Examinou-se a concepção e desenvolvimento de um ensaio colorimétrico de nanopartículas de ouro-aptâmero para a detecção de moléculas pequenas para aplicações in-the-campo. Além disso, uma aplicação colorimétrico-dispositivo inteligente (APP) foi validado e armazenamento a longo prazo do ensaio foi estabelecido para utilização no campo.
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Artigo de método
Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Examinou-se a concepção e desenvolvimento de uma nanopartícula aptâmero-ouro (AUNP) ensaio colorimétrico para a detecção de moléculas pequenas para aplicações in-the-campo. ensaios de cor com base alvo seletivo AUNP foram desenvolvidos em laboratório de prova de conceito controladas. No entanto, estes sistemas não têm sido exercida a um ponto de falha para determinar a sua utilização prática para além de configurações de laboratório. Este trabalho descreve uma abordagem genérica para projetar, desenvolver e solucionar problemas de um ensaio colorimétrico aptâmero-AUNP para pequenos analitos moléculas e utilizando o ensaio para as configurações in-the-campo. O ensaio é vantajosa porque aptâmeros adsorvidas passivar as superfícies de nanopartículas e fornecer um meio para reduzir e eliminar respostas falsas positivas para analitos não-alvo. A transição para este sistema usos práticos necessário definir não só o prazo de validade do ensaio aptâmero-AUNP, mas que fixa os métodos e procedimentos que se estende para o capabil armazenamento a longo prazodades. Além disso, uma das preocupações reconhecidos com leitura colorimétrica é a sobrecarga dos analistas para identificar com precisão as mudanças muitas vezes sutis na cor. Para diminuir a responsabilidade sobre analistas no campo, um protocolo de análise de cor foi projetado para desempenhar as funções de identificação de cores sem a necessidade de executar esta tarefa em equipamentos de laboratório grau. O método para criar e testar o protocolo de análise de dados é descrita. No entanto, para compreender e influenciar a concepção de ensaios de aptâmeros adsorvidas, as interacções associadas com o aptâmero, alvo, e AuNPs requerem um estudo mais aprofundado. O conhecimento adquirido pode levar a alfaiataria aptâmeros para melhorar a funcionalidade.
Introdução
Colorimetria é uma das técnicas mais antigas utilizados em química analítica. Para esta técnica, uma determinação qualitativa ou quantitativa do analito é feita com base na produção de um composto colorido 1. Tipicamente, os ensaios de cor utilizam reagentes que experimentam uma mudança de cor na presença de espécies de analito, o que resulta numa mudança de cor observável ou detectável no espectro de luz visível. Colorimetria foi usado na detecção de alvos que variam a partir de átomos, iões e moléculas pequenas a moléculas biológicas complexas tais como ácidos desoxirribonucleico (ADN), péptidos, proteínas e 2-4. Para as duas últimas décadas, ....
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Protocolo
1. Síntese via Citrato de Redução de Nanopartículas de Ouro (AUNP) e Caracterização
- Limpar um balão de Erlenmeyer (500 ml) e grande barra de agitação com 5 ml de ácido nítrico concentrado e 15 ml de ácido clorídrico concentrado na capa de segurança química.
- Molhar toda a superfície do balão com a lavagem com ácido, lavar o recipiente com água livre de nuclease, e permitir que o balão para secar.
- Adiciona-se 100 ml de cloreto de ouro 1 mM (III); usar uma folha de papel de alumínio para cobrir a parte superior do ácido limpo Erlenmeyer e calor, com agitação contínua numa placa quente até a ebulição.
- Adicionar 10 ml de c....
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Resultados
O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e investigar a estabilidade e robustez do apt�ero com base ensaios colorimétricos AUNP para uso no campo. Como destaque na publicação anterior, duas estratégias distintas para criar o ensaio foram investigados 7. Os ensaios foram denominado o Aptamer Ensaio Livre eo adsorvida Aptamer de Ensaio. O ensaio foi adsorvida Aptâmero mais atraente para os efeitos de um ensaio de detecção fieldable (Figura 1)........
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Discussão
Ao longo da última década, os ensaios colorimétricos à base de nanopartículas têm sido desenvolvidos para a detecção de alvos incluem pequenas moléculas, ADN, proteínas, células e 2-4. Os ensaios que utilizam ADN aptâmeros com nanopartículas têm vindo a ganhar interesse. Tipicamente, estes ensaios colorimétricos são realizadas por mistura do ADN-aptâmero com moléculas de analito seguida pela adição de AuNPs 9-10. No entanto, estes ensaios têm sido utilizados em demonstrações de prova de conceito co.......
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Esse trabalho foi parcialmente financiado pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea e pelo Secretário Assistente de Defesa para Pesquisa e Engenharia (Escritório de Biometria e Forense de Defesa). A participação no JES foi apoiada por um Prêmio de Associação de Pesquisa do Conselho Nacional de Pesquisa no Laboratório de Pesquisa da Força Aérea.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de ouro(III) hidratado | Sigma | 254169 | 99,999% de pureza é importante e as soluções eram feitas frescas toda vez |
| Diidrato de citrato de sódio | Sigma | W302600-1KG-K | Descobrimos que o fabricante afeta muito os ensaios AuNP, e as soluções eram feitas de novo toda vez |
| Sinergia | Bio-TEK | HT | Qualquer espectrômetro de absorção funciona, mas um leitor de placas oferece múltiplas análises de amostras |
| 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico (HEPES) Buffer, 1 M esterilizado | Amresco | J848 | Qualquer marca esterilizada serve |
| Corning, 250 ml Sistema de Filtro, 0,22 & micro; Acetato de celulose m | Pescador | 430767 | Outras membranas foram encontradas para remover os AuNPs |
| Espectrofotômetro UV | Varian | Cary 300 | Qualquer espectrômetro de absorção vai funcionar |
| Cloreto de Magnésio Hexahidratado | Fluka | 63068 | ≥ 98% de qualquer marca funciona |
| ADN | IDT | Costume | O DNA foi purificado com uma coluna de dessalinização, técnicas de purificação mais avançadas podem ser usadas |
| Cloridrato de Procaína | ACROS | AC20731-1000 | 99% dos estoques de 1 mg/ml de metanol foram preparados |
| Ácido clorídrico | Pescador | A144S-500 | 36,5-38,0% com outras marcas funcionam |
| Cloridrato de Cocaína | Lipomed | COC-156-HC-1LM | Descobrimos que o fabricante afeta muito os ensaios AuNP |
| Ácido nítrico | Pescador | A509-SK212 | 65% com outras marcas funcionam |
| Solução de cloreto de sódio, grau 5 M de biorreagente | Sigma | S5150-1L | Soluções estéreis feitas de sólido funcionam |
| Pirocarbonato Dietílico | Sigma | D5758-25 mL | ≥ 97% qualquer marca funciona |
| Cloridrato de Ecgoninemetilester | Lipomed | COC-205-HC-1LM | Obtivemos o controle EME do mesmo fabricante do alvo da cocaína |
| Tubos Microcentrífuga, Axygen Scientific, não estéreis, 1.7 Ml | VWR | 10011-722 | Descobrimos que o fabricante afeta muito os ensaios AuNP, e os tubos foram autoclavados internamente |
| Água livre de nuclease | |||
| metanol |
Referências
- Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
- Mayer, G.
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Reimpressões e permissões
