Aqui nós descrevemos um protocolo para a geração de células-tronco humanas pluripotentes induzidas por a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes, utilizando um sistema lentiviral sem células alimentadoras.
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Artigo de método
Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide
Neste artigo
Resumo
Resumo
células somáticas adultas pode ser revertida em um estado de células estaminais pluripotentes-like usando um conjunto definido de fatores de reprogramação. Numerosos estudos têm gerado induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) a partir de vários tipos de células somáticas por transdução de quatro Yamanaka fatores de transcrição: Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc. O estudo das iPSCs permanece na vanguarda da pesquisa biológica e clínica. Em particular, iPSCs específicos do paciente pode ser usado como uma ferramenta para o estudo pioneiro de patobiologia doença, uma vez que iPSCs pode ser induzida a partir do tecido de qualquer indivíduo. A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crónica, classificada pela destruição da cartilagem e do osso na estrutura da articulação. hiperplasia sinovial é uma das principais razões ou sintomas que levam a estes resultados em RA. Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) são as principais células de componentes na membrana sinovial hiperplásica. FLSS na articulação limitlessly proliferam, eventualmente, invadindo o CARTIL adjacenteidade e osso. Actualmente, a sinóvia hiperplásica só pode ser removido por um procedimento cirúrgico. A sinóvia removido é utilizado para a investigação AR como um material que reflecte a condição inflamatória da articulação. Como um jogador importante na patogênese da AR, FLSS pode ser usado como um material para gerar e investigar as iPSCs de pacientes com AR. Neste estudo, foi utilizado o FLSS de um paciente com AR para gerar iPSCs. Utilizando um sistema de lentivírus, descobrimos que pode gerar FLSS RA iPSC específica para cada paciente. As iPSCs gerados a partir FLSS pode ser ainda utilizado como uma ferramenta para estudar a patofisiologia da RA no futuro.
Introdução
células-tronco pluripotentes são a plataforma de próxima geração em vários campos clínicos e biológicos. Eles são uma ferramenta promissora que podem ser utilizados nos modelos de doença, o rastreio de drogas, e a terapia médica regenerativa. Human Embryonic Stem Cells (hESCs) foram usados principalmente para estudar e compreender células pluripotentes. No entanto, isolado pela destruição do blastocisto humano, hESCs estão associados com vários problemas éticos. Em 2007, o Dr. Shinya Yamanaka e sua equipe reverteu o processo de programação celular e desenvolveu células-tronco de adultos humanos células somáticas 1,2. Portanto, ao contrário de hESCs, induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) podem ser gerados a partir de células somáticas adultas, evitando os obstáculos éticos.
Normalmente, iPSCs são gerados através da entrega de quatro genes exógenos: Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc. Esses fatores Yamanaka são originalmente entregues usando sistemas de lentivírus e retrovirais. Os primeiros iPSCs foram derivadas de rato c somáticaells 3. Mais tarde, a técnica foi aplicada para fibroblastos dérmicos humanos 1,2. Estudos subsequentes com êxito iPSCs gerado a partir de várias fontes, tais como urina 4, sangue 5,6, queratinócitos 7, e vários outros tipos de células. No entanto, existem algumas células somáticas que não foram utilizados na reprogramação, e rastreio das capacidades de reprogramação de vários tipos de células específicas de tecidos no estado de doença, é ainda necessária.
A artrite reumatóide (AR) é uma doença que pode atingir todas as articulações e levar a doenças auto-imunes em outros órgãos. RA afeta cerca de 1% dos adultos no mundo desenvolvido. É uma doença bastante comum e sua incidência aumenta a cada ano 8. No entanto, o RA é difícil identificar nas fases iniciais e oncebone destruição ocorre não há nenhum tratamento que pode recuperar o dano. Além disso, a eficácia do fármaco varia de paciente para paciente, e que é difícil prever a medicINE que é necessário. Por conseguinte, é necessário o desenvolvimento de um método de rastreio de drogas, e um material de célula que pode reflectir as condições da AR é necessária.
Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) é um participante ativo celular na patogênese da AR 9,10. FLSS existem no revestimento sinovial da íntima entre a cápsula e a cavidade articular, a qual também é referida como a membrana sinovial. Ao apoiar a estrutura conjunta e fornecer nutrientes para a cartilagem circundante, FLSS geralmente desempenham um papel crucial na função e manutenção conjunta. No entanto, FLSS na AR têm um fenótipo invasivo. RA FLSS têm um fenótipo de câncer, como, eventualmente, destruir o osso circundante por uma proliferação infinita 10. Com esta característica única, FLSS pode ser usado como um material promissor que pode reflectir a patobiologia de RA. No entanto, estas células são raramente produzidos, e os fenótipos celulares como alterar as células passam por várias passagens in vitro condições. Portanto, pode ser complicado de usar RA FLSS como uma ferramenta que pode representar o estado do paciente.
Teoricamente, RA iPSCs derivadas de pacientes (RA-iPSCs) pode se tornar uma ferramenta ideal para o rastreio de drogas e novas pesquisas. IPSCs gerados têm capacidade de auto-renovação e pode ser mantido e expandido in vitro. Com pluripotência, essas células podem ser diferenciadas em linhagens de condrócitos e osteócitos maduras, que podem contribuir material celular para a pesquisa específica na AR e outras doenças relacionadas com os ossos 11.
No presente estudo, nós demonstramos como isolar e expandir FLSS a partir de uma membrana sinovial removido cirurgicamente, e como gerar RA-iPSCs de FLSS usando lentivírus que contêm factores Yamanaka.
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Protocolo
Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861).
1. Isolamento e sinoviito de expansão
- Isolamento sinovi�ito
- Esterilizar dois pares de tesouras cirúrgicas e um par de fórceps.
- Transferir o tecido sinovial para uma placa de 100 mm e lava-se com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina / estreptomicina.
- Cortar os resíduos de tecido de gordura e ossos amarelados. Transferir o tecido cortado para um poço de uma placa de 6 poços e adicionam-se 5 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 20% (FBS).
- Pique os tecidos com a tesoura até que as peças são pequenas o suficiente para penetrar uma pipeta descartável.
- Transferir o meio contendo tecido para um tubo cónico de 50 ml. Colher o material remanescente por adição de 5 ml de DMEM com FBS a 20% para a placa de 6 poços e, em seguida, transferir para o tubo.
- colagenase Thaw no gelo. Adicionar a colagenase a uma concentração final de 0,01% e selar o tubo com parafilme. Incubar em um banho de água a 37 ° C com agitação durante 4 h.
- Após a incubação, encher o tubo com o meio DMEM com FBS a 20%, até que o volume total é de 50 ml e centrifugar a 300 xg, à ta durante 10 min.
- Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicione 40 ml de meio para ressuspender o sedimento.
- Repita os passos 1.1.10-1.1.11.
- Ressuspender o sedimento em 25 ml de DMEM com 20% de FBS e esperar que as grandes aglomerações de tecido para desviar para o fundo.
- Transferir o sobrenadante para uma placa de 100 mm e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 14 dias.
- Sinovi�ito Manutenção e Expansão
- Descartar os meios utilizados a partir da placa e lavar as células com 5 ml de PBS.
- Adicionar EDTA 1 ml de PBS / 1 mM e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 2 min.
- Toque o prato delicadamente e transfer as células para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células a 250 xg, TA, durante 2 min.
- Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e ressuspender o sedimento em 30 ml de DMEM com 20% de FBS.
- Transferir as células a 3 x 100 mm, sem deixar qualquer material restante visível.
- Substituir a mídia com meios frescos a cada 3 d. Dividir as células a 80% de confluência utilizando EDTA 1 ml de PBS / 1 mM. Manter até 3 de passagem antes do uso. Divida cada prato de células em 3 pratos em cada divisão.
NOTA: Depois de alcançar passagem 3, as células que não estão indo para ser utilizado de imediato pode ser congelado.
2. Reprogramação FLSS Usando lentivírus que codificam fatores de Yamanaka
- Transdução (D0)
- Seed 3 x 10 4 culas por po de uma placa de 6 poços em meio de crescimento (500 ml de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina). Incubar as células O / N a 37 ° C em 5% de CO2.
- No dia seguinte, remover um frasco de lentivírus contendo 4 Yamanaka factores: Oct4, KLF4, Sox2 e c-Myc a partir do congelador e descongelamento, a 4 ° C. Nota: Lentivírus foi produzido pelo processo descrito no nosso estudo anterior 11.
- Enquanto o descongelamento do vírus, alterar os meios de comunicação para a mídia de crescimento FLS (20% FBS além de antibióticos em DMEM) contendo / ml de brometo de Hexadimetrina 10 mg e ácido ascórbico 50 mg / ml.
- Depois de alterar a mídia, adicionar 30 ul de lentivírus para as células e misture delicadamente. Para melhorar a infecção Centrifugar a placa a 680 x g, 35 ° C durante 30 min.
- Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Manutenção Até reprogramação é visível
- Durante 3 dias, substitui os meios diariamente com meio de crescimento FLS contendo 0,1 mM de butirato de sódio e ácido ascórbico a 50 ug / ml.
- No dia seguinte, substituir a mídia com uma mistura de meios de crescimento FLS emeios iPSC (proporção 1: 1) contendo 0,1 mM de butirato de sódio e ácido ascórbico a 50 ug / ml.
Nota: Os componentes dos meios iPSC é dada na lista de materiais / equipamentos.
- As células de divisão de Formação de Colónias
- Prepara-se uma placa de 6 poços revestidas com vitronectina.
- Adicionar 60 ul de vitronectina a 6 ml de PBS, sem Ca 2+ e Mg 2+. Coloque 2 ml de cada mistura em poços e incuba-se temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. Nota: A concentração de trabalho de vitronectina é de 5 ug / mL.
- No D5, lavar as células com PBS.
- Adicionar 1 ml de PBS / 1 mM EDTA para separar as células e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 min.
- Colheita das células e centrifugar a 250 xg, TA, durante 2 min.
- Dividir as células em 3 diferentes proporções (1: 3, 1: 6 e 1: 9) para se conseguir diferentes confluencies. Adicionar 900 ul de meios de comunicação para a pelete de células e ressuspender. Adicionar 300, 150, e 100 uL da mistura de células por poço de uma 6-bem placa para conseguir uma proporção de 1: 3, 1: 6, e 1: 9, respectivamente.
- Substitua os meios de comunicação diária com a mídia IPSC até colónias aparecer. Colónias aparece após cerca de D18. Nota: Nesta fase, as colónias IPSC co-existir com o FLSS não reprogramada.
- Prepara-se uma placa de 6 poços revestidas com vitronectina.
- picking Colony
- Prepara-se uma placa revestida com vitronectina de 48 poços por adição de 500 ul de vitronectina aos poços, e incuba-se à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- Coloque o microscópio sobre uma bancada limpa, e remover a placa de 6 poços da incubadora.
- Remover a solução de vitronectina a partir da placa de 48 poços e adicionar 500 ul IPSC meios suplementados com 10 mM de Rho-associado, em espiral enrolada contendo proteína cinase (ROCHA) inibidor.
- Usando uma ponta 10p pipeta, corte em torno da colônia. Transferir a colónia escolhido para um poço da placa de 48 poços.
- Depois de escolher várias colónias, incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Manter as células até que as colónias são grandes enough para transferência. Nota: Normalmente as células derramado quando a colónia fica fora do campo visível do microscópio, quando visto uma ampliação de 100X.
3. Imunofluorescência Coloração
- Preparação de Células
- Colocar uma tampa de vidro 18 milímetros estéril para uma placa de 12 poços.
- Adicionar 1 ml de PBS para esfriar e lave a tampa de vidro.
- Substituir com 1 ml de uma solução / 10 ug mL de vitronectina.
- Incubar a placa a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- Descartar a solução vitronectina e iPSCs placa na placa de 12 poços revestida com vitronectina e cultura durante 7 dias a 37 ° C, 5% de CO 2, mudando os meios diariamente.
- A coloração celular
- Descartar o meio de cultura e lava-se as células uma vez com PBS.
- Fixar as células em 0,4% de paraformaldeído (PFA) durante 30 min à TA.
- Permeabilizar as células com 0,1% de Triton X-100 durante 5 min à TA.
- Remover a permeabilizaçãosolução e bloco com PBS contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) durante 30 min à temperatura ambiente.
- Dilui-se a anticorpos em PBS contendo BSA a 2% de acordo com a Tabela 1. Incubam-se as células com os anticorpos primários durante 2 h à RT.
- Adicionar o anticorpo secundário (diluído 1: 200) e incuba-se as células durante 1 h à temperatura ambiente, evitando a luz.
- Tratar as células com 1 ul / ml de DAPI durante 10 min.
- Colocar a tampa de vidro na parte superior da lâmina de vidro com antifade reagente e incubar à TA durante 24 horas, evitando a luz.
- Verificar a expressão com um microscópio de fluorescência.
4. em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)
- Extrair ARNm a partir do sedimento celular utilizando o tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio método de extracção 11.
- Amplificar o ADNc a partir de 2 ug de ARNm total usando transcrição reversa 11.
- Misturar os componentes necessários para a PCR utilizando 2 ul de ADNc de METplaca 11.
- Execute RT-PCR e verificar os resultados por eletroforese em gel de 11.
5. fosfatase alcalina (AP) Coloração
- IPSCs cultura durante 5-7 dias a 37 ° C, 5% de CO 2 antes da coloração.
- Aspirar os meios de comunicação e corrigir as células com PFA 4% durante 1 min.
- Descartar o fixador e lavar as células com tampão de lavagem 1X.
- Prepare os reagentes para coloração com AP. Misturar os reagentes nas seguintes proporções Fast Red Violet: solução de fosfato de Naftol AS-BI: água = 2: 1: 1.
- Incubam-se as células com a solução de coloração à TA durante 15 min, evitando a luz.
- Descartar a solução de coloração e lavar as células com tampão de lavagem.
- Cobrir as células com PBS para evitar a secagem e verificar a expressão utilizando um microscópio de campo brilhante.
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Resultados
Neste estudo, nós descrevemos um protocolo para gerar iPSCs de FLSS usando um sistema lentiviral. A Figura 1A mostra um esquema simples do protocolo de isolamento FLS. A seguir à remoção cirúrgica da membrana sinovial, o tecido foi cortado em pequenos pedaços utilizando uma tesoura cirúrgica. A colagenase foi adicionado para isolar as células dos aglomerados de tecido. As células foram incubadas durante 14 dias antes de processamento adicional. A Figura ...
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Discussão
Antes da descoberta da iPSCs, os cientistas usaram principalmente os CES para estudar a biologia de células-tronco e outras linhagens de células através da diferenciação. No entanto, os CES originam a partir da massa interna de um blastocisto, que é um embrião de fase inicial. Para isolar os CES, a destruição do blastocisto é inevitável, levantando questões éticas que são impossíveis de superar. Além disso, embora os CES têm características stemness e pluripotência, eles não podem ser obtidos a partir de indivíduos e às...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa financiado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças da Coreia (HI13D2188).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Prato de 100 mm | TPP | 93100 | |
| Placa de 6 poços | TPP | 92006 | |
| Tubo córnico de 50 ml | SPL | 50050 | |
| Tubo córnico de 15 ml | SPL | 50015 | |
| Pipeta descartável de 10 ml | Falcon | 7551 | |
| Pipeta descartável de 5 ml | Falcon | 7543 | |
| Placa de 12 poços | TPP | 92012 | |
| FLS Materiais de Isolamento | |||
| Tesoura | |||
| Pinça | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilina Estreptomicina | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Colagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoetanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies | P4333 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | ingrediente de mídia iPSC (500 ml) |
| Bicarbonato de Sódio | Life Technologies | 25080-094 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 543 μ g/ml) |
| Selenito de Sódio | Sigma Aldrich | S5261 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 14 ng/mL) |
| Aldrich | T3705 | Transfferin Sigma Humana | (Conc.: 10.7 μ g/ml) |
| Ingrediente básico da mídia FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 20 μ g/ml) |
| TGF&beta humano; 1 | Peprotech | 100-21 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ácido Ascórbico | Sigma | Aldrich A8960 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 64 μ g/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Butirato de Sódio | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectina | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inibidor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Materiais de Controle de Qualidade | |||
| 18 mm Vidro de Cobertura | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tecnologia & Inovação | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anticorpo anti-SSEA4 | Millipore | MAB4304 | |
| Anticorpo anti-Oct4 | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Anticorpo | Millipore | MAB4360 | |
| Anticorpo anti-Sox2 | Biolegend | 630801 | |
| Anticorpo anti-TRA-1-81 Anticorpo | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 anticorpo IgG (H+L) de cabra Ponta | prova molecular | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 anticorpo IgG (H+L) de cabra anti-coelho | Sonda molecular | A11037 | |
| A ponta de prova molecular | D1306 | ||
| de DAPI prolonga o reagente antifade do ouro | Invitrogen | P36934 | |
| Vidro da corrediça, revestido | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Clorofórmio | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Etanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid Kit de Síntese de cDNA de Fita | Inicial Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polimerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| estrela de carregamento | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) marcador de escada de DNA | Enzynomics | DM003 | |
| Fosfatase alcalina | Millipore | SCR004 |
Referências
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- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).
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Reimpressões e permissões
