Method Article

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

DOI:

10.3791/54055

⸱

May 13th, 2016

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipulações transgénicas e edição genoma são críticos para testar funcionalmente o papel dos genes e elementos -regulatory cis. Aqui, um protocolo detalhado para microinjecção a geração de modificações genómicas (incluindo construções Tol2 mediadas repórter fluorescentes transgene, TALENS, e CRISPR) é apresentada para o peixe modelo emergente, a Gasterosteus aculeatus.

Abstract

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O peixe Gasterosteus aculeatus emergiu como um poderoso sistema para o estudo da base genética de uma larga variedade de características morfológicas, fisiológicas e comportamentais fenótipos. Os notavelmente diferentes fenótipos que evoluíram como populações marinhas se adaptar a ambientes de água doce incontáveis, combinados com a capacidade de atravessar formas marinhas e de água doce, fornecer um sistema de vertebrados rara em que a genética pode ser usada para mapear as regiões genômicas controlar evoluiu características. Excelentes recursos genômicos estão agora disponíveis, facilitando a análise genética molecular das alterações evoluídos. Enquanto experimentos de mapeamento gerar listas de genes candidatos interessantes, manipulações genéticas funcionais são necessários para testar o papel destes genes. regulação do gene pode ser estudada com plasmídeos repórter transgénicos e BACs integrado no genoma usando o sistema de transposase Tol2. Funções de genes candidatos específicos e elementos cis -regulatory pode ser avaliada através da indução de alvomutações com reagentes de edição genoma TALEN CRISPR e / Cas9. Todos os métodos requerem a introdução de ácidos nucleicos em embriões stickleback uma célula fertilizada, uma tarefa feita desafiador pelo córion espessura de embriões stickleback eo relativamente pequeno e fino blastomere. Aqui, um protocolo detalhado para microinjecção de ácidos nucleicos em embriões stickleback é descrita para aplicações transgénicos e de edição de genoma para estudar a expressão e função do gene, bem como técnicas para avaliar o sucesso de transgénese e recuperar linhas estáveis.

Introduction

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Um componente fundamental de compreensão de como a biodiversidade surge é a determinação das bases genéticas e de desenvolvimento de alterações fenotípicas evoluíram na natureza. O peixe Gasterosteus aculeatus, Gasterosteus aculeatus, emergiu como um excelente modelo para o estudo da base genética da evolução. Sticklebacks sofreram muitas mudanças evolutivas adaptativas como peixes marinhos colonizaram ambientes de água doce incontáveis ​​em todo o hemisfério norte, resultando em morfológica dramática, fisiológicas e alterações comportamentais 1. Os genomas de indivíduos a partir de vinte e um populações stickleback foram sequenciados e montados, e um mapa de ligação de alta densidade foi gerado para melhorar ainda mais a montagem de 2,3. Experiências de mapeamento genético identificaram regiões genómicas subjacente fenótipos evoluídos 4-6, e em alguns casos, os papéis funcionais de genes candidatos específicos foram testados 7,8. Um número de regiões genômicas subjacentes alterações morfológicas foram identificados com genes candidatos promissores, mas estes candidatos ainda não foram testados funcionalmente 9-12. Além disso, sticklebacks são modelos comuns para estudos de genética populacional / genômica 13,14, especiação 15, o comportamento 1, endocrinologia 16, ecotoxicologia 17, imunologia e parasitologia 18 19. Estudos futuros em cada um desses campos serão beneficiados com a capacidade de executar manipulações genéticas funcionais em sticklebacks. Além manipulando as suas sequências de codificação, os papéis dos genes candidatos pode ser avaliada através do estudo as suas sequências -regulatory cis e por funcionalmente aumentando, diminuindo ou eliminando a expressão do gene candidato. Métodos de microinjeção e transgenia em sticklebacks estão bem estabelecidos 7,8,20 e foram inicialmente desenvolvido utilizando uma mediada por meganucleasemétodo 21 descrito pela primeira vez em medaka 22. O método de microinjeção modificado aqui apresentado foi otimizado para ambos transgênese Tol2 mediada e, recentemente, desenvolveu reagentes edição do genoma incluindo TALENS e CRISPR.

Mudanças a cis -regulatory elementos são pensados ​​para ser crítico para a evolução morfológica, como cis -regulatory mudanças podem evitar as consequências negativas pleiotrópicos de codificação de mutações 23. Portanto, testando e comparando seqüências -regulatory cis putativos tornou-se um objetivo central de um número crescente de estudos evolutivos. Além disso, a maioria das variantes de doenças humanas são variantes reguladoras 24,25, e sistemas modelo de vertebrados são extremamente necessários para estudar a função elemento -regulatory cis e da lógica. Os peixes que fertilize seus embriões externamente em grandes números oferecem sistemas de vertebrados poderosas para estudar Regulamentação cis. O sistema de transposão Tol2, em que FOREIDNA gn para ser integrado no genoma é ladeado por sites e vinculativo Tol2 transposase co-injectados com mRNA transposase Tol2, trabalha com alta eficiência para integrar com sucesso plasmídeo constrói-se em genomas de peixes 26 - 28. Tipicamente, um intensificador de potencial é clonada a montante de um promotor basal (tais como hsp70l 29) e o gene repórter fluorescentes tais como a EGFP (proteína fluorescente verde melhorada) ou mCherry em uma espinha dorsal Tol2 e injectados com ARNm da transposase 26. Observação de expressão do repórter fluorescente, quer em embriões ou crias com transgenes integrados estavelmente injectados, fornece informação sobre a regulação espaço-temporais da expressão do gene dirigido pelo potenciador putativo. Em experiências adicionais, os potenciadores validados pode ser utilizado para dirigir a sobre-expressão específica de tecido dos genes de interesse.

Para a análise das regiões -regulatory cis maiores, de alta qualidade em grande inserção genombibliotecas de IC utilizando cromossomos artificiais bacterianos (BACs) foram construídos para ambas as marinhas e de água doce sticklebacks 30. Estes BACs pode ser recombineered para substituir um gene com um gene repórter fluorescente, no contexto de uma grande (150-200 kb) região genómica 31. O repórter fluorescente é então expresso num padrão espaço-temporal, tal como determinado por sequências reguladoras dentro do BAC. Para os estudos em peixes, locais Tol2 pode ser adicionado ao CCB para facilitar a integração genómica 32,33. Nas fases posteriores de desenvolvimento quando a hibridação in situ é tecnicamente difícil, a leitura de fluorescência do BAC pode ser usado para estudar os padrões de expressão de genes, como tem sido demonstrado para stickleback osso proteína morfogenética 6 (BMP6) 20. Além disso, os padrões de expressão fluorescentes em um indivíduo pode ser rastreados ao longo do tempo, o que não pode ser conseguido com a hibridização in situ. BACs pode também ser usado para adicionar uma additional cópia de uma região genómica de aumentar a dosagem de um gene de interesse.

Para o estudo da função do gene, genoma de edição é um campo explosivamente expansão que pode ser utilizado para produzir alterações específicas para sequências genómicas em uma ampla variedade de organismos 34. Transcrição nucleases efetoras ativador-like (TALENS) são nucleases modulares, específicos de sequência originalmente isoladas de patógenos de plantas que podem ser precisamente projetados para ligar directamente a uma sequência genômica de escolha e gerar uma cadeia dupla quebrar 35,36. Agrupamentos regularmente interespaçadas palindr�icas repetições curtas (CRISPR) / CAS sistemas foram originalmente encontrada em bactérias e utilizar um guia de RNA e da proteína Cas9 para gerar um intervalo de uma sequência de ADN alvo complementar para o guia 37. A reparação posterior da quebra de cadeia dupla criada por ambos os TALENS e CRISPR muitas vezes deixa para trás uma pequena inserção ou deleção, o que pode prejudicar a função da sequência alvo35-37. Em sticklebacks, TALENS têm sido utilizados para interromper a expressão do gene por direccionamento um intensificador de 20, e ambos TALENS CRISPR e ter sucesso na produção de mutações em sequências de codificação (dados não publicados). Um protocolo detalhado para a geração de CRISPR para uso em peixes-zebra pode ser utilizada como orientação para desenvolver CRISPR para sticklebacks 38.

Transgênicas e genoma experimentos de edição requerem introdução de ácidos nucleicos em um embrião de uma célula recém-fertilizado. Ao introduzir a ferramenta transgene ou genoma de edição no início do desenvolvimento, o número de células filhas geneticamente manipuladas no embrião é maximizada. embriões injectados são então visualmente pesquisadas quanto a fluorescência ou molecularmente rastreados para modificações do genoma. Se as células que contribuem para a linha germinal são orientados com sucesso, o transgene ou a mutação pode ser passada para um subconjunto de prole, mesmo quando letalidade pós-injecção é alta. Os peixes de mosaico pode ser outcrossed ouentrecruzadas e os seus descendentes selecionados para recuperar os alelos mutantes ou um transgene integrado de forma estável de interesse. Este protocolo descreve métodos para a introdução de transgenes e edição de reagentes genoma em embriões stickleback unicelulares e monitoramento para modificações genômicas de sucesso.

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Protocol

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Todo o trabalho de peixe foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use da Universidade da Califórnia-Berkeley (número de protocolo R330).

1. Prepare Nucleic Acids para Injecção

  1. Tol2 plasmídeo Transgénese (Adaptado de Fisher 26).
    1. Corte de 10 ug de plasmídeo de transposase (PCS-TP) 39 com 10 U de NotI em tampão fornecido durante 1 h a 37 ° C para linearizar.
      Nota: Os acordos de transferência de material pode ser necessária para obter plasmídeos Tol2.
    2. Extrair o plasmídeo de corte com uma 25: 1 mistura de fenol:: 24 clorofórmio: álcool isoamílico e etanol precipitado com acetato de sódio de acordo com protocolos padrão 40. plasmídeo ressuspender em 50 mL de água livre de RNase.
      Nota: O fenol-clorofórmio deve ser utilizado em uma capa e os resíduos devem ser eliminadas de acordo com as orientações institucionais.
    3. Configurar uma reação Sp6 transcrição de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Use um isolador RNAção kit para limpar reacção de transcrição de acordo com as instruções do fabricante; ressuspender RNA em água 50 mL RNase.
    5. Retirar uma aliquota de 1 ul de RNA. Aquece-se a 65 ° C durante 5 minutos para desnaturar estruturas secundárias então relaxar imediatamente em gelo. Congelar restante reacção de transcrição a -80 ° C.
    6. Executar a alíquota de ARN num gel de agarose a 1% em 0,5x TAE (base Tris, ácido acético, ácido etilenodiaminotetracético) tampão de corrida com um padrão de tamanho de ARN em uma pista. O produto esperado é de 2200 pb; descarte se> 5% do ARN total aparece em uma mancha menor do que 2200 pb, o que indica a degradação extensa (Figura 1).
    7. Quantificar RNA usando um espectrofotómetro a 260 nm. Diluir para 350 ng / mL em alíquotas de água e 1 ul da loja sem RNase a -80 ° C (boa durante pelo menos dois anos).
    8. Clone Tol2 plasmídeo repórter (por exemplo, usando pT2HE 8 ou plasmídeos a partir do kit de Tol2 41) com cis- Elemento regulador de interesse. Resumidamente, a PCR amplificar uma sequência de ADN genómico de interesse com iniciadores contendo locais de restrição encontrados no plasmídeo, digestão do produto de PCR e o vector com a enzima (s), ligar o inserto ao vector, e transformar o plasmídeo resultante em E. competente coli 40. Isolar o plasmídeo com um kit que inclui um enxaguamento de endotoxinas de acordo com o protocolo do fabricante.
    9. Realização de uma segunda purificação do plasmídeo Tol2 com um kit de purificação de PCR de acordo com o protocolo do fabricante. Eluir em 30 de água livre de RNase mL.
      Nota: o rendimento deste passo pode ser baixo (por vezes abaixo de 50% do plasmídeo de entrada).
    10. Diluir plasmídeo para ~ 125 ng / mL em água livre de RNase.

figure-protocol-1
Figura 1. gel de ARNm de transposase. Pro ​​reacção de transcrição purificadoconduta (1 mL) foi aquecida a 65 ° C, arrefecidas em gelo, e corrido num gel de agarose a 1% com 0,5 x TAE tampão de corrida a 100 V. Os tamanhos da escada de ARN em quilobases (kb) são indicados à esquerda . O mRNA comprimento transposase completo é uma banda brilhante no ~ 2,2 kb. Uma quantidade pequena, mas aceitável de mRNA degradadas ou incompleto é visto abaixo de 2,2 kb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. BAC Transgénese (Veja Suster 32,33 para técnicas de BAC recombineering)
    1. Preparar CBA de E. coli utilizando o kit de purificação de BAC de acordo com o protocolo do fabricante. Use precipitação de etanol para recuperar DNA com uma extração de padrão de acetato de sódio-etanol 40 e DNA ressuspender em ~ 250 ng / mL em água livre de RNase.
    2. Prepare mRNA transposase como na secção 1.1.
  2. Mutação indução com TALENS (Veja Cermak
  3. Use o aplicativo baseado na web para projetar TALENS para o gene de interesse 42. Se possível, design TALENS para interromper um site corte enzima de restrição para facilitar a análise molecular.
  4. Clone TALENS e preparar plasmídeos para transcrição seguinte publicada protocolo 35.
  5. Transcrever o ARNm TALEN com uma reacção de transcrição sp6 de acordo com as instruções do fabricante e limpar o ARNm como descrito para transposase na secção 1.1.4. Quantificar com um espectrofotômetro e diluir a 200 ng / mL em RNase água livre. Executar TALEN ARNm sobre um gel para garantir que ele é o tamanho adequado e não degradada, tal como descrito no passo 1.1.6.
  6. Conceber um par de iniciadores de PCR para amplificar cerca de 100-200 pb em torno da sequência alvo TALEN usando uma ferramenta de desenho de primers e a sequência de ADN alvo 43. Ordenar a enzima de restrição apropriada para testar a lesões no local de destino com base no passo 1.3.1.
  • CRISPR Transgénese (Veja Talbot e Amacher 38 para desenho e preparação de CRISPR):
    1. Projeto e preparar CRISPR e Cas9 mRNA acordo com o protocolo 38 e ordem apropriada iniciadores de verificação e de enzimas de restrição, tal como descrito no passo 1.3.4.

    • 2. Prepare Reagentes injeção

    1. Use borosilicato capilares para Prepare agulhas conforme descrito abaixo.
      Nota: estes capilares não são os capilares padrão utilizados para microinjecção de peixe-zebra, e são feitos de um vidro mais espessa e mais forte que é crítico para perfurar o cório stickleback resistente.
      1. Sempre usar borracha nitrílica ou luvas de látex quando puxar agulhas, e não permitir que as agulhas entrar em contato com a oleosidade da pele ou da pele.
      2. Determinar parâmetros micropipeta puxando empiricamente por meio de testes de rampa seguintes instruções do fabricante do extrator micropipeta. Por exemplo, com uma caixa de filamentos, os seguintes parâmetros foram determinado a ser ideal: (Heat = 515, Pull = 60, Velocity = 60, Delay = 85, Pressão = 500). Estas definições produzir uma agulha que se afunila abruptamente em cerca de 12 ° C durante ~ 2 mm e, em seguida, uma longa extensão que se reduz a cerca de 2 ° C durante ~ 6 mm (Figura 2).
        Nota: Os parâmetros adequados irão variar de acordo extrator e filamentos, e às cegas usando um programa sem determinar os parâmetros primeiro através de testes de rampa pode destruir de forma permanente filamento do puxador, o que é difícil e caro para substituir.
      3. Siga as instruções do fabricante para puxar pelo menos 4 agulhas micropipeta de vidro de borosilicato com as definições determinadas no ponto 2.1.2.
      4. agulhas loja verticalmente no frasco de armazenamento capilar com a ponta virada para baixo.
      5. Antes de injetar, coloque a jarra de armazenamento capilar no gelo para relaxar agulhas. Adicionar um pedaço de papel toalha úmida para o frasco para evitar a evaporação uma vez que as agulhas são preenchidos.
    2. Fertilizar ovos (AllPassos foram realizados a temperatura ambiente)
      1. Faixa de embreagem óvulo de stickleback fêmea grávida, pressionando ligeiramente o abdome e acariciando em um anterior-posterior para empurrar os ovos para fora através da cloaca e em uma placa de Petri 35 x 10 mm 2. Adicionar um pedaço húmido de toalha de papel de um lado da placa de Petri (não tocar nos ovos) para criar câmara de humidade. Coloque a tampa na placa de Petri de modo ovos ficar úmido.
      2. Eutanásia esgana-gata macho em 0,025% tricaina-S em buffer com bicarbonato de sódio a 0,1%.
      3. Corte abrir o abdômen, testículos remover e macerar em 250 solução ul de Hank (veja Westerfield 44 para a plena protocolo para preparação da solução de Hank).
      4. Fertilizar, no máximo, 100 ovos com solução de esperma 50 pi e misture delicadamente com a ponta da pipeta para garantir que todos os óvulos são fertilizados. Se a embraiagem é> 100 ovos, fertilizar metade dos ovos posterior para garantir que todos os embriões estão numa fase de uma célula na altura da injecção. Os ovos podem ser deixadas não fertilizadoà temperatura ambiente durante cerca de uma hora, e de esperma geralmente dura por 1-7 dias a 4 ° C em solução de Hank.
      5. Manter embriões abrangidos com tampa placa de Petri após a fertilização para evitar a secagem. Permitir 20-25 min para a primeira célula a emergir e inchar (preparar materiais de injecção durante este tempo).
      6. Encha um prato de 150 milímetros x 15 mm Petri com água stickleback. (Para fazer a água stickleback, primeiro preparar a 10% de bicarbonato de sódio dissolvido em água deionizada. Em seguida, adicione 3,5 g artificial mistura de água salgada e 0,217 ml de 10% de bicarbonato de sódio por 1 L de água deionizada, e mexa / agitar vigorosamente para dissolver o sal.)
    3. Preparar a solução de injecção (enquanto os ovos são Adubação)
      1. Preparar a solução de injecção de acordo com a Tabela 1 e armazenar em gelo.
        Nota: as concentrações de cerca de ácidos nucleicos têm sido aumentada dos publicados para peixe-zebra, devido ao aumento do volume do blastómero stickleback.
    Reagente injeção Tol2 injeção BAC injeção TALEN injeção CRISPR
    mRNA Tol2 350 ng 350 ng - -
    DNA 150-200 plasmídeo ng BAC 200-300 ng - -
    mRNA TALEN - - 200 ng de cada um -
    RNA guia CRISPR - - - 200 ng
    mRNA Cas9 - - - 400 ng
    PBS 0,5% de fenol vermelho do inDulbecco 0,5 ul 0,5 ul 0,5 ul 0,5 ul
    RNAse água livre 5 ul 5 ul 5 ul 5 ul

    Tabela 1:. Todos os reagentes de injecção misturas deve ser preparada para um volume total de 5 mL e armazenado em gelo.

    1. Preencha Needles (On Ice; Permitir que pelo menos 10 min para o Needles para encher).
      1. O preenchimento, pelo menos, três agulhas por pipetagem de solução de injecção de 0,5 mL para a extremidade superior cega da agulha quando as agulhas estão pendurados verticalmente no frasco de armazenamento capilar. Tenha cuidado para que a queda permanece no topo e não escorre para o lado e evitar bolhas.
      2. Após o líquido vermelho foi drenado principalmente à ponta aguçada da agulha, adicionar mais 0,5 ul para a extremidade cega da agulha e deixar escorrer o líquido.

    3. Prepare Inject Rig e agulha para microinjeção

    Nota: estes passos cum ser geralmente feito após fertilizar os ovos.

    1. Ligar a luz de transiluminação para o microscópio de dissecação e colocar uma placa de vidro ~ 13 cm x 13 cm na base de luz do microscópio, com 15 cm de gesso lâmina de serra na parte superior da placa de vidro 7. Orientar a serra perpendicular ao aparato de injecção, com os entalhes virados para o suporte de agulha.
    2. Ligue o fornecimento de ar e assegurar a pressão é ajustada a ~ 200 kPa a partir do regulador.
    3. Ligue a caixa de controle e ajustar as configurações. pressão definida para ~ 150-175 kPa. Definir a duração da injecção para 180 ms.
    4. Solte o suporte da agulha, inserir uma agulha cheia no suporte até que a resistência do suporte de borracha pode ser sentida, e apertar até o dedo apertado.
    5. Ajustar o ângulo da agulha para cerca de 45 °.
    6. Use micromaniplador controlos para ajustar a agulha de modo que a extremidade está centrada no campo de visão. Ampliar para ~ 40X e concentrar-se na ponta da agulha, o que não deve tocaro vidro abaixo.
    7. Suavemente quebrar a ponta da agulha, segurando-o com uma pinça de relojoeiro. Idealmente, não quebre perpendicularmente, mas sim em um ângulo de ~ 60 °. Quebrar perto da ponta (não mais do que 2-3 larguras fórceps para longe da extremidade, Figura 2).

    figure-protocol-2
    Figura 2. agulhas microinjeção intactas e quebrados. A agulha superior é ininterrupta e na ponta da agulha inferior foi quebrado com uma pinça (seta). As agulhas são cheios com uma solução contendo 0,05% de vermelho de fenol. Barra de escala = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    1. Pressionar o pedal de pé injecção várias vezes para testar se a agulha é quebrado. Após alguns toques, pequenas gotas vermelhas devem começar a sair de tele termina. Se não, tente quebrar a agulha ligeiramente mais elevado.
    2. Se a agulha tem uma bolha de ar, aumentar a unidade de pressão para trás e para pressionar o pedal várias vezes rapidamente para trabalhar a bolha para fora.
    3. Ajustar a pressão Back:
      1. Utilizar a pipeta de transferência descartável para colocar algumas gotas de água stickleback sobre a placa de vidro.
      2. Com cuidado, abaixe a agulha na água.
      3. Aumentar a pressão para trás até um leve fluxo de líquido rosa emerge a partir da agulha (indicando pressão positiva).
        Nota: Se não houver pressão de retorno suficiente, a agulha irá elaborar o citoplasma por acção capilar. Se houver demasiada pressão para trás, o volume de injecção pode ser inadvertidamente demasiado grande.
      4. Retrair a agulha, tanto quanto possível, de modo que ele não seja danificado aquando da preparação dos embriões (ver abaixo).
    4. Em alternativa, ajustar a pressão volta a uma configuração de pressão mais elevada de modo a que uma forte corrente constante de líquido sai da agulha Wuando se está submerso na água. Em seguida, pressionar o pedal para injetar torna-se desnecessário; No entanto, a injecção deverá ser efectuada rapidamente para evitar a sobre-injecção.
      Nota: Não tente esta técnica quando primeiro aprender a injectar.

    4. microinjeção

    1. Cerca de 25 min após a fertilização, use duas pontas 10 mL de pipeta para remover 5-10 embriões da embreagem e transferência para a placa de vidro.
    2. Ainda usando as pontas de pipeta, gentilmente separar os embriões em recuos individuais da lâmina de serra. Tenha cuidado para não perfurar embriões.
    3. Usando uma pipeta de transferência com a extremidade cortada de modo embriões stickleback vai caber dentro, adicione a água stickleback suficiente para cobrir os embriões, sair da água por 3-5 seg, em seguida, retire o excesso de água com a pipeta, deixando um pequeno volume de revestimento de água cada embrião.
      Nota: O excesso de água causará a córions para endurecer e quebrar a agulha, mas um pequeno volume de água é necessária para levantar o chOrion fora da célula e gema (Figura 3A - B).
    4. Começando com o mais afastado do embrião, deslizar a placa de vidro e aumentar de modo que a primeira embrião preenche aproximadamente 25% do campo de visão.
    5. Abaixe a agulha no campo de visão, em seguida, use a ponta da pipeta 10 ul para girar suavemente o embrião para identificar o blastomere, um granulado ligeiramente amarelo colisão, levantou de citoplasma em cima da gema (Figura 3B), e depois girar para que o blast�ero é directamente perpendicular à extremidade da agulha (mantendo o embrião no entalhe da lâmina de serra, a Figura 3C).
      Nota: as gotas de gema pode mover-se como o embrião é rodado, por isso não usá-los como um quadro de referência para a localização do blastomere.
    6. Abaixe a agulha para o citoplasma, mas não empurre até a gema subjacente. Aplique pressão lentamente e uniformemente ao perfurar o córion para evitar a quebra da agulha. Se ocurvas agulha severamente, retraia e tente novamente em um local um pouco diferente.
    7. Pressionar o pedal 3-4 vezes para injectar de modo a que um bolus vermelho com bordos ligeiramente enche difusas sobre ~ 1/8 do diâmetro do citoplasma (ver a Figura 3D).
      1. Evitar a obtenção de um bolus vermelho com bordas afiadas que não começam a difundir, o que indica a injeção na gema sob o citoplasma (Figura 3E).
      2. Se uma mancha rosa-vermelho brilhante difunde rapidamente, inserir a agulha ainda mais para perfurar a blastomere.
      3. Se o bolus de injeção fica amarelo instantaneamente, gire o embrião para garantir a blastomere tem sido alvo e injetar novamente (Figura 3F).

    figure-protocol-3
    Figura 3. Aspecto de embriões stickleback antes e após a injeção. Todos os embriões são retirados de the perspectiva de olhar para baixo através do microscópio (exceto para C 'e G). (A) antes da adição de água, embriões fertilizados tem uma aparência uniforme com gotículas de óleo flutuantes perto da parte superior da gema. (B) Após a adição de água, as ondas córion, revelando um blastomere que se projeta a partir da gema e é visível no perfil. (C) A rotação do embrião de modo que a agulha entra perpendicularmente à cório e de blastómeros. (C) vista lateral de uma agulha que tenha perfurado o cório com a ponta no citoplasma. (D) injecção no citoplasma resultados em um ponto vermelho com bordas difusas que desaparecem ao longo do tempo. (E) Injeção na gema subjacente aos resultados citoplasma em um ponto vermelho com bordas definidas. (F) Injecção na gema oposto os resultados citoplasma de uma mudança de cor induzido pelo pH do vermelho para o amarelo. (L) lateralvista dos resultados de injeção, com Xs mais locais de injecção sub-ideais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    1. Use os controles micromaniplador para retrair a agulha, usando a ponta da pipeta 10 ul para manter pressionado o embrião se adere à agulha.
    2. Depois de retrair a agulha, deslize a placa de vidro para alinhar a próxima embrião com a agulha.
    3. Após a injecção de todos os embriões, use a pipeta de transferência para adicionar água para os embriões, em seguida, recolhê-los na pipeta de transferência e coloque em 150 milímetros placa de Petri cheia de água stickleback.
    4. Seque a placa de vidro com uma toalha de papel para evitar a acumulação de muita água.
    5. Distribuir embriões frescos para a serra e repita os passos 4.4 através de 4.10.
    6. Mantenha ~ 10% dos embriões como controlos não injectados para garantir que os embriões não injectados desenvolvem normalmente e usar como controles do tipo selvagem de tele ensaios moleculares descrito abaixo.

    5. Cuidados pós-injeção

    1. Incubar embriões em placas de Petri a 18 ° C após injecção 10 até à eclosão. Seguindo a eclosão, as larvas traseira em aquários como descrito 10.
    2. Delicadamente despeje a água stickleback um dia após a injeção e substituir com água stickleback fresco. Substituir com água stickleback fresco, pelo menos, a cada dois dias depois disso.
    3. Verificar a existência de embriões mortos ou mal formados diariamente. Remover esses embriões para prevenir a cárie de contaminar a água.

    6. Análise dos Resultados de injeção

    1. Para a injecção de repórteres fluorescentes, embriões monitorizar diariamente numa sala escura usando um microscópio de dissecação com uma GFP fluorescente ou filtro RFP (dependendo do transgene fluorescente). padrões anatômicos recordes de expressão gênica com fotografias digitais e / ou descrições escritas e apuramento do número de peixes com diferentes expresdomínios Sion (Figuras 4 e 5).
      Nota: Sticklebacks tem autofluorescente, as células estreladas de pigmento que são visíveis sob filtros GFP começando em 4 dias após a fertilização (DPF).
      1. Para gerar linhas estáveis, salvar embriões com fluorescência detectável e crescer até a idade adulta, como descrito 10.
      2. Outcross injetado peixes adultos para o tipo selvagem de peixe usando o procedimento de fertilização in vitro descrito no ponto 2.2 e descendentes tela por fluorescência como descrito no passo 6.1 para procurar prole fluorescente, indicando transmissão transgene bem sucedido.
      3. Para visualizar fluorescência em larvas eclodidas, livre de natação, adicionar 500 mL de 0,8% tricaina à placa de Petri de 150 mm a anestesiar peixes e esperar até parada peixes se movendo para a imagem. lavar imediata várias vezes com água fresca stickleback seguintes observação e de imagem.
      4. Opcionalmente, para preservar a fluorescência para mais imagens, eutanásia larvas em0,025% (250 mg / L) tricaina tamponada com bicarbonato de sódio a 0,1% e fixar durante 4 h em 4% de paraformaldeído em 1x tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C. Armazenar em 1x PBS por até duas semanas.
        Nota: fundo auto-fluorescência aumenta ao longo do tempo.
    2. Diagnóstico PCR / Genotipagem digestão para Mutation indução com CRISPR ou TALENS - melhor executada em 2 dias após a fertilização.
      1. Use uma pipeta de transferência para colocar 10 embriões injetados (2 dpf, ainda em córions) nos primeiros 10 poços de uma poços 12 PCR tubo de strip-tease. Coloque o peixe controle não injectados nos dois últimos poços.
      2. Retire o excesso de água stickleback.
      3. Adicionar 50 ul de tampão de lise (Tris 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,3% de Tween-20, e 0,3% de NP-40) a cada poço.
      4. Coloque tampas em tubos e incubar a 95 ° C durante 20 minutos num termociclador.
        Nota: A gema ficará branco e elástico após a etapa de ebulição.
      5. Remover tampas e usar um cle diferenteuma ponta de pipeta 1000 uL para macerar o embrião em cada tubo.
        Nota: os detritos Branco irá recolher na parte inferior do tubo.
      6. Adicionar 2,5 uL de 10 mg / ml de proteinase K a cada poço.
      7. Substituir tampas e incubar a 55 ° C durante 1 h para digerir a proteína, seguido por 95 ° C durante 20 min, para inactivar a proteinase K. Armazenar a -20 ° C para evitar o crescimento de fungos.
      8. Executar PCR utilizando uma polimerase de alta fidelidade, seguindo as instruções do fabricante. Utilizar o lisado embrião como molde de ADN.
        Nota: Ter cuidado para remover o líquido da parte superior do tubo de molde de ADN, evitando-se qualquer córion visível ou detritos gema na parte inferior do tubo.
      9. Misturar o produto de PCR em igual volume com uma mistura principal enzima de restrição contendo tampão específico da enzima 1x e 0,25 ul de enzima por amostra. Sempre salvar metade do produto de PCR sem cortes para ensaiar num gel para confirmar os produtos de PCR são o tamanho previsto. Incubar a PCR misturado com a enzima nas condições adequadas paraa enzima de restrição.
        Nota: Algumas enzimas podem exigir outros rácios de tampão de enzima para produto de PCR; ajustar a concentração do tampão se os controlos não injectados não apresentam digestão completa.
      10. Após a digestão, os produtos são executados em um gel de agarose a 1% ao lado de uma escada de tamanho de DNA para confirmar tamanhos esperados de produtos.
        Nota: bandas sem cortes em embriões injectados indicar a presença de lesões moleculares (Figura 6) e controlos não injectados deve ser totalmente digerido para interpretar os resultados.
      11. Para confirmar lesões, cortar bandas não cortados a partir de géis de agarose e purificar ADN com um kit de extracção de gel. Use sequenciação de Sanger, de preferência usando um iniciador de sequenciação interna relativamente às sequências iniciadoras de PCR, para confirmar a lesões. Em F 0 injectado embriões, uma mistura de lesões, provavelmente, estar presentes, fazendo com que a qualidade do Sanger ler a degradar-se perto do local alvo.
      12. Para produzir uma linha estável, salve todos os embriões injetados de garras que a tela positivo para lesões moleculares. Gremar até peixes, outcross, e depois filtrar um subconjunto de F 1 embriões para lesões moleculares como descrito nos passos 6.2.1 através de 6.2.11. Se portadores heterozigotos são identificados, fazer crescer a F restante 1 embriões para a vida adulta e identificar indivíduos heterozigotos utilizando DNA extraído de um clipe de nadadeira caudal.

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    Results

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    Para transgenes de gene repórter que têm actividade potenciadora, injecção bem sucedido resultará na expressão específica, celular do transgene (Figura 4A, 4C). Peixes podem então ser injectados outcrossed para produzir linhas estáveis ​​(exemplo de uma linha estável BAC mostrado na Figura 4B). ADN em embriões stickleback injectando tipicamente resulta em letalidade muito mais elevado do que o RNA sozinho. É típico para ver até 50% (por ...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Injectáveis ​​embriões stickleback unicelulares para transgenia ou edição genoma apresenta três desafios principais. Em primeiro lugar, em relação aos embriões de peixe-zebra, o stickleback embrionária córion é difícil e muitas vezes vai quebrar agulhas. Este problema pode ser parcialmente ultrapassada pela utilização de micropipetas de vidro grosso e mais forte e injectando perpendicular ao córion (ver protocolo, a Figura 2). Assegurar que o mínimo possível de água é adicionada aos embriões (apenas o s...

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    Disclosures

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    Os autores não têm nada para revelar.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH R01 # DE021475 (CTM), um NIH Predoctoral Training Grant 5T32GM007127 (PAE), e um NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Agradecemos a Kevin Schwalbach para a realização de recombineering BAC e injeções, Nick Donde para gerar dados de sequenciamento Sanger CRISPR, e Katherine Lipari para feedback útil sobre o protocolo de injeção.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Estereomicroscópio com transiluminaçãoLeicaS6e/ KL300 LED
    Micromanipulador manualInstrumentação Científica AplicadaMM33Micromanipulador Marzhauser M33
    Sistema de injeção de pressãoInstrumentação Científica AplicadaMPPI-3
    Unidade de contrapressãoInstrumentação Científica AplicadaBPU
    Kit de suporte de micropipetaInstrumentação Científica AplicadaMPIP
    Suporte de base magnéticaInstrumentação Científica AplicadaBase
    Interruptor de péInstrumentação Científica AplicadaFSW
    Placa de ferro (base magnética)NarishigeIP
    Flaming/Brown Micropipeta ExtratorInstrumentoSutterP-97
    Pipetas de transferência descartáveisFisher13-711-7M
    0,5% vermelho de fenol em DPBSSigma P0290pinça de injeção
    #5, biologie dumoxel Ferramentas de Ciência Fina11252-30para quebra de agulhas
    Micropipeta Jarra de ArmazenamentoWorld Precision InstrumentsE210comporta agulhas
    6", 6 dentes por polegada serra de gesso para drywallLenox20571 (S636RP)segura ovos para injeção
    13 cm x 13 cm placa de vidroqualquer loja de ferragens-Capilares
    de vidro borosilicato, 1.0 mm OD/0.58 mm ID World Precision Instruments1B100-F4*vidro mais duro do que capilares de injeção de peixe-zebra
    150 x 15mm FisherFB0875714cria embriões de esgana-gata
    35 mm x 10 mm Fisher08-757-100Aarmazena ovos pré-injeção
    Sal InstantâneoOcean Instantâneo OceanoSS15-10
    Bicarbonato de SódioSigmaS5761-500G
    tricaína metanossulfonato/MS-222Western Chemical IncMS222para peixes
    AmbionAM1340Para transcrição de TALENs e transposase mRNA
    Kit de limpeza de RNeasyQiagen74104purifica transposase ou TALEN RNA
    QiaQuick Kit de limpeza de PCRQiagen28104limpa plasmídeos para injeção
    Proteinase K 20 mg/mlAmbionAM2546para preparação de DNA
    Nucleobond BAC 100 kitClontech740579para preparação de DNA BAC
    NotINEBR0189L
    Phusion polimeraseFisherF-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi kitQiagen12943contém tampão de enxágue de endotoxina
    Extração de Gel QIAQuickQiagen28704 para sequenciamento de mutações induzidas
    Fenol: clorofórmio: álcool isoamílicoSigmaP2069-100ML
    Acetato de sódioSigmaS2889-250G
    Etanol (grau de biologia molecular)SigmaE7023-500ML
    AgaroseSigmaA9539
    50x Tris-acetato-EDTA tampãoThermoFisherB49
    0,5-10 Kb escadade RNAThermoFisher15623-200
    Nanodrop  EspectrofotômetroThermo ScientificNanodrop 2000
    ParaformaldeídoSigma158127-500G
    10x PBSThermoFisher70011-044
    1 kb mais escada de DNAThermoFisher10787-018
    Cloreto de potássioSigmaP9541-500G
    Cloreto de magnésioSigmaM8266-100G
    NP-40ThermoFisher28324
    Tween 20SigmaP1379-500ML
    Tris pH 8.3tiras TeknovaT1083
    Thermo ScientificAB-1113
    magnética Kit de transcrição de Tubo de PCR de 12

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