Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Summary

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Abstract

Estudos genéticos populacionais e familiares geralmente resultam na identificação de variantes genéticas estatisticamente associadas a uma doença clínica ou fenótipo. Para muitas doenças e características, a maioria das variantes não é codificante e, portanto, provavelmente agirá impactando mecanismos sutis e comparativamente difíceis de prever que controlam a expressão gênica. Aqui, descrevemos uma abordagem estratégica geral para priorizar variantes não codificantes e examiná-las quanto à sua função. Essa abordagem envolve priorização computacional usando bancos de dados genômicos funcionais seguidos de análise experimental da ligação diferencial de fatores de transcrição (TFs) a alelos de risco e não risco. Para a análise do ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) e do ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) de variantes genéticas, um oligonucleotídeo de DNA sintético (oligo) é usado para identificar fatores no lisado nuclear de células relevantes para doenças ou fenótipos. Para EMSA, os oligonucleotídeos com ou sem fatores nucleares ligados (geralmente TFs) são analisados por eletroforese não desnaturante em um gel de poliacrilamida tris-borato-EDTA (TBE). Para DAPA, os oligonucleotídeos são ligados a uma coluna magnética e os fatores nucleares que se ligam especificamente à sequência de DNA são eluídos e analisados por espectrometria de massa ou com eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio redutor (SDS-PAGE) seguida de análise de Western blot. Essa abordagem geral pode ser amplamente utilizada para estudar a função de variantes genéticas não codificantes associadas a qualquer doença, característica ou fenótipo.

Introduction

Sequenciação e estudos de genotipagem baseados, incluindo Estudos do Genoma-Wide Association (GWAS), estudos locus candidato, e deep-sequenciação estudos, identificamos muitas variantes genéticas que estão estatisticamente associados com uma doença, característica ou fenótipo. Ao contrário do que as previsões iniciais, a maior parte destas variantes (85-93%) estão localizados em regiões não codificantes e não alteram a sequência de aminoácidos de proteínas de ^1,2. Interpretando a função destas variantes não-codificantes e determinar os mecanismos biológicos que ligam-los para a doença associada, traço, ou fenótipo provou desafiador ^3-6. Nós dese....

Protocol

1. Preparação de soluções e Reagentes

1. Encomendar sondas de oligonucleotídeos de DNA personalizados para uso em EMSA e DAPA.
   1. Para reduzir a proteína de ligação não específica, conceber oligonucleótidos curtos (entre 35-45 pares de bases (pb) de comprimento) ^30, e colocar a variante de interesse directamente no centro flanqueado por sua sequência genómica endógena de 17 pb. Para oligos EMSA, adicione um 'fluoróforo 5. Para oligos DAPA, adicionar uma marca 5 'biotina.
   2. Pedir tanto a cadeia de sentido e a sua cadeia complementar reverso. Alternativamente, duplex ordem (pré-recozido) oligos. Ao nomear os oligos, basear a nom....

Results

Nesta seção, os resultados representativos do que esperar são fornecidos ao executar uma EMSA ou DAPA, ea variabilidade no que diz respeito à qualidade do ligado é caracterizado. Por exemplo, tem sido sugerido que a congelação e descongelação de amostras de proteína várias vezes pode resultar na desnaturação. A fim de explorar a reprodutibilidade das análises EMSA no contexto destes ciclos de "congelamento-descongelamento", dois 35 oligos bp que diferem em uma variante genética foram inc.......

Discussion

Apesar de avanços em tecnologias de sequenciamento e genotipagem tem bastante reforçada a nossa capacidade para identificar variantes genéticas associadas à doença, a nossa capacidade de compreender os mecanismos funcionais impactados por estas variantes está atrasado. Uma das principais fontes do problema é que muitas variantes associados à doença estão localizados em n-codificante em regiões do genoma, que provavelmente afectam mais difícil de prever mecanismos que controlam a expressão do gene. Aqui, nós aprese.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotídeos de DNA personalizados	Tecnologias		de DNA integradas http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
cloreto de potássio	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, para tampão CE
HEPES (1 M)	Fisher Scientific	15630-080	Para tampão CE e NE
EDTA (0,5M), pH 8,0	Life Technologies	R1021	Para CE, NE e tampão de recozimento
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, para tampão NE
Tris-HCl (1M), pH 8,0	Invitrogen	BP1756-100	Para tampão de recozimento
Tamponamento de fosfato Salino tamponado (1x)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, para lavagem celular
Solução de DL-Ditiotreitol (1 M)	Sigma	646563	Agente redutor
Inibidor de protease Coquetel	Thermo Scientific	87786	Previne o catabolismo de TFs
Inibidor de Fosfatase Coquetel	Thermo Scientific	78420	Previne a desfosforilação de TFs
Nonidet P-40 Substituto	IBI Scientific	IB01140	NP-40, para extração nuclear
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Thermo Scientific	23225	Para medir a concentração de proteína
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contém todos os tampões EMSA necessários
TBE Gels, 6%, 12 Poços	Invitrogen	EC6265BOX	Para EMSA
TBE Buffer (10x)	Thermo Scientific	B52	Para EMSA
Kit de Partida FactorFinder	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contém todos os buffers DAPA necessários
Licor Odyssey CLx	Licor		Scanner recomendado para DAPA/EMSA
Antibiótico-Antimicótico	Gibco	15240-062	Contém 10.000 unidades/ml de penicilina, 10.000 µ g/ml de estreptomicina, e 25 µ g/ml de Fungizone® Soro Fetal Bovino Antimicótico
	Gibco	26140-079	FBS, para meios de cultura
RPMI 1640 Médio	Gibco	22400-071	Contém L-glutamina e 25 mM HEPES