Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

Resumo

Examinou-se a concepção e desenvolvimento de um ensaio colorimétrico de nanopartículas de ouro-aptâmero para a detecção de moléculas pequenas para aplicações in-the-campo. Além disso, uma aplicação colorimétrico-dispositivo inteligente (APP) foi validado e armazenamento a longo prazo do ensaio foi estabelecido para utilização no campo.

Resumo

Examinou-se a concepção e desenvolvimento de uma nanopartícula aptâmero-ouro (AUNP) ensaio colorimétrico para a detecção de moléculas pequenas para aplicações in-the-campo. ensaios de cor com base alvo seletivo AUNP foram desenvolvidos em laboratório de prova de conceito controladas. No entanto, estes sistemas não têm sido exercida a um ponto de falha para determinar a sua utilização prática para além de configurações de laboratório. Este trabalho descreve uma abordagem genérica para projetar, desenvolver e solucionar problemas de um ensaio colorimétrico aptâmero-AUNP para pequenos analitos moléculas e utilizando o ensaio para as configurações in-the-campo. O ensaio é vantajosa porque aptâmeros adsorvidas passivar as superfícies de nanopartículas e fornecer um meio para reduzir e eliminar respostas falsas positivas para analitos não-alvo. A transição para este sistema usos práticos necessário definir não só o prazo de validade do ensaio aptâmero-AUNP, mas que fixa os métodos e procedimentos que se estende para o capabil armazenamento a longo prazodades. Além disso, uma das preocupações reconhecidos com leitura colorimétrica é a sobrecarga dos analistas para identificar com precisão as mudanças muitas vezes sutis na cor. Para diminuir a responsabilidade sobre analistas no campo, um protocolo de análise de cor foi projetado para desempenhar as funções de identificação de cores sem a necessidade de executar esta tarefa em equipamentos de laboratório grau. O método para criar e testar o protocolo de análise de dados é descrita. No entanto, para compreender e influenciar a concepção de ensaios de aptâmeros adsorvidas, as interacções associadas com o aptâmero, alvo, e AuNPs requerem um estudo mais aprofundado. O conhecimento adquirido pode levar a alfaiataria aptâmeros para melhorar a funcionalidade.

Introdução

Colorimetria é uma das técnicas mais antigas utilizados em química analítica. Para esta técnica, uma determinação qualitativa ou quantitativa do analito é feita com base na produção de um composto colorido ^1. Tipicamente, os ensaios de cor utilizam reagentes que experimentam uma mudança de cor na presença de espécies de analito, o que resulta numa mudança de cor observável ou detectável no espectro de luz visível. Colorimetria foi usado na detecção de alvos que variam a partir de átomos, iões e moléculas pequenas a moléculas biológicas complexas tais como ácidos desoxirribonucleico (ADN), péptidos, proteínas e ^2-4. Para as duas últimas décadas, os nanomateriais revolucionaram o campo de ensaios de detecção, em particular com ensaios baseados cor ^5-6. Combinando as propriedades químicas e físicas únicas dos nanomateriais com um elemento de reconhecimento selectivo alvo, tais como anticorpos, aptâmeros oligonucleótido ou aptâmeros de péptidos, tem levado ao ressurgimento in o design e desenvolvimento de ensaios de detecção colorimétricos ^7.

nanoparticulas metálicas possuem uma propriedade de mudança de cor dependente do tamanho demonstrado, que tem sido explorado na concepção de numerosos ensaios colorimétricos. As nanopartículas de ouro (AuNPs) são de particular interesse devido a uma mudança de cor vermelho-para-azul distinta, quando a solução dispersa de partículas é induzida a agregar ^8, tipicamente através da adição precisa de sal. A capacidade para controlar a transição da disperso (vermelho) ao (azul) estados agregados levou à criação de sensores colorimétricos para iónico, pequena molecular, péptido, proteína, e alvos celulares ^2-4,9. Muitos destes sensores empregar aptâmeros como o motivo de reconhecimento do alvo.

Os aptâmeros são ADN ou moléculas de ácido ribonucleico (ARN) seleccionado a partir de um conjunto aleatório de 10 ¹² -10 ¹⁵ sequências diferentes ^10-11. O processo de seleção identifica alvo reelementos de cognição com afinidades de ligação no regime de baixa nanomolar, ea evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é o processo mais comumente conhecido ^12-13. Vantagens de aptâmeros com base de oligonucleótidos para aplicações de detecção incluem a facilidade de síntese, modificação química controlável, e a estabilidade química ^14-15.

Uma abordagem para a criação de um ensaio colorimétrico combina nanomateriais com elementos de reconhecimento, consiste em combinar estas duas espécies através da adsorção física de moléculas de ADN-aptâmero para superfícies AUNP. Através de ligação ao alvo-aptâmero, o aptâmero experimenta uma mudança estrutural ^16-18 que altera a interacção do aptâmero com a superfície de AUNP, o que leva a uma resposta de vermelho para azul indutível cor ¹⁹ com a adição de sal. Esta característica surpreendente de AuNPs fornece um mecanismo de resposta colorimétrica observáveis ​​para os dispositivos baseados em aptâmeros que podem ser utilizados para deassinar ensaios colorimétricos para diferentes analitos.

ensaios de cor projetada usando não covalentes, aptâmeros de ADN fisicamente adsorvido em superfícies AUNP tem o estigma de ser uma plataforma de sensor fraco devido a problemas com a robustez, uma propensão para o fracasso fora do ambiente controladas de laboratório, bem como a falta de informação disponível para uso em prática configurações. No entanto, o ensaio colorimétrico baseado aptâmero-AUNP era de interesse por causa da simplicidade de funcionamento e resposta de cor observável. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a concepção, desenvolvimento, operação, redução da superfície relacionada resposta falso positivo, e armazenamento de longo prazo de DNA-AUNP ensaios colorimétricos baseados usando a cocaína como substância a analisar representativa. Além disso, propusemos este adsorvida aptâmero abordagem de ensaio (Figura 1) como sendo vantajosa devido à simplicidade e facilidade de uso que resultou em menos etapas do que a abordagem convencional para estes aptâmero-AUNP assays. Para este ensaio, o aptâmero foi adicionado em primeiro lugar para as AuNPs, que foram deixadas para adsorver à superfície por um período de tempo prolongado. Uma vantagem adicional desta abordagem foi a redução de resposta a moléculas de analito não alvo relacionados com interacções de superfície AUNP. No entanto, a redução da resposta falso positivo foi em detrimento da sensibilidade do ensaio. Portanto um equilíbrio entre a proteção da superfície e acessibilidade analito é necessário para manter a função adequado do ensaio. Além disso, um grande defeito de analisar ensaios de cores através de outros meios que não com a instrumentação é que os resultados são muitas vezes subjetivo e aberto à interpretação do analista-to-analista, particularmente quando se tenta diferenciar diferenças sutis de cor. Por outro lado, há uma série de problemas com tornando instrumentação laboratorial utilizável fora do laboratório, tais como disponibilidade de energia, praticidade com portabilidade, etc. Neste trabalho, um protocolo de análise de cor foi desenvolvido para more portabilidade e para eliminar algumas das conjecturas comumente associado com a interpretação ensaio baseado cor ^20-21. Em comparação com abordagens anteriores, esse esforço se esforçado para empurrar estes ensaios para os seus limites para aplicações além de configurações de laboratório.

Protocolo

1. Síntese via Citrato de Redução de Nanopartículas de Ouro (AUNP) e Caracterização

1. Limpar um balão de Erlenmeyer (500 ml) e grande barra de agitação com 5 ml de ácido nítrico concentrado e 15 ml de ácido clorídrico concentrado na capa de segurança química.
   1. Molhar toda a superfície do balão com a lavagem com ácido, lavar o recipiente com água livre de nuclease, e permitir que o balão para secar.
2. Adiciona-se 100 ml de cloreto de ouro 1 mM (III); usar uma folha de papel de alumínio para cobrir a parte superior do ácido limpo Erlenmeyer e calor, com agitação contínua numa placa quente até a ebulição.
3. Adicionar 10 ml de citrato de sódio 38,8 mM. A cor muda de claro / cinza, vermelho para azul / preto, e, finalmente, escuro escuro durante vários minutos. Continuar a agitação com o calor fora durante 10 min.
4. Permitir que a suspensão AUNP arrefecer até à temperatura ambiente e adicionar 110 ul de dietilpirocarbonato (DEPC) com agitação contínua.
5. Cobrir todo o balão comfolha de alumínio e permitir que o tratamento com DEPC a incubar durante a noite. Armazenar todos os AuNPs no escuro, em recipientes de armazenamento de âmbar ou coberto com folha de alumínio.
6. Autoclave a suspensão AUNP, arrefecer à temperatura ambiente e filtrar através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um poro. Armazenar a solução estoque filtrados autoclavado AUNP no escuro a 4 ° C.
   NOTA: O tratamento com DEPC, esterilização por meio de autoclave, e armazenagem a 4 ° C irá melhorar o prazo de validade do ensaio aptâmero-AUNP. Armazenamento desta maneira vai permitir que para o ensaio de permanecer funcionais durante mais de 2 meses.
7. Calcula-se a concentração por AUNP obtenção de absorção ultravioleta-visível a 520 nm, e utilizar o coeficiente de extinção (ɛ) 2,4 x 10 ⁸ L mol ^-1 cm ^-1 com a Lei de Beer, calculando a concentração (C). A concentração foi determinada como sendo 10 nM com um tamanho de 15 nm, determinado por dispersão de luz dinâmica.
   NOTA: As concentrações variam from de lote-para-lote. Diluir os stocks AUNP com água livre de nuclease como necessário para manter a 10 nM AUNP suspensão desejado.

2. DNA-aptâmero, Tampão, Solução, e Ensaio Preparação

1. Comprar ou sintetizar o seguinte cocaína ligação sequências de aptâmeros usando química fosforamidite padrão ^22:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'- GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Purificar os aptâmeros usando dessalinização padrão ^23. Reconstituir oligonucleótidos em água isenta de nuclease em ambos os 100 pM ou soluções de estoque 1 mM. Alíquotas e armazenar a -20 ° C durante vários meses.
3. Aquisição ou preparar stocks de 1 M de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), pH estéril 7,4, cloreto de magnésio 100 mM (MgCl _2), e 1 M de cloreto de sódio (NaCl).
4. Prepare 50 ml de tampão em wi água livre de nucleaseth concentrações de 20 mM de HEPES, 2 mM de _MgCl2, pH 7,4 e armazenar a temperatura ambiente durante meses.
5. Incubar o ADN com a solução estoque AUNP (10 nM) durante 3-4 horas à temperatura ambiente e de proteger contra a luz. Variar o volume de AuNPs conforme desejado para fornecer amostra suficiente para os testes a serem realizados (2,5-7,5 ml).
   1. Aqui, utilizar densidades de carga de 90, 120, 150, e 180 moléculas de ADN / AUNP neste trabalho. Variar o volume e as concentrações de DNA de acordo. Sintonize a cobertura DNA para reduzir AUNP respostas cor relacionada superfície não intencionais de analitos não-alvo.
      NOTA: O aumento da cobertura de ADN vai reduzir a sensibilidade do ensaio. As densidades de carga são calculados a partir sabendo a concentração do estoque AUNP, e o cálculo do número total de AuNPs presentes no volume desejado para o uso em experimentos. Se as densidades reais de cobertura são desejáveis, existem protocolos para obter esses valores ^7. A cobertura de ADN foi determinada utilizando um 50 kDa mpeso olecular coluna de corte de rotação para separar o DNA AUNP vinculados a partir do DNA livre. Os AuNPs são demasiado grandes para passar através da coluna de centrifugação, enquanto que o ADN livre irá passar através facilmente. O próximo passo é quantificar o DNA livre coletados por meio de medidas de absorbância ou um único corante de ADN fluorescente ociosos.
6. Adicionar um volume igual de 20 mM de HEPES, 2 mM de _MgCl2, pH 7,4 e colocar a amostra a 4 ° C no escuro durante a noite. O ensaio foi aptâmero-AUNP em um tampão HEPES 10 mM, MgCl ₂ 1 mM, pH 7,4 (tampão de ensaio).

3. Sal Titulação e Setup Assay

1. Determinar a concentração de sal inicial necessário para induzir a resposta de cor de ensaio por titulação sal com o ensaio em branco. Adicionar 20 ul de metanol (em branco) em 180 mL alíquotas de ensaio aptâmero-AUNP em uma placa de 96 poços. Titular as amostras com volumes crescentes de estoque solução de NaCl (1 M ou 2 M) e determinar o ponto de equivalência (Figura 2 NOTA: O ensaio pode ser dimensionada para volumes mais pequenos, mantendo a proporção de metanol em branco (ou dissolvido analito) para ensaio de aptâmero-AUNP o mesmo.
   1. Aqui, determinar o volume de NaCl necessária para causar a menor mudança de cor por observação visual. A concentração de partida para o ensaio foi de 75 mM e 130 mM durante MN4 e MN6, respectivamente, a uma molécula de ADN de 60 / AUNP densidade cobertura.
      NOTA: Para uma determinação quantitativa da concentração de sal inicial, o ponto médio da curva de titulação serve como um bom ponto de partida. Além disso, as concentrações utilizadas vão variar de acordo com o aptâmero, densidades de cobertura de ADN, a partir de o desempenho do dia-a-dia, e de lote-para-lote.
2. Optimizar a resposta do ensaio, adicionar 20 ul de moléculas de analito diluído em metanol a 180 mL alíquotas de ensaio aptâmero-AUNP em uma placa de 96 poços à temperatura ambiente. Adicionar imediatamente a concentração de NaCl determinado na etapa anterior para iniciar a resposta de cor de ensaio.
   NÃOTE: Utilizar uma pipeta multicanal para realizar experiências múltiplas simultaneamente.
3. Obter o maior possível mudança de cor, aumentando ou diminuindo a concentração de NaCl, e comparando a resposta do alvo para a resposta em branco. Utilizar a concentração de NaCl que fornece a maior diferença de resposta.
4. Observar ou medir a resposta do ensaio 150 seg seguinte NaCl disso. Analisar a absorvância a 650 nm e 530 nm usando um espectrômetro ou obter uma foto de câmera digital da resposta do ensaio (ver secção 4 para o protocolo de análise foto).
   NOTA: um leitor de microplacas foi usada na obtenção das medições para este trabalho.
5. Traçar os resultados como a relação de absorvância obtidos a 650 nm e 530 nm (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ como uma função da concentração de analito. Normalizar a resposta do ensaio com o sinal em branco como foi feito neste trabalho.

4. Foto e Imagem Digital análise de cor Análise de Protocolo

1. preparPT As amostras de ensaio como descrito (seções 3,2-3,3). Colocar a placa de 96 poços num transiluminador.
   NOTA: Uma transiluminador laboratorial padrão é tipicamente muito brilhante para obter imagens digitais utilizáveis ​​para esta análise. Estes transiluminadores provocam regularmente espaçados "linhas escuras" a aparecer na imagem digital, devido à intensidade da fonte de luz. Fazendo uma transilluminator a partir de uma caixa de luz baseado diodo emissor de luz (LED) e um pedaço de plástico opaco funciona bem.
2. Obter fotografias da placa de 96 poços a 150 seg após adição de NaCl, importar as imagens para dentro do software de análise de imagem, e calcula os valores médios de vermelho, verde e azul (RGB), usando uma técnica de média incremental, como se mostra na equação 1 ^24:
   (1)
3. Converter os valores RGB do RGB (sRGB) espaço de cor padrão para o espaço de cor diagrama de cromaticidade (CIExyY), utilizando as seguintes equações ^24:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Converter os valores RGB exponencial para valores RGB lineares usando equação 2. A matriz especificado na equação 3 é usado para calcular a X, Y e Z valores do espaço de cor CIE ^24.
5. Calcular os valores de X e Y cromáticas usando a equação 4 representa a cor média dos pixels na área selecionada para análise ^24.
6. Realizar a análise em cada poço e representar graficamente os valores de cromaticidade para gerar uma curva de calibração (Figura 4). Se obter o erro padrão por análise da cor de diferentes áreas do mesmo poço.

5. Congelamento Aptamer-AUNP Ensaio para armazenamento a longo prazo

1. Prepare os componentes do ensaio de aptâmeros-AUNP conforme descrito nas seções 2.4 e 2.5. Adicione soluções separadas contendo 1 g / ml de trealose e 1 g / ml de sacarose, em água isenta de nuclease para tornar a solução Cryogen.
   NOTA: As concentrações elevadas de trealose e sacarose foram usadas para reduzir o factor de diluição, quando a preparação do ensaio de congelação. Aquecer as soluções de açúcar sobre uma placa quente num copo de água para dissolver completamente os açúcares antes da utilização.
2. Adicione uma solução que contém 19,2 mg / ml de trealose e 4,8 mg / mL de sacarose, com o ensaio de 60 MN4-ADN / AUNP a um volume final de 200 ul em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. concentrações de solução cryogen finais irão variar com cobertura de DNA.
   NOTA: As amostras devem ser congelados não deve exceder 300 ml. Volumes maiores podem não congelar corretamente.
3. Flash congelar as amostras usando um C congelador -146 ° ou em azoto líquido. Armazenar as amostras congeladas até à sua utilização. O armazenamento pode ser numa -80 ° C ou -20 ° C, uma vez piscar congelação está completa.
4. Para este trabalho, deixe as amostras em C congelador -146 ° maisnoite e, em seguida, transferidos para um congelador de -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
   Nota: O Flash congelamento pode causar o aptâmero-AuNPs para agregar. Testar a integridade do processo de congelação por monitorização do perfil de absorvância e comparando-o com uma amostra descongelada. Se for observada a agregação, aumentar a quantidade de solução de criogénio para compensar este problema.
5. Descongelar as amostras à temperatura ambiente e utilizar amostras suficientes apenas na medida do necessário para a experimentação. Obter espectros de absorvância de amostras descongeladas e comparar espectros de linha de base para a de uma solução de criogénio amostra tratada descongelada. Medir a absorvância de 400 nm a 700 nm.
6. Realizar a titulação de sal (secção 3.1), teste o ensaio (ponto 3.2), e traçar os resultados (pontos 3.3 e 3.4), como descrito anteriormente.

Resultados

O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e investigar a estabilidade e robustez do apt�ero com base ensaios colorimétricos AUNP para uso no campo. Como destaque na publicação anterior, duas estratégias distintas para criar o ensaio foram investigados ^7. Os ensaios foram denominado o Aptamer Ensaio Livre eo adsorvida Aptamer de Ensaio. O ensaio foi adsorvida Aptâmero mais atraente para os efeitos de um ensaio de detecção fieldable (Figura 1).

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Discussão

Ao longo da última década, os ensaios colorimétricos à base de nanopartículas têm sido desenvolvidos para a detecção de alvos incluem pequenas moléculas, ADN, proteínas, células e ^2-4. Os ensaios que utilizam ADN aptâmeros com nanopartículas têm vindo a ganhar interesse. Tipicamente, estes ensaios colorimétricos são realizadas por mistura do ADN-aptâmero com moléculas de analito seguida pela adição de AuNPs ^9-10. No entanto, estes ensaios têm sido utilizados em demonstrações de prova de conceito co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de ouro(III) hidratado	Sigma	254169	99,999% de pureza é importante e as soluções eram feitas frescas toda vez
Diidrato de citrato de sódio	Sigma	W302600-1KG-K	Descobrimos que o fabricante afeta muito os ensaios AuNP, e as soluções eram feitas de novo toda vez
Sinergia	Bio-TEK	HT	Qualquer espectrômetro de absorção funciona, mas um leitor de placas oferece múltiplas análises de amostras
4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico (HEPES) Buffer, 1  M esterilizado	Amresco	J848	Qualquer marca esterilizada serve
Corning, 250 ml Sistema de Filtro, 0,22  & micro; Acetato de celulose m	Pescador	430767	Outras membranas foram encontradas para remover os AuNPs
Espectrofotômetro UV	Varian	Cary 300	Qualquer espectrômetro de absorção vai funcionar
Cloreto de Magnésio Hexahidratado	Fluka	63068	≥ 98% de qualquer marca funciona
ADN	IDT	Costume	O DNA foi purificado com uma coluna de dessalinização, técnicas de purificação mais avançadas podem ser usadas
Cloridrato de Procaína	ACROS	AC20731-1000	99% dos estoques de 1 mg/ml de metanol foram preparados
Ácido clorídrico	Pescador	A144S-500	36,5-38,0% com outras marcas funcionam
Cloridrato de Cocaína	Lipomed	COC-156-HC-1LM	Descobrimos que o fabricante afeta muito os ensaios AuNP
Ácido nítrico	Pescador	A509-SK212	65% com outras marcas funcionam
Solução de cloreto de sódio, grau 5 M de biorreagente	Sigma	S5150-1L	Soluções estéreis feitas de sólido funcionam
Pirocarbonato Dietílico	Sigma	D5758-25 mL	≥ 97% qualquer marca funciona
Cloridrato de Ecgoninemetilester	Lipomed	COC-205-HC-1LM	Obtivemos o controle EME do mesmo fabricante do alvo da cocaína
Tubos Microcentrífuga, Axygen Scientific, não estéreis, 1.7  Ml	VWR	10011-722	Descobrimos que o fabricante afeta muito os ensaios AuNP, e os tubos foram autoclavados internamente
Água livre de nuclease
metanol