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Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

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DOI:

10.3791/54096

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19 de junho de 2016

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1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Neste artigo

Resumo

As moléculas de orientação do axônio regulam a migração neuronal e a navegação direcionada do cone de crescimento. Apresentamos um método poderoso, o ensaio de listras, para avaliar a capacidade das moléculas de orientação de atrair ou repelir neurônios. Neste protocolo, demonstramos o ensaio de listra mostrando a capacidade do FLRT2 de repelir neurônios do hipocampo cultivados.

Resumo

Os axônios em crescimento desenvolvem uma estrutura altamente móvel em sua ponta, denominada cone de crescimento. O cone de crescimento entra em contato com pistas ambientais extracelulares para navegar no crescimento axonal. Netrina, fenda, semaforina e efrinas são moléculas de orientação conhecidas que podem atrair ou repelir axônios ao se ligarem a receptores e co-receptores no axônio. Os receptores ativados iniciam várias moléculas de sinalização no cone de crescimento que alteram a estrutura e o movimento do neurônio. Aqui, descrevemos o protocolo detalhado para um ensaio de listra para avaliar a capacidade de uma molécula guia de atrair ou repelir neurônios. Neste método, neurônios dissociados do hipocampo de camundongos E15.5 são cultivados em placas revestidas com laminina processadas com listras alternadas de ectodomínio de fibronectina e proteína transmembrana rica em leucina-2 (FLRT2) e proteína de controle da região cristalizável (Fc) do fragmento de imunoglobulina G (IgG). Tanto os axônios quanto os corpos celulares foram fortemente repelidos das regiões de listras revestidas com FLRT2 após 24 h de cultivo. A imunocoloração com tau1 mostrou que ~ 90% dos neurônios estavam distribuídos nas listras revestidas com Fc em comparação com as listras revestidas com FLRT2-Fc (~ 10%). Este resultado indica que o FLRT2 tem um forte efeito repulsivo sobre esses neurônios. Este poderoso método é aplicável não apenas para neurônios cultivados primários, mas também para uma variedade de outras células, como neuroblastos.

Introdução

Orientação Axon é o processo pelo qual os neurónios recentemente formadas enviar axónios para o alvo durante o desenvolvimento do sistema nervoso 1,2. axônios em desenvolvimento realizar uma estrutura altamente móveis em sua ponta chamado cone de crescimento. O cone de crescimento detecta sinais extracelulares para navegar o caminho do axônio. Moléculas de orientação, tais como fenda, semaforina, e Efrinas, pode atrair ou repelir axônios dependendo de sua interação com receptores adequados e co-receptores na axônio 1,3,4. Os receptores activados transferir sinais para o cone de crescimento que afetam sua organização do citoesqueleto para axônio e crescimento de cone movimentos.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a acção de moléculas atractivas e repelentes. Quimio-atractores e repelentes pode ser administrado para o meio de crescimento / cultura com uma concentração de gradiente (por ex., Câmara de Dunn ou u-lâminas) 5,6, em um local altamente concentrada por micro-Pipette (por exemplo., ensaio de torneamento) 7 ou a uma concentração homogénea por aplicação de banho (por exemplo., ensaio de colapso do cone de crescimento) 8,9.

Outros métodos incluem um ensaio de listra ou impressão microcontact (μCP), em que um quimio-atractor ou repelente é revestido sobre a superfície de uma placa como um substrato 10-12. Thestripe ensaio foi originalmente desenvolvido por Bonhoeffer e seus colegas em 1987 para analisar o mapeamento topográfico do pintainho sistema retino-tectal 13. O método original necessário um sistema de vácuo para proteínas de revestimento para membranas de policarbonato Nucleopore usando listrado e matrizes em malha. Nas versões mais recentes, as proteínas recombinantes foram directamente impressa sobre a superfície de uma placa de cultura num padrão listrado utilizando matrizes de silício estreita fenda 14,15. Recentemente, vários grupos de pesquisa têm aplicado com sucesso neste ensaio tarja para a análise das actividades de moléculas de orientação axônio 16-21.

Aqui, apresentamos o protocolo detalhado para um ensaio de tarja que mede a atração ou repulsão de moléculas de orientação axônio para os neurônios do hipocampo dissociados. Notavelmente, este método pode ser aplicado em ambientes laboratoriais minimamente equipados. Para este ensaio, as listras alternadas de um substrato marcado por fluorescência e uma proteína de controlo são gerados em um prato de plástico utilizando uma matriz de silício com fendas 90 mícrons e revestidas com laminina. Em nossa demonstração, dissociada neurônios do hipocampo de camundongos E15.5 foram cultivadas em faixas alternadas de ectodom�io recombinante de fibronectina e proteína-2 transmembrana (FLRT2) rica em leucina e controlar proteína Fc 21. Após 24 h de cultura, ambos os axónios e corpos celulares dos neurónios foram fortemente repelido das listras FLRT2. A coloração com um anticorpo anti-Tau1 ~ revelou que 90% dos neurónios foram distribuídos nas regiões revestidas com Fc, em comparação com ~ 10% na FLRT2-Fc, indicando que tem uma forte FLRT2 repulsivofunção para os neurônios do hipocampo 21.

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Protocolo

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal em Hamamatsu University School of Medicine.

1. Preparação de Matrizes

  1. Ferver 4-8 matrizes de silicone em um forno de microondas ou num prato quente durante 5 minutos e deixar secar completamente durante 1 h sob um fluxo laminar (lado listrado para cima).
    Nota: Os seguintes procedimentos devem ser realizados sob fluxo laminar.
  2. Soprar ar comprimido ou com fita adesiva transparente para remover qualquer poeira do lado listrado das matrizes. Mantenha o lado limpo listrado para que ele possa aderir firmemente à superfície da chapa.
  3. Com cuidado, coloque as matrizes em placas de plástico de 6 cm, pressionando com um dedo (uma matriz por prato; tarja lado de baixo). Evite ficar bolhas de ar entre a matriz eo prato. Marcar a localização das tiras no lado inferior da placa de cultura.
  4. Se a matriz não anexar, repita a partir do passo 1.2.

2. Stripe Geração e laminina Revestimento de Cultura Neuron

  1. Prepare a proteína recombinante marcada com fluorescência (25 ul cada injectável [passo 2.2] ou 100 ul de cada um para o método de colocação [passo 2.2.1]) misturando a proteína Fc-tag (10-50 ug / ml) e uma dye- fluorescente anticorpo anti-Fc humano conjugado (1 a 3 rácio: 30-150 ug / ml) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, incuba-se a mistura durante 30 min à TA.
  2. Utilizando uma seringa de 22-L, 25 ul de injectar a proteína recombinante foi preparada na etapa anterior (2.1) através do pequeno orifício no lado da matriz (setas na Figura 1A, 1C, 1E e).
    1. Em alternativa, colocar 100 ul da proteína recombinante no topo fenda da matriz e aspirado de cerca de metade da solução do pequeno orifício (setas na figura 1A, 1C e 1E), de modo que a proteína recombinante permanece nas regiões listradas.
  3. Incubar o prato durante 30 miN a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.
  4. Coloque 300 ul de PBS na fenda superior (Figura 1B) e aspirado a partir do pequeno orifício localizado no lado da matriz (setas na figura 1A, C e E) para remover as proteínas recombinantes não acopladas. Não aspirar o PBS completamente, porque as proteínas vai secar. Repita esta etapa duas vezes. (3 vezes no total)
  5. Cuidadosamente remover a matriz e colocar imediatamente ~ 100 ul de proteína de controlo (10-50 ug / ml de Fc) para cobrir a área listrada inteira, criando um revestimento alternativo. Em seguida, o prato incubar durante 30 min a 37 ° C na incubadora de cultura de células.
  6. Depois de se lavar a superfície do prato três vezes com PBS, revesti-la com ~ 100 mL de 20 ug / ml em PBS laminina.
    Nota: A laminina devem ser descongeladas em gelo para evitar a solidificação.
  7. Incubar a placa durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de cultura de células.
  8. Lavar a superfície do prato três vezes com PBS e adicionar cultura Medium. Colocar a cápsula revestida com meio de cultura numa incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C até à sua utilização.

3. A cultura neurônios do hipocampo de embriões de camundongos E15.5

  1. Euthanize mãe via deslocamento cervical e isolar três E15.5 embriões.
  2. Cortar a pele do crânio e sagital na linha média da cabeça com uma tesoura, e remover o cérebro utilizando uma colher pequena. Transferir o cérebro cuidadosamente para um prato de 60 mm de Petri contendo 3 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS).
  3. Utilizando um bisturi, cortar os hemisférios incluindo córtex, hipocampo e corpo estriado (Figura 2A). Em seguida, dissecar a região do hipocampo pela remoção cuidadosa das meninges, e transferir os tecidos do hipocampo dissecados para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 2 ml de solução HBSS, em gelo (Figura 2B-C). Recolhe 6 hipocampos de embriões 3 no tubo, que são suficientes para a cultura de neurónios em 8 pratos.
  4. Substitua o HBSS solução com uma solução de tripsina / EDTA (2 ml) e incuba-se o tubo a 37 ° C durante 15 min num banho de água.
    Nota: Aspirar HBSS sem centrifugação e não decantar a solução de HBSS por inclinação do tubo.
  5. Neutraliza-se a actividade da tripsina por adição de 500 uL de soro fetal de bovino (FBS).
  6. Centrifugar a mistura a 100 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento com 2 mL de meio de cultura. Repita este passo mais uma vez.
  7. Pipet os hipocampos cima e para baixo 10 vezes em meio de cultura, utilizando uma ponta de 1.000 l com um grande furo (cut-ponta) para dissociar o tecido.
  8. Mudar para um regular (sem cortes) ponta de 1.000 mL e pipete o tecido dissociado cima e para baixo para obter uma suspensão de uma única célula.
  9. Separar as células individuais, passando-os através de um filtro de células de malha 80-100 mícrons.
  10. Centrifugar a suspensão de célula única filtrado a 150 xg durante 5 min.
  11. Remover o sobrenadante por aspiração, e ressuspender o Pellet (neurónios) em 2 ml de meio de cultura.
  12. Contar as células utilizando um hemocitómetro, com coloração com azul de tripano para determinar a densidade e viabilidade. Então, placa 10.000 neurônios em 150 mL de meio de cultura para cada conjunto de suspensão stripes.The deve ser cuidadosamente colocada para cobrir a região faixa inteira.

4. Visualização dos corpos celulares e axônios por imunofluorescência Coloração uso de um anti-Tau1 Antibody

  1. Após 24 h de cultura, aspirar o meio, sem perturbar as células aderentes, e fixar os neurónios pré-aquecido com 4% de paraformaldeído (PFA) / 4% de sacarose / PBS a TA durante 15 min.
  2. Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Se desejado, utilizar uma caneta repelente de água para desenhar um círculo em torno da região listrado para diminuir a quantidade de anticorpo necessária.
  3. Permeabilizar os neurónios com 0,3% de Triton X-100 / PBS durante 5 min.
  4. Incubar os neurónios com solução de bloqueio que continha 3% de soro de burro e 0,1% de Triton X-100 durante30 min, seguido por incubação com um anticorpo anti-Tau1 (1: 200) em soro de burro a 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C.
  5. Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Incubar os neurónios com um anticorpo IgG anti-ratinho conjugado com fluoróforo em 1% de albumina de soro bovino (BSA) /0.1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min.
  6. Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Cobrir a região listrado com um x 18 mm tampa de vidro 18 mm, utilizando 50 ul de antifade solução. evitar bolhas de ar, os quais interferem com a imagem latente.
  7. Obtenção de imagens fluorescentes com um microscópio de fluorescência utilizando o sistema apropriado, por exemplo, x10 lente objectiva, conjuntos de filtros para GFP e RFP, e tempo de exposição de 1000 mseg (Figura 3).

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Resultados

Neurônios do hipocampo dissociada de camundongos E15.5 foram semeados e cultivados por 24 h em listras de fluorescente etiquetado controle Fc (Figura 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando com Fc não marcado controle. Em ambos os casos, os neurônios foram agregadas e estendeu seus axônios como pacotes. No controle listras Fc / Fc, os neurônios foram distribuídos uniformemente sobre as listras fluorescente etiquetado e não marcadas, e eles estenderam ...

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Discussão

Este protocolo descreve um ensaio de faixa que usa proteína recombinante e os neurónios dissociados a partir de hipocampo de rato E15.5. Este ensaio permite a observação de respostas repulsivas eficiente, atraentes, ou neutras de neurónios para uma proteína recombinante de interesse colocado num padrão às riscas. Uma grande vantagem deste protocolo é o método simples para gerar as tiras, em que a proteína está directamente impressos sobre a superfície de um prato de plástico, em comparação com o método tradicional, o qu...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por Grants-in-Aid for Scientific Research da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (23700412, 25122707 e 26670090 to S.Y.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de centrífuga de 15 mlViolamo 1-3500-01
4% Paraformaldeído (PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Anticorpo anti-IgG humano de cabraThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Anticorpo IgG anti-rato de burroThermo ScientificA-21203Diluição 1/500
Anti-Tau1 DiluiçãoChemiconMAB34201/200
AntifadeThermo ScientificP7481Meios de montagem alternativos podem ser usados
Suplemento B27Thermo Scientific17504-044Diluição 1/50
Albumina de soro bovinoSigma01-2030-2
Filtro de células 100 umBD Falcon352360
Máquina de centrifugaçãoKubota2410
Vidro de cobertura 18mmx18mmCaneta Matsunami18x18 mm No. 1
DAKODAKOS2002Caneta repelente de água alternativa pode ser usada
Bisturi descartávelFeather2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
Microscópio fluorecentePinça NikonE600
No. 5Ferramentas de Belas Ciências11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Diluição 1/100
Seringa HamiltonHamilton805N22 gauge, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
IgG Humano, Fragmento FcJackson009-000-008
LamininaThermo Scientific23017-015
Thermo Neurobasal Scientific21103-049
Soro de burro normalJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Penicilina-EstreptomicinaThermo Scientific15070-063Diluição 1/100
Placa de cultura de plástico, 60 mmThermo Scientific150288
Matrizesde siliconeDisponível e comprável do Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Microscópio EstéreoPonta OlympusSZ61
, 1000 uLWatson125-1000S
Fita adesiva transparenteTesa57315Fita adesiva alternativa pode ser usada
Triton X-100SigmaT8787
Azul tripano, 0,4%Bio-Rad145-0013
Tripsina/EDTAThermo Scientific25300-054
MeioNeurobasal suplementado com B27, GlutaMAX e Penicilina-Estreptomicina.
de cultura

Referências

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