Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

Resumo

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Resumo

Os intestinos - que contêm o maior número de células imunes de qualquer órgão do corpo - são constantemente expostos a antígenos estranhos, tanto microbiana e dietética. Dado que uma maior compreensão destes antigénios luminais ajudar a dar forma a resposta imune e que a formação de células imunitárias no intestino é crítica para uma série de doenças sistémicas, tem havido um interesse crescente na caracterização do sistema imune do intestino. No entanto, muitos protocolos publicados são árduos e consumidores de tempo. Apresentamos aqui um protocolo simplificado para o isolamento de linfócitos a partir da própria lâmina do intestino delgado, a camada intraepitelial, e placas de Peyer, que é rápido, reprodutível, e não necessita de gradientes de Percoll laboriosos. Embora o protocolo centra-se no intestino delgado, é também adequado para a análise do cólon. Além disso, destacam-se alguns aspectos que podem precisar de otimização adicional, dependendo do ques científica específicação. Esta abordagem resulta no isolamento de um grande número de linfócitos viáveis ​​que podem, subsequentemente, ser utilizadas para a análise de citometria de fluxo ou meio alternativo de caracterização.

Introdução

A tarefa principal do intestino delgado é muitas vezes considerada a digestão e absorção de nutrientes ^1. Enquanto essa função metabólica é claramente essencial, o intestino delgado tem um papel igualmente importante na defesa do hospedeiro, da barragem contínua de antigénios ambientais encontradas no interior do lúmen ^2. O tracto intestinal separa o mundo exterior (por exemplo., Antigénios luminais) a partir do ambiente interno do hospedeiro com uma camada epitelial que é apenas uma única camada de células de espessura. Como tal, o sistema imune do intestino delgado tem a tarefa formidável de equilibrar o seu limiar de reactividade, permitindo antigénios estranhos provenientes dos micróbios dieta e comensais de introduzir a mucosa com mínima, se alguma, resposta imune, enquanto a montagem de uma resposta robusta contra patogénios invasores e outras "prejudiciais" antígenos. Respostas imunes excessiva ou inadequada para esses antígenos pode levar a doença patológica (por exemplo., Inflammadoença tory intestino, diabetes tipo I, esclerose múltipla) e deve ser evitado ^06/03.

No geral, o tracto gastrointestinal é pensado para representar a maior órgão imune no corpo, contendo mais de 70% de todas as células secretoras de anticorpos ^7. O sistema imunitário do intestino delgado é constituída por 3 compartimentos principais - a lâmina própria (LP), a camada intraepitelial, e placas de Peyer (PP) - que cada um contém um grupo distinto de linfócitos ^2. Os linfócitos LP (LPLs) são principalmente as células TCRαβ ⁺ T com ~ células 20% de B; linfócitos intra-epiteliais (IELs) contêm células B muito poucos com mais células TCRγδ ⁺ T do que as células TCRαβ ⁺ T; e PPS, que são órgãos linfóides secundários embutidos no intestino delgado, parede contêm células ~ 80% de B. Embora cada uma destas regiões anatómicas tem funções ligeiramente distintas e bases ontológicas, elas funcionam em AHmoda armonized para proteger o hospedeiro de insultos patogénicos.

Além disso, há um crescente apreciação que a microbiota é um determinante crítico para o desenvolvimento do sistema imunitário intestinal, com o aumento do reconhecimento cognato da relação entre os micróbios e a ontogenia específicos de determinadas linhagens celulares ^8,9. Além disso, dado que a formação do sistema imune intestinal afeta as respostas imunes em locais anatomicamente distantes (por ex., Artrite, esclerose múltipla, a pneumonia), tornou-se claro que o desenvolvimento do sistema imunitário do intestino é relevante para mais processos de doença do que anteriormente reconhecido ^{10 -12.} Como tal, o interesse em avaliar quantitativamente o sistema imunológico intestinal foi muito além interações patógeno-hospedeiro para incluir agora interações hospedeiro-comensais e patogênese de muitas doenças sistêmicas bem.

Tendo em conta a variabilidade dos métodos actuais naisolamento de linfócitos intestinais, um método que é otimizado para a produção, viabilidade e consistência, equilibrando o tempo necessário é cada vez mais crítica. Os protocolos que envolvem gradientes de Percoll são tempo e trabalho intensivo e potencialmente mais propenso a erro humano, levando a um rendimento variável e viabilidade ^13. Aqui, nós fornecemos um protocolo optimizado para o isolamento e caracterização de linfócitos a partir de todos os compartimentos 3 imunes no intestino delgado. Além disso, dado o interesse crescente em alterações induzidas pelo micróbio no sistema imune das mucosas, que incluem passos que podem ser utilizados para permitir a transmissão horizontal de microrganismos entre ratos para avaliar como estas alterações afectam quantitativamente o sistema imune do intestino.

Protocolo

Todos os estudos foram conduzidos em análise rigorosa e orientações de acordo com a Comissão dos Assuntos Institucionais animal Cuidado e Uso (IACUC) da Harvard Medical School, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela Associação Americana de Ciência Animal Laboratory (AALAS).

1. Horizontal transmissão de bactérias via co-habitação (Opcional)

1. Para minimizar a contaminação exógena (especialmente se estiver usando camundongos gnotobióticos), praticar uma técnica asséptica durante a montagem gaiolas descartáveis ​​estéreis, utilizando alimentos e água que ambos foram autoclavados.
2. Use socos de ouvido ou tags para marcar individualmente 6 semanas de idade C57BL / 6 ratos que abrigam diferentes microbiotas e abrigá-los na mesma gaiola. Dado que os ratos são coprofagia e comer a partir de peletes fecais do chão da gaiola, micróbios irá, naturalmente, ser transmitida horizontalmente entre os ratinhos.
3. camundongos co-casa para ≥1 semana para dar tempo para a transferência de microrganismos e mudança imunológica antes da análise.

2. Preparação de uma suspensão de células isoladas a partir da camada intra-epitelial do intestino delgado e Lâmina Própria

1. Preparação de Soluções
   1. Prepare meios de extracção (por intestino delgado): 30 ml de RPMI + 93% 5 ul de ditiotreitol (DTT) (v / W) + 60 ul de EDTA 0,5 M + 500 uL de soro fetal de bovino (FBS). Adicione o DTT imediatamente antes da utilização.
   2. Prepare a mídia de digestão (por intestino delgado): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg de colagenase II + 300 ml FBS. Adicione o dispase e colagenase imediatamente antes da utilização.
   3. Para todas as incubações realizadas a 37 ° C, soluções Pré-aquecer a 37 ° C.
2. Euthanize o mouse por asfixia com _CO2, seguido por deslocamento cervical.
3. Coloque o lado o rato dorsal para baixo e pulverizar o abdômen com etanol 70%. Use a tesoura para realizar uma laparotomia cortando sequencialmente a pele e fáscia então peritoneal ao longo da linha média ventral from da sínfise púbica até o processo xifóide, expondo a cavidade peritoneal.
4. Utilize uma tesoura para separar o intestino delgado a partir do estômago, ao seccionar o esfíncter pilórico. Remova cuidadosamente o intestino delgado do peritônio, provocando afastado a gordura mesentérica.
   1. Para remover completamente o intestino delgado, fazer um segundo corte na junção íleo-cecal. Colocar o intestino delgado isolado em frio (isto é., 4 ° C) RPMI contendo 10% de FBS para maximizar a viabilidade celular.
5. Gentilmente remover grandes pedaços de gordura usando uma pinça curva. Tenha cuidado para evitar rasgar o próprio tecido intestinal durante a tentativa de remover a gordura.
6. Para remover conteúdo intestinal, intestino delicadamente lave com 15 - 20 ml de PBS frio utilizando uma agulha de alimentação 18 G aposta em uma seringa.
7. Use a tesoura para extirpar PPs, e colocá-los em RPMI frio contendo 5% de FBS. PPs estão localizados no lado antimesentérica do intestino delgado e aparecem como um branco multi-lobuladamassa. Dependendo da estirpe específica, um rato tem tipicamente 8 - 12 PPs.
8. Cortar o intestino delgado em 3 - 4 segmentos polegadas.
9. Remover a gordura residual rolando cada segmento do intestino delgado em uma toalha de papel umedecido com RPMI, utilizando um bisturi maçante para provocar a gordura para fora do tecido.
10. Rodar o tecido de dentro para fora através da canulação os segmentos intestinais com pinças curvas e agarrar a extremidade distai do tecido. Em seguida, usar um par de pinças consecutivas para remover suavemente o segmento de tecido a partir das pinças curvas (com início na extremidade proximal), resultando no tecido a ser invertido.
11. Coloque segmentos de tecido em um copo contendo 30 ml de meio de extracção e uma barra de agitação. Fixar a tampa no copo, e agitar a 500 rpm durante 15 min a 37 ° C; agitação deve ser vigorosa, mas não turbulento.
12. Após a incubação, usar um filtro de aço para separar pedaços de tecido a partir do sobrenadante contendo o epitélio, que deve aparecer turva. Este sobrenadante contém intraepithelial linfócitos que pode ser ainda mais analisados, se desejado, ao proceder à filtração da amostra nos passos 2.18 - 2.23.
13. agitar manualmente as peças de tecidos em meio RPMI para lavar meios de extracção residuais.
14. Coloque o tecido sobre uma toalha de papel seco e lançá-lo sobre a extremidade final várias vezes para facilitar a remoção de muco residuais que não foi libertada por meio de extracção.
15. Coloque fragmentos de tecido em um tubo de 1,5 mL com 600 uL de meio de digestão.
16. Use a tesoura para picar o tecido até peças não ficar com a tesoura e a solução aparece homogênea. Este passo é crítico para assegurar uma digestão enzimática completa do tecido.
17. Adicionar o intestino delgado triturada para um copo contendo 25 ml de meio de digestão. Agita-se a 500 rpm durante 30 min a 37 ° C. No meio da digestão (ie., A 15 min), pipeta cima e para baixo com uma pipeta sorológica para ajudar a quebrar qualquer grandes pedaços de tecido.
18. Filtro de tecido digerido (ou epithcamada Elial a partir do passo 2.12, se IELs processamento) através de um filtro de células 100 mm em um tubo de 50 ml. Lavar o filtro com 20 ml de RPMI contendo 10% de FBS.
19. Centrifugar a solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
20. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de RPMI contendo 10% de FBS.
21. Filtrar células ressuspensas através de um filtro de 40 um da célula em um tubo de 50 ml. Lavar filtro com 20 ml de RPMI contendo 10% de FBS.
22. Centrifugar solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
23. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de RPMI contendo 2% de FBS.

3. Preparação de uma suspensão de células individuais de placas de Peyer

1. Transferência excisadas PPs a um copo com 25 ml de meio de digestão e uma barra de agitação. Seguro tampa, e centrifugação a 500 rpm durante 10 min a 37 ° C.
2. Filtrar PPs digerido através de um filtro de 40 um da célula em um tubo de 50 ml. Se qualquer rema aglomeradosem, pressioná-los através do filtro utilizando a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de 1 ml.
3. Lavar filtro com 10 ml de RPMI contendo 10% de FBS.
4. Centrifugar solução filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de RPMI contendo 2% de FBS.

4. manchas na superfície de Citometria de Fluxo

1. Aliquota volume apropriado de células (por ex., A 200 ul de LPLs) numa placa de fundo redondo de 96 poços.
2. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa.
3. Ressuspender as células em 90 jil de meio RPMI contendo FBS a 2% e uma diluição 1: 100 de anti-CD16 / 32 (bloco Fc). Incubar durante 10 min a 4 ° C.
4. Adicionar 10 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa.
5. Ressuspender as células em 250 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante atravésinvertendo a placa.
6. células Mancha (opcional) com corante de viabilidade, se desejado, seguindo o protocolo do fabricante.
7. Ressuspender as células em 100 ul 1% de formalina para fixar as células. Incubar durante 1 hora no escuro a 4 ° C.
8. Adicionar 200 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa.
9. Ressuspender as células em 250 ul de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante invertendo a placa.
10. Ressuspender as células em 200 ul de PBS. Analise as células utilizando um citómetro de fluxo.

Resultados

Análise citométrica de fluxo de suspensões de células únicas de linfócitos no intestino delgado deve produzir uma população discreta de células que têm características semelhantes dispersão frontal e lateral como esplenócitos (Figuras 1A e 1B). Os linfócitos podem começam a morrer, se o tecido não é mantida a 4 ° C durante as fases iniciais do isolamento, resultando na população de linfócitos com uma dispersão frontal inferior e sendo mais difíceis de separar das outras ...

Discussão

Nós apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de citometria de fluxo de linfócitos pequenos-intestinal, incluindo a LPLs, IELs e linfócitos no PPs. Para aqueles interessados ​​em avaliar como as mudanças na microbiota afetam o sistema imunológico do intestino delgado, detalhamos os passos simples envolvidos na transmissão horizontal de organismos entre os ratos que abrigam diferentes microbiotas. Embora este protocolo centra-se no intestino delgado, o procedimento é o mesmo para a análise do intestino...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Luvas estéreis	Kimberly-Clark	555092
gaiola de rato estéril	Innovive	MS2-AD	contém tampa, fundo da gaiola e cama alfa-dri
Alimentador de metal	Innovive	M-FEED
Garrafa de água	Innovive	M-WB-300
Porta-cartões	Innovive	CRD-HLD-H
Roedor autoclavável chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI médio 1640	Gibco	11875-119
Ditiotreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Ambion	AM9262
Soro Fetal Bovino (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	a concentração no protocolo é baseada em um nível de atividade de 1,878 U/mg
de colagenase, tipo II	Invitrogen	17101-015	a concentração no protocolo é baseada em um nível de atividade de 245 U/mg
Tesoura de dissecação	Roboz	RS-5882
Agulha de alimentação (18 G, 2" de comprimento)	Roboz	FN-7905
Seringa de 10 ml	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Bisturi descartável (15 lâminas)	Miltex	4-415
Pinça curva	Roboz	RS-5211
Pinça reta	Roboz	RS-5132
Copos multiusos, 120 ml	VWR	89009-662
Barra de agitação	VWR	58949-062
Placa de agitação multiposições, 9 posições	VWR	12621-048
Aço inoxidável cônico Escorador, 3 polegadas	RSVP
1,5 ml Tubo	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m Filtro de célula	Falcon	08-771-19
40 μ m Filtro de células	Falcon	08-771-1
Tubo cônico de 50 ml	Falcon	352098
Seringa de 1 ml	BD	309659
Placa de 96 poços, fundo redondo	Corning	3799
Anti-mouse CD16/32 (bloco Fc)	Biolegend	101320
Opcional) Corante de viabilidade fixável eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% de formalina, tamponado neutro	Thermo Scientific	5725