diversos estímulos que atuam sobre a pele. Além de seus papéis sensoriais estabelecidos, estudos recentes sugeriram que os nervos também podem modular distúrbios da pele, incluindo dermatite atópica, psoríase e câncer. Aqui, descrevemos protocolos para testar a necessidade de nervos na manutenção de um órgão mecanossensorial cutâneo, a cúpula de toque (TD). Especificamente, discutimos métodos para rotular geneticamente, colher e visualizar TDs por coloração de montagem inteira e para realizar denervação cirúrgica unilateral na pele dorsal dorsal do camundongo. Juntas, essas abordagens podem ser usadas para comparar diretamente a morfologia do TD e a expressão gênica em pele desnervada e operada por simulação do mesmo animal. Esses métodos também podem ser prontamente adaptados para examinar a necessidade de nervos em modelos de camundongos de patologia da pele. Finalmente, a capacidade de coletar amostras repetidas da pele oferece uma oportunidade de monitorar a progressão da doença em diferentes estágios e momentos após o início.

Introduction

Nos últimos anos, tem havido uma crescente valorização da influência dos nervos em doenças que não são tipicamente consideradas neuropatias clássicas^1-4. Na pele, evidências experimentais recentes têm sugerido que os nervos sensoriais podem modular diversas patologias, desde a psoríase até o^câncer5-9. Isso foi demonstrado usando técnicas como denervação cirúrgica e inibição farmacológica da função neural em roedores. No caso da psoríase, esses estudos forneceram uma estrutura mecanicista para entender por que as placas psoriáticas humanas regridem após a perda da função neural^7,10-12.

Os nervos cutâneos tam....

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com os regulamentos estabelecidos pela Universidade de Michigan Unidade de Medicina Laboratorial Animal.

1. Induzir recombinação genética em ratos

Nota: O Gli1 ^{tm3 (cre / ERT2) ALJ} / J estirpe de ratinhos (Gli1-CreERT2) ¹³ permite a segmentação de recombinação genética induzida pelo tamoxifeno para TD epitélios. Atravesse esta estirpe com B6.129S4-Gt (ROSA) ratos repórter 26Sor ^tm1Sor / J (LacZ) ²² para gerar Gli1; ​​animais LacZ para vis....

Results

Por ratinhos que expressam gerando tamoxifeno induzível Gli1-CreERT2 e um alelo repórter LacZ, é possível visualizar TD epitélios e rastrear o destino destas células ao longo do tempo. O procedimento de desnervação inteira normalmente pode ser concluída dentro de 1 hora por rato e deve causar desconforto mínimo para o animal.

Os nossos estudos anteriores têm indicado que os nervos são cruciais para manter amb.......

Discussion

Nervos desempenham funções cruciais não só na sensação, mas também no desenvolvimento de órgãos de mamíferos, manutenção e regeneração ^13,24-27. Como nervos recentemente têm sido implicados em diversas doenças de pele, as técnicas descritas aqui podem ser usadas para estudar a exigência de inervação numa variedade de modelos de doenças animais. Na verdade, a técnica desnervação unilateral permite a comparação directa da pele quer com os nervos intactos ou interromperam a partir do mesmo rato. Isto proporciona.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Almofadas de preparação de álcool	PDI	B339
AnaSed (Xilazina)	Lloyd	NADA 139-236
Anticorpo, anti-queratina 8	Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma	TROMA-I	anticorpo de rato, uso na concentração de 1:500
Anticorpo, anti-queratina 17	Cell Signaling	#4543	anticorpo de coelho, uso na concentração de 1:1.000
Anticorpo, anticorpo de coelho anti-Neurofilamento	Cell Signaling	C28E10	, use na concentração de 1:500
Almofadas de preparação Betadine	Medline	MDS093917
Carprofeno (Rimadyl)	Zoetis
Máquina de cortar cabelo recarregável sem fio	Aparador Wahl modelo 8900
Óleo de milho	Sigma-Aldrich	C8267
Cryostat	Leica	CM1860
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306	uso na concentração de 1:1.000
Desoxicolato	Sigma-Aldrich	D6750
Creme Depilatório	Nair	N/A
Dimetilforamida	Sigma-Aldrich	319937
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Glutaraldeído	Sigma-Aldrich	G5882
ImmEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Cetamina HCl	Hospira	NDC 0409-2051-05
Cloreto de magnésio	Sigma	M8266
Micro vidro de cobertura	VWR	48404-454
Micro Slides	VWR	48311-703
Suturas de nylon 10% Neutral Buffered	Formalina VWR	BDH0502-4LP
6-0	DemeTECH	NL166012F4P
Octylphenyl-polietilenoglicol	Sigma-Aldrich	I8896
O.C.T. Composto	Sakura Tissue-Tek	4583
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	158127
Pottasium ferrocianeto	Sigma-Aldrich	P9387
Ferricianeto de potássio	Sigma-Aldrich	702587
Fosfato de sódio monobásico	Sigma-Aldrich	P9791
Fosfato de sódio dibásico	Sigma-Aldrich	S5136
Sacarose	Sigma-Aldrich	84097
Tamoxifeno	Sigma-Aldrich	T5648-1G
Pinça ultrafina	Dumont	0103-5-PO
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
X-gal	Roche	10 651 745 001	Disolve in dimethylforamide para criar estoque de 50x antes do uso