Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Resumo

A metilação é uma das modificações epigenética essenciais para o DNA, o qual é responsável pela regulação precisa dos genes necessários para o desenvolvimento e diferenciação estável de diferentes tipos de tecidos. A desregulação deste processo é frequentemente a característica de diversas doenças como o cancro. Aqui, nós descrevemos uma das técnicas de sequenciação recentes, Metil-Binding sequenciação de ADN de captura (MBDCap-SEQ), usada para quantificar a metilação em vários tecidos normais e de doença para grandes grupos de pacientes. Descreve-se um protocolo detalhado desta abordagem de enriquecimento por afinidade ao longo de uma conduta bioinformática para alcançar quantificação ideal. Esta técnica tem sido utilizada para sequenciar centenas de pacientes em vários tipos de câncer, como parte do projeto methylome 1.000 (Sistema Methylome Câncer).

Introdução

Regulação epigenética de genes por meio de metilação do ADN é um dos mecanismos essenciais necessários para determinar o destino da célula por diferenciação estável de diferentes tipos de tecidos do corpo ^1. A desregulação deste processo tem sido conhecido por causar diversas doenças, incluindo o cancro ^2.

Este processo envolve, principalmente, a adição de grupos metilo no resíduo de citosina nos dinucleótidos CpG de ADN ^3. Existem algumas técnicas diferentes, actualmente utilizados para investigar este mecanismo, tendo cada um as suas próprias vantagens, conforme descrito em muitos estudos ^2-8. Aqui vamos discutir uma destas técnicas c....

Protocolo

Todos os tecidos são obtidos após a aprovação da comissão Institutional Review Board e quando todos os participantes consentiram em ambas as análises moleculares e estudos de acompanhamento. Os protocolos são aprovados pela Comissão de Estudos Humanos da Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio.

1. Captação de ligação ao ADN de metilo (MBDCap)

1. Coleta de amostras e isolamento de ADN
   1. Recolha tumor granel ou amostras de tecidos normais a partir de amostras de tecido embebidos em parafina de pacientes.
   2. Usar um DNA Mini Kit comercial para isolar o ADN genómico a partir das amostras de tecido embebido....

Resultados

Usámos MBDCap-SEQ de estudar as alterações de metilação do DNA em um grande número de pacientes de diversos tipos de cancro incluindo cancro da mama ^{12, 13} do endométrio, próstata ^14, e cancros do fígado, entre outros. Aqui demonstramos algumas informações a partir do estudo do cancro da mama publicou recentemente ^12. Neste exemplo, utilizou-se toda a abordagem de sequenciação do genoma para identificar ilhas CpG que são diferencialmente metilados no tumor em relação à perpendicular entre diferent.......

Discussão

A técnica MBDCap-seq é uma abordagem de enriquecimento de afinidade ^3, considerada como uma alternativa de custo eficaz quando se investiga coortes com um grande número de pacientes ^15. O gasoduto apresentado aqui descreve uma abordagem abrangente, desde a colheita de amostra para análise de dados e interpretação. Um dos passos mais importantes é a criação de um procedimento de amplificação por PCR para melhorar a eficiência da PCR das regiões GC enriquecido no genoma como este é onde ocorre a metilação do DNA. Além di.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de enriquecimento de DNA Methylminer	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Dispositivo de Sonicação	diagenode	B01020001
acetato de sódio 3 M, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
Sistema de Biblioteca de Fragmentos SPRIworks I	Beckman Coulter	A50100	Sistema de construção de biblioteca totalmente automatizado
Adaptador Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Sistema de quantificação fluorométrica
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sistema de Sequenciamento	Illumina