Artigo de método

A desnervação cirúrgica cutânea: um método para testar o requisito para os nervos no mouse modelos de doença de pele

DOI:

10.3791/54050

⸱

26 de junho de 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo inclui protocolos detalhados para marcação genética de pele de camundongo, denervação cirúrgica, biópsia de pele e visualização de epitélios marcados por coloração de β-galactosidase de montagem total. Esses métodos podem ser usados para testar a necessidade de nervos em modelos de camundongos de pele normal e patológica.

Resumo

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Os nervos somatossensoriais cutâneos funcionam para detectar diversos estímulos que atuam sobre a pele. Além de seus papéis sensoriais estabelecidos, estudos recentes sugeriram que os nervos também podem modular distúrbios da pele, incluindo dermatite atópica, psoríase e câncer. Aqui, descrevemos protocolos para testar a necessidade de nervos na manutenção de um órgão mecanossensorial cutâneo, a cúpula de toque (TD). Especificamente, discutimos métodos para rotular geneticamente, colher e visualizar TDs por coloração de montagem inteira e para realizar denervação cirúrgica unilateral na pele dorsal dorsal do camundongo. Juntas, essas abordagens podem ser usadas para comparar diretamente a morfologia do TD e a expressão gênica em pele desnervada e operada por simulação do mesmo animal. Esses métodos também podem ser prontamente adaptados para examinar a necessidade de nervos em modelos de camundongos de patologia da pele. Finalmente, a capacidade de coletar amostras repetidas da pele oferece uma oportunidade de monitorar a progressão da doença em diferentes estágios e momentos após o início.

Introdução

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Nos últimos anos, tem havido uma crescente valorização da influência dos nervos em doenças que não são tipicamente consideradas neuropatias clássicas1-4. Na pele, evidências experimentais recentes têm sugerido que os nervos sensoriais podem modular diversas patologias, desde a psoríase até ocâncer5-9. Isso foi demonstrado usando técnicas como denervação cirúrgica e inibição farmacológica da função neural em roedores. No caso da psoríase, esses estudos forneceram uma estrutura mecanicista para entender por que as placas psoriáticas humanas regridem após a perda da função neural7,10-12.

Os nervos cutâneos também podem afetar a expressão gênica13,14 e são críticos para o mecanosensing na pele normal15. Em particular, os epitélios de cúpula de toque (TD) são compostos por um pedaço de células epidérmicas colunares em justaposição com células neuroendócrinas de Merkel inervadas por fibras nervosas do tipo 1 (SA1) de adaptação lenta16-18. Os TDs medeiam a sensação de toque leve e demonstraram exibir a atividade da via Hedgehog5,19. A manutenção da DT depende da inervação20,21, pois os nervos secretam ligantes Hedgehog para sustentar as DTs normais e suas células de Merkel associadas19. Além disso, a inervação promove a formação de tumor dependente de Hedgehog a partir do epitélio TD5. Juntos, esses estudos reforçam a noção de que as intrincadas interações moleculares que ocorrem entre os nervos e as células circundantes em seu nicho são cruciais para a fisiologia normal da DT, bem como para a doença.

Para interrogar a natureza dessas interações, descrevemos aqui uma série de técnicas in vivo para manipular a expressão gênica no DT, bem como para colher biópsias de pele para visualização do DT após o rastreamento da linhagem. Finalmente, descrevemos procedimentos para realizar a denervação cirúrgica unilateral, em que os nervos são removidos de um lado da pele dorsal do camundongo, deixando o lado contralateral intacto como um controle interno simulado. Várias semanas após a cirurgia, a pele desnervada e a pele de controle simulado são comparadas para avaliar as alterações que ocorrem quando os nervos são ablacionados. Embora essas técnicas sejam descritas no contexto de DTs normais, o procedimento de desnervação tem sido usado para examinar a necessidade de nervos em modelos de camundongos de psoríase6, cicatrização de feridas13 e tumorigênese5. Finalmente, como a pele é passível de biópsias repetidas, isso oferece uma oportunidade de monitorar o destino a longo prazo das células marcadas ou avaliar a progressão da doença em vários pontos de tempo.

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Protocolo

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Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com os regulamentos estabelecidos pela Universidade de Michigan Unidade de Medicina Laboratorial Animal.

1. Induzir recombinação genética em ratos

Nota: O Gli1 tm3 (cre / ERT2) ALJ / J estirpe de ratinhos (Gli1-CreERT2) 13 permite a segmentação de recombinação genética induzida pelo tamoxifeno para TD epitélios. Atravesse esta estirpe com B6.129S4-Gt (ROSA) ratos repórter 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 para gerar Gli1; ​​animais LacZ para visualizar as células TD por whole-mount coloração abaixo.

  1. Preparar a solução de tamoxifeno a uma concentração de 12,5 mg / ml em óleo de milho.
    1. Em um tubo de 1,5 ml, adiciona-se a 20 mg de tamoxifen cristalinos, e, em seguida, 1 ml de óleo de milho. Firmemente fita do tubo para um misturador vortex e vortex continuamente ao mais alto ajuste à temperatura ambiente até que o tamoxifeno foi totalmente dissolvido (2-4 hr), comoconfirmado por exame do tubo sob um microscópio de dissecação para a ausência de partículas de tamoxifeno.
    2. Transferir a solução para um tubo de 15 ml e diluir o tamoxifeno para uma concentração final de 12,5 mg / ml, com o óleo de milho adicional. Misturar em vortex a solução viscosa durante mais 30 segundos adicionais. Conserva-se a solução durante até 1 semana a 4 ° C no escuro.
  2. Injectar a solução de tamoxifeno por via intraperitoneal em Gli1; ​​ratinhos LacZ, a um volume de 200 mL por 20 g de peso corporal do rato, para uma dose eficaz de tamoxifeno 2,5 mg por 20 g de peso do rato.

2. biópsias de pele de colheita

Nota: Dependendo do experimento, biópsias de pele colheita vários dias ou semanas após a indução tamoxifeno. Para todas as cirurgias, siga protocolos padrão para a cirurgia de roedores, incluindo o uso de luvas estéreis, vestindo uma máscara ou cirúrgica do cabelo net, e cobrindo o animal com um campo cirúrgico esterilizado durante o procedimento.

  1. Prepare 10x solução de anestésico através da mistura de 90 mg / ml de cetamina e 6,5 mg / ml de xilazina na água. Dilui-se esta solução de 1:10 em PBS estéril imediatamente antes da utilização, e armazenar à TA no escuro durante até 8 meses.
    1. Alternativamente, anestesiar os ratos por inalação de isoflurano, começando com uma concentração de gás de 4% com oxigénio para anestesiar completamente o animal, e, em seguida, subsequentemente, reduzindo isto a 1-2% para a duração do processo.
  2. Injectar a solução de anestésico por via intraperitoneal numa dose de 200 ul por 20 g de peso corporal do rato. Verifique se o animal atingiu o plano adequado de sedação por ensaio toe pitada, e confirmar que freqüências cardíaca e respiratória são normais (aproximadamente 600 batidas e 160 respirações por minuto, respectivamente).
  3. Use um aparador elétrico para remover os pêlos do local da biópsia na pele dorsal de volta, tomando cuidado para não nick ou danificar a pele subjacente.
  4. Prepare o local da cirurgia, limpando o barbearárea de d em um sentido ântero-a-posterior usando Betadine e álcool toalhetes. Assegurar que todos os recortes de cabelo são removidos do local.
  5. Delinear o local da biópsia usando um marcador preto, colocar o animal em uma almofada de aquecimento em uma área cirúrgica asséptica, e cobrir com uma cortina cirúrgica estéril (para fins de demonstração, cortina estéril foi omitido para aumentar a visibilidade).
    Nota: Para obtenção de cortes longitudinais de folículos de cabelo, a mais borda da biópsia (a extremidade a ser cortada para a histologia, ~ 1 cm) deve ser executado numa direcção ântero-posterior (paralela à direcção dos folículos pilosos), parassagitais a a linha média dorsal (Figura 1A).
  6. Use um estéril # 11 bisturi para fazer uma excisão espessura total ao longo da área marcada sem danificar a fáscia muscular subjacente.
    Nota: O tecido da pele excisada inclui a epiderme, a derme, e a gordura subcutânea panículo carnoso. Sangramento é normalmente mínimo.
  7. achatar tele extirpou amostra de pele em uma toalha de papel seco, derme lado para baixo, aparar o excesso de toalha de papel, e armazenar a amostra em PBS frio por até 1 hora se outras amostras precisam ser coletadas. Quando estiver pronto, prossiga para Passos 3.1 ou 3.2 para processar amostras para histologia ou Passo 4 para β-galactosidase (LacZ) coloração todo-mount.
  8. Sutura fechar o local da biópsia usando 6-0 nylon, em um padrão simples interrompido espaçadas a cerca de 3 mm.
  9. Não devolva os ratos que foram submetidos a cirurgia na mesma gaiola como outros animais até após a recuperação completa.
  10. Monitorar os animais imediatamente após a cirurgia até que recupere a consciência, e também diariamente até a área cirúrgica foi curado, geralmente dentro de uma semana. Use analgésicos de acordo com orientações de cuidados de animais e uso institucional designados se os ratos apresentam sinais de dor ou angústia. Remover suturas dentro de 7-10 dias após a cirurgia.
    Nota: Se for necessário, preparar a solução analgésica diluindo carprofeno (50 mg / ml da solutião) 1: 100 em água estéril. Injectar a solução por via subcutânea entre as omoplatas perto da nuca do pescoço, a uma dose de 200 ul por 20 g de peso corporal (5 mg / kg de peso corporal do rato).

3. As amostras de processo para histologia

Nota: Para corrigir e processar o tecido excisado, use um método abaixo dependendo da aplicação.

  1. Para gerar amostras histológicas embebidos em parafina, corrigir a pele em 3,7% de formalina em PBS O / N à temperatura ambiente e armazenar em 70% de etanol por até 2 semanas. Retire o papel toalha antes de embutir em parafina.
  2. Para a gerao de amostras histológicas congelados, submergir o tecido no frio paraformaldeído 4% em PBS e agitar suavemente durante 1 h. Remover a solução e lava-se a amostra com 3 mudas de PBS, cerca de 5 minutos cada. Em seguida, mergulhe a amostra em 30% de sacarose em PBS para cryoprotect o tecido ( "afundamento sacarose").
  3. Incubar com agitação suave O / N a 4 ° C. No dia seguinte, retire o papel de reboqueel e aparar o excesso de tecido adiposo do lado do dérmica da pele. Incorporar o tecido directamente para outubro e armazenar o bloco congelado a -80 ° C.
    Nota: Após o corte, quer parafina ou amostras congeladas pode ser manchado por imuno-histoquímica para identificar TDs, células de Merkel e nervos utilizando anticorpos contra queratina 17, queratina 8 e neurofilamento, respectivamente, como descrito anteriormente 5,19.

4. As amostras Visualize por Whole-mount LacZ Coloração

  1. Prepare solução de coloração X-gal.
    1. Combinar 0,94 g de fosfato de sódio monobásico, e 2,6 g de fosfato dibásico de sódio em 250 ml de água estéril. Ajustar o pH para 7,3. Para isso, adicionar 0,5 ml de cloreto de magnésio 1 M, 0,528 g de ferrocianeto de potássio, e 0,412 g de ferricianeto de potássio. Adicionar 250 ul de octilfenil-polietileno-glicol e 125 mg de desoxicolato. A solução de base pode ser armazenado a 4 ° C durante até 6 meses no escuro.
    2. Prepare 50x banco de soluti X-galem dimetilformamida, adicionando ao frasco de estoque de X-gal para gerar uma solução a 50 mg / ml. Conserva-se a solução a -20 ° C no escuro.
    3. Imediatamente antes do uso, dilui-se solução de reserva de X-gal 1:50 em solução de base de X-gal para gerar solução de coloração. Para biópsias mais pequenos (<1 cm 2), alíquotas de 1-2 ml de solução de coloração por amostra.
  2. Fixar a amostra de pele recolhida no Passo 2.7 numa solução contendo 2% paraformaldeído / 0,2% de glutaraldeído em PBS frio durante 30 min, agitando suavemente em gelo. Para biópsias mais pequenos (<1 cm 2), utilizar 1-2 ml de solução fixadora por amostra.
    Nota: Como alternativa, fixar amostras em 2-4% paraformaldeído apenas, ou apenas em glutaraldeído 0,5%. condições de fixação óptimas dependem do tecido, grau de expressão de LacZ e de aplicação.
  3. Remover a solução fixadora, e lavar as amostras com 3 mudas de PBS, 5 minutos cada, num agitador à temperatura ambiente.
  4. Remover a toalha de papel por baixo da amostra e cortar excess tecido adiposo a partir de lado dérmico da pele ao agarrar a gordura com uma pinça sem corte e de corte com uma tesoura de dissecação.
  5. Submergir a amostra na solução de coloração com X-gal, e incuba-se a 37 ° CO / N. Expressão de LacZ será visível como uma mancha azul sob um microscópio de dissecação (Figura 1B).
    Nota: Se a intensidade do sinal é fraco, substitua a solução de coloração no dia seguinte e repetir o O / N incubação. Se a coloração de fundo é demasiado intensa, reduzir o tempo de coloração, ou incubar a amostra a temperatura ambiente em vez de 37 ° C.
  6. Remover a solução de coloração e lavar as amostras em 3 mudas de PBS contendo 3% de DMSO durante aproximadamente 5 min, agitando à temperatura ambiente.
  7. Lavar as amostras em 2-3 mudanças de etanol a 70% para 5 minutos cada. Armazene as amostras em 70% de etanol.

5. A desnervação cirúrgica

  1. Anestesiar o animal como no Passo 2.2 e raspar a pele dorsal inteiro.
  2. Prepare a área cirúrgica of a pele de volta usando Betadine e toalhetes com álcool, e cobrir o animal com um campo cirúrgico estéril (para fins de demonstração, cortina estéril foi omitido para aumentar a visibilidade). Manter o animal aquecido usando uma almofada de aquecimento durante a operação em uma área cirúrgica asséptica.
  3. Realizar uma incisão utilizando um bisturi estéril # 11 ao longo da linha média dorsal desde a base do pescoço até cerca de 0,5 centímetros acima da cauda.
  4. Usando fórceps rombas, reflectir suavemente a pele sobre o lado esquerdo longe do flanco para visualizar o tecido subjacente das almofadas de gordura escapular perto do pescoço até imediatamente acima do membro posterior.
    Nota: os nervos dorsais cutâneas aparecem como fios brancos que viajam caudalmente translúcida através da faseia da parede do tronco antes de fazer curvas apertadas e entrar no tecido conjuntivo frouxo debaixo da pele (Figura 2).
  5. Usando fórceps ultra-finos sob um microscópio de luz dissecando, remover os nervos exclusivamente a partir do lado esquerdo da animal localizados em locais anatômicos T3-12 por arrancar a partir de onde a segmentos de curva na parede do tronco para seus locais de entrada na pele (Figura 2).
    1. Fórceps orientar verticalmente e remover os nervos agarrando aproximadamente 0,5 cm abaixo dos seus locais de curvatura e puxando para cima, fazendo com que o nervo para esticar e separar a partir do tecido circundante (Figura 2C - E). Tenha cuidado para evitar a ruptura dos vasos sanguíneos adjacentes.
    2. Continuar até que todos os nervos que se estendem a partir da parede do tronco para a pele são removidos. Não perturbar os nervos no interior da fáscia densa da parede do tronco. Manter o tecido húmido em todo o processo por aplicação periódica de gotas de solução salina estéril a 0,9%.
    3. Como alternativa, remova nervos, segurando suas extremidades proximais perto da parede do tronco com uma pinça e cortando com uma tesoura fina. Em seguida, cortar as extremidades distais perto da pele (Figuras 2F - H). Finalmente, remova o intervening segmentos de nervo (Figura 2I).
  6. Remova todos os nervos do retalho de pele exposta no Passo 5.4. Estas fibras compreendem os ramos distais dos nervos cutâneos dorsais e aparecem como fios de ramificação brancos localizados esporadicamente dentro do tecido conjuntivo no lado dérmico do retalho de pele (Figuras 2J - K).
    1. Para remover esses galhos finos, posicione a pinça fina mais ou menos paralelo à superfície da derme, segure os nervos e arrancar para cima, para evitar perturbar os vasos sanguíneos e perfurar a pele. Continuar até que todos os nervos visíveis tenham sido removidos.
  7. Utilizando uma dissecção romba, reflectir a pele do lado direito da linha média dorsal incisão, mas não remover os nervos. Isto irá servir como o controle sham-operados contralateral.
  8. Sutura ao longo da linha média dorsal, em um teste padrão simples interrompido para fechar a incisão. Monitorar o animal durante a recuperação e pós-opertivamente como já foi demonstrado (Passos 2,8-10). Remover suturas dentro de 7-10 dias após a cirurgia.
  9. Para avaliar funcionalmente estável desnervação até várias semanas após a cirurgia, remover os pêlos da pele dorsal usando um aparelho eléctrico.
  10. Gentilmente picar a área da pele desnervado usando uma agulha hipodérmica, e observar se o animal responde, normalmente estremecendo ou virar a cabeça. Se a área da pele foi desnervado de forma estável, o animal vai exibem pouca ou nenhuma resposta.
  11. Utilizando um marcador de preto, o contorno da área de não resposta, assim como uma área de tamanho e local semelhante no lado contralateral sham.
  12. Recolha biópsias a partir destes sites que nos Passos 2.1-2.9 para análise.
    Observação: Como alternativa, toda a pele dorsal para trás, incluindo as regiões desnervados e operados por simulação, pode ser removido como uma única folha para montagem inteira-coloração, semelhante ao descrito no Passo 4.

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Resultados

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Por ratinhos que expressam gerando tamoxifeno induzível Gli1-CreERT2 e um alelo repórter LacZ, é possível visualizar TD epitélios e rastrear o destino destas células ao longo do tempo. O procedimento de desnervação inteira normalmente pode ser concluída dentro de 1 hora por rato e deve causar desconforto mínimo para o animal.

Os nossos estudos anteriores têm indicado que os nervos são cruciais para manter amb...

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Discussão

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Nervos desempenham funções cruciais não só na sensação, mas também no desenvolvimento de órgãos de mamíferos, manutenção e regeneração 13,24-27. Como nervos recentemente têm sido implicados em diversas doenças de pele, as técnicas descritas aqui podem ser usadas para estudar a exigência de inervação numa variedade de modelos de doenças animais. Na verdade, a técnica desnervação unilateral permite a comparação directa da pele quer com os nervos intactos ou interromperam a partir do mesmo rato. Isto proporciona...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer a Autumn Peterson pela ajuda com a fotografia de ratos, Daniel Thoresen pela assistência com ratos e aos Drs. Nicole Ward e Abdelmadjid Belkadi pela assistência com a denervação cirúrgica. Esses estudos foram apoiados por financiamento do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele (bolsas R00AR059796 e R01AR065409); o Departamento de Dermatologia da Universidade de Michigan; o Programa de Bolsas de Ciências Biológicas; o Centro de Organogênese; o Centro Abrangente de Câncer da Universidade de Michigan; e o Fundo de Câncer John S. e Suzanne C. Munn. O S.C.P. foi apoiado por financiamento do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (concessão T32 GM007315). Este trabalho também foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Almofadas de preparação de álcoolPDIB339
AnaSed (Xilazina)LloydNADA 139-236
Anticorpo, anti-queratina 8Estudos de desenvolvimento Banco de hibridomaTROMA-Ianticorpo de rato, uso na concentração de 1:500
Anticorpo, anti-queratina 17Cell Signaling#4543anticorpo de coelho, uso na concentração de 1:1.000
Anticorpo, anticorpo de coelho anti-NeurofilamentoCell SignalingC28E10, use na concentração de 1:500
Almofadas de preparação BetadineMedlineMDS093917
Carprofeno (Rimadyl)Zoetis
Máquina de cortar cabelo recarregável sem fioAparador Wahl modelo 8900
Óleo de milhoSigma-AldrichC8267
CryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306uso na concentração de 1:1.000
DesoxicolatoSigma-AldrichD6750
Creme DepilatórioNairN/A
DimetilforamidaSigma-Aldrich319937
Dimetil Sulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GlutaraldeídoSigma-AldrichG5882
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000
Cetamina HClHospiraNDC 0409-2051-05
Cloreto de magnésioSigmaM8266
Micro vidro de coberturaVWR48404-454
Micro SlidesVWR48311-703
Suturas de nylon 10% Neutral BufferedFormalina VWRBDH0502-4LP
6-0DemeTECHNL166012F4P
Octylphenyl-polietilenoglicolSigma-AldrichI8896
O.C.T. CompostoSakura Tissue-Tek4583
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127
Pottasium ferrocianetoSigma-AldrichP9387
Ferricianeto de potássioSigma-Aldrich702587
Fosfato de sódio monobásicoSigma-AldrichP9791
Fosfato de sódio dibásicoSigma-AldrichS5136
SacaroseSigma-Aldrich84097
TamoxifenoSigma-AldrichT5648-1G
Pinça ultrafinaDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001Disolve in dimethylforamide para criar estoque de 50x antes do uso

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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