A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

Resumo

Apresentamos uma abordagem para visualizar grandes moléculas de DNA coradas com peptídeo de ligação ao DNA de proteína fluorescente (FP-DBP) amarradas na superfície de polietilenoglicol (PEG) e vidro revestido de avidina e esticadas com fluxos de cisalhamento microfluídicos.

Resumo

Grandes moléculas de DNA amarradas na superfície do vidro funcionalizado têm sido utilizadas na física e bioquímica de polímeros, particularmente para investigar interações entre o DNA e suas proteínas de ligação. Aqui, relatamos um método que usa microscopia fluorescente para visualizar grandes moléculas de DNA amarradas na superfície. Primeiro, as lamínulas de vidro são biotiniladas e passivadas por revestimento com polietilenoglicol biotinilado, que se liga especificamente ao DNA biotinilado por meio de ligantes de proteínas avidinas e reduz significativamente a ligação indesejável de interações não específicas de proteínas ou moléculas de DNA na superfície. Em segundo lugar, as moléculas de DNA são biotiniladas por dois métodos diferentes, dependendo de seus terminais. O DNA de extremidade romba é marcado com dUTP biotinilado em seu terminal hidroxila 3 ', por transferase terminal, enquanto o DNA de extremidade pegajosa é hibridizado com oligonucleotídeos complementares biotinilados por DNA ligase. Finalmente, um fluxo de cisalhamento microfluídico faz com que moléculas de DNA individuais se estendam até seus comprimentos de contorno completos após serem coradas com peptídeo de ligação à proteína fluorescente ao DNA (FP-DBP).

Introdução

Visualização de moléculas de DNA grandes amarrados em superfícies de vidro ou talão tem sido utilizado para investigar as interações DNA-proteína, dinâmica de proteínas em substrato de ADN, ^1,2 e física de polímeros. ^3,4 Uma plataforma de moléculas de DNA grandes single-tethered tem um pouco distinta vantagens em comparação com outros métodos de imobilização de DNA. ⁵ primeiro, uma grande molécula de ADN amarrado na superfície tem uma conformação em espiral aleatória natural sem um fluxo de cisalhamento, o que é criticamente importante para uma proteína de ligação de ADN de reconhecer o seu local de ligação. Em segundo lugar, é muito fácil de alterar o ambiente químico em torno de moléculas de DNA para uma série de reacções enzimáticas em uma câmara de fluxo. Em terceiro lugar, um fluxo de cisalhamento de microfluidos induz ADN molecular do alongamento até 100% do comprimento do contorno completo, o que é muito difícil de conseguir utilizando o alongamento do ADN as abordagens alternativas, tais como a superfície de imobilização ⁶ e confinamento nanochannel. ⁷ Um totalmente stretchemolécula de DNA d também fornece informação de posição que pode ser útil para monitorizar os movimentos enzimáticas no mapa genómico.

No entanto, a abordagem DNA tethering tem uma lacuna crítica em que a tintura a intercalação, tal como YOYO-1 geralmente provoca moléculas de DNA amarrados para ser facilmente quebrado pela luz de excitação de fluorescência. De um modo geral, moléculas de DNA grandes têm de ser marcadas com um corante fluorescente para a visualização sob um microscópio fluorescente. Para este efeito, YOYO-1 ou outros corantes da série TOTO são usadas principalmente porque estes corantes fluoresce apenas quando intercalar de ADN de cadeia dupla. ⁸ No entanto, é bem conhecido que a bis-intercalantes corante faz com que o ADN induzida pela luz foto-clivagem porque da intercalação de fluoróforos. ⁹ Além disso, as moléculas de ADN fluorescentes coradas amarrados na superfície são mais frágeis uma vez que os fluxos de cisalhamento pode exercer forças de quebra no movendo-se livremente moléculas de ADN. Por isso, desenvolvemos FP-DBP como um romance Dcorante proteína NA-coloração para imagiologia de grandes moléculas de ADN na superfície amarrados. A vantagem da utilização de FP-PAD é que ela não provoca foto-clivagem das moléculas de ADN ao qual se liga. ¹⁰ Além disso, FP-PAD não aumenta o comprimento do contorno do DNA, enquanto que corantes bis-intercalantes aumentar o comprimento do contorno por cerca de 33%.

Este método de vídeo introduz a abordagem experimental para prender moléculas de DNA grandes a uma superfície PEG-biotina. A Figura 1 ilustra as diferentes abordagens de amarrar DNA com extremidades sem corte e extremidades pegajosas. Assim, este método de coloração pode ser aplicado a qualquer tipo de molécula de ADN. A figura 2 mostra uma representação esquemática da montagem de câmara de fluxo que pode ser controlada por uma bomba de seringa para gerar fluxos de cisalhamento para esticar moléculas de ADN, bem como a carga química e enzima soluções. a Figura 3 demonstra micrografias das moléculas de ADN esticadas inteiramente amarrados no PEGylatsuperfície ed ¹¹ e corados com FP-PAD.

Protocolo

1. DNA Biotinila�o

1. A biotinilação de DNA de extremos cerses usando transferase terminal (TdT)
   Nota: O uso de T4 DNA (166 kpb), que é um DNA de extremos cerses.
   1. Adicionar 5 uL de 2,5 mM de _CoCl2, 5 ul de 10 × tampão de reacção, 0,5 ul de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 ul de transferase terminal (10 unidades) e 0,5 ul de ADN de T4 (0,5 ug / uL) à mistura de reacção. Adicione a um volume final de 50 ul pela adição de 38,5 ul de água.
   2. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 1 h.
      Nota: o tempo de reacção prolongado pode produzir ADN de dupla presa, ou seja, é possível que biotinas são marcados em ambas as extremidades.
   3. Parar a reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M, pH 8.
   4. Manter o tubo a 4 ° C.
2. A biotinilação de ADN ended pegajoso utilizando ADN ligase
   Nota: O uso λ ADN (48,5 kpb), que é um ADN pegajosa-fim.
   1. Adicionar 1 ul de DNA-ligase de T4, 5 uL de tampão de ligação 10 ×, 1 ul de 25 ng / ul de ADN de fago λ, e adicionar 43 ul de água para fazer um volume final de 50 ul.
   2. Manter o tubo a 4 ° C.

2. funcionalizados A derivação de superfície

Nota:. A fim de amarrar uma extremidade de uma molécula de ADN na superfície de vidro, um grupo de amina primária é silanizada sobre uma lamela, seguido por revestimento por biotina-PEG como se mostra na Figura 1 Este processo de PEGilação é importante para a imagiologia de DNA única molécula porque pode diminuir significativamente o ruído aleatório criado por ligação de moléculas indesejáveis ​​sobre a superfície.

1. Limpeza Piranha
   Nota: As soluções Piranha reagir violentamente com materiais orgânicos, pelo que deve ser manuseado com cuidado, seguindo as orientações de segurança adequadas.
   1. Lugar lamelas em um rack de politetrafluoretileno (PTFE), e mantê-los by PTFE veda-rosca longitudinalmente, metade na borda das superfícies e metade na prateleira. Após acondicionamento, deixar uma parte longa (~ 5 cm) de fita adesiva para lidar com a grade durante o procedimento de limpeza.
   2. Encher um copo de vidro de 1 L com 350 ml de H ₂ SO ₄ e 150 ml de H ₂ O ₂ para fazer a solução piranha numa hotte. Coloque o rack em solução piranha, durante 2 horas.
   3. solução vazia piranha da taça, e lamelas enxaguar abundantemente com água deionizada até que o pH da água no copo atinge neutro. Utilizar as tiras de papel de pH.
   4. Sonicar os suportes de lamelas na água proveta contendo, durante 30 min. água vazia do copo imediatamente antes amino silanização. Use 75 W de potência sonicação de limpar e derivar os substratos de vidro.
2. Aminosilanization na superfície de vidro
   1. Adicionar 2 ml de N - [3- (trimetoxissilil) propil] etilenodiamina e 10 ml de ácido acético glacial em 200 mlde álcool metílico em um recipiente de polipropileno limpo para preparar a solução aminosilanization.
   2. Coloque lamelas limpas no recipiente de polipropileno. Agite-los a 100 rpm e a temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Sonicar a proveta com lamelas derivatizadas durante 15 minutos a 75 W. agitá-los a 100 rpm e à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min.
   4. Esvaziar a solução a partir do recipiente, e enxaguar lamelas cuidadosamente, uma vez com álcool metílico, e duas vezes com álcool etílico. lamelas de loja em álcool etílico e usá-los dentro de duas semanas.
3. PEGilação da lamela
   1. Adicione 10 ml de bicarbonato de sódio 0,1 M _(NaHCO3). Filtra-se a solução com um filtro de seringa de 0,22? M.
   2. Dissolve-se 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidil (biotina-PEG-SC) e 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) em 350 ul de _NaHCO3. Use um tubo de proteção contra a luz.
   3. Vortex do tubo vigorosamente durante 10 segundo, e centrifuga-se que a 10.000 × g durante 1 min para remover bolhas.
   4. Lavar uma lâmina de vidro com acetona, seguido por lavagem com álcool etílico. Permitir o slide secar ao ar completamente.
   5. Colocar uma gota (50 uL) de solução de PEG sobre a lâmina de vidro limpa. Cubra a gota suavemente com um amino silanizada lamela, sem gerar bolhas.
   6. Colocar as lâminas para 3 horas durante a noite em um escuro, bem nivelado câmara húmida à temperatura ambiente. Use um suporte de ponta de pipeta vazia como a câmara, com água na parte inferior. Selar solução de PEG residual no tubo e mantê-lo a 4 ° C.
   7. Lavar as lamelas PEGylated cuidadosamente com água deionizada. Armazená-lo em um lugar escuro e seco até o uso.

3. Montagem de uma câmara de fluxo

1. Fabricar um suporte de acrílico perfurados, como na Figura 2. Assegure-se que o diâmetro do tubo de inserção é 0,762 milímetros, e designa um orifício de entrada é um e o outro éuma saída (Figura 2).
2. Coloque tiras adesivas de dupla face de fita (largura 5-6 mm) sobre um suporte acrílico (Figura 2), alinhando perpendicularmente a um orifício de entrada e de saída, não perturbando quaisquer furos de canal. Use estas tiras de fita como paredes multi-canal para fazer câmaras. Esfregue a fita usando uma ponta de pipeta.
3. Coloque uma lamela PEGylated na parte superior para fazer câmaras de fluxo, com o lado da PEGylated bruços.
4. Para evitar qualquer solução de vazamento, pressione o topo de uma lamela sobre a área onde fitas de dupla face são colocados. Adicionar cola epoxi de secagem rápida, para fechar as extremidades da câmara na parte superior e na parte inferior (cor amarela na Figura 2).
5. Conectar uma peça curta (2,5 cm) de tubo (diâmetro externo, OD, 0,042 ") para uma seringa estanque de gás e vedar a junta com cola epóxi.
6. Conecte um longo tubo flexível (OD: 0,03 ") para a tubulação ligada à seringa e selar a junção com cola epóxi.
7. Encha o tubing ligada à seringa com água DI. Certifique-se de que não há bolha de ar.
8. Insira a tubulação no orifício da câmara de fluxo selada com cola epóxi.
9. Coloque uma ponta amarela (200 ul ponta) do outro furo como um reservatório.

4. Amostra Carregando no fluxo Câmara

Nota: neutravidina pode ser substituído por outras proteínas avidina, tais como estreptavidina. Todas as reacções podem ser realizadas à temperatura ambiente, a menos que seja mencionado. Tome solução da amostra em uma ponta amarela, e instalar a ponta com a solução para o buraco do suporte de acrílico (Figura 2b).

1. Definir a taxa de fluxo da bomba de seringa a 50 ul / min. Carga 20 ul de proteína de avidina (25 ug / ml em solução T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e mantê-lo durante 10 min.
2. Carga 20 l de oligodesoxinucle�idos biotinilados (100 mm em 1 × TE), e mantê-lo por 10 min. Se transferase terminal é utilizado, pule o carregamentode oligodesoxinucle�idos.
3. Carga de 20 uL de solução de ADN a partir do Passo 1 para a câmara de fluxo a uma taxa de fluxo de 10 uL / ​​min, e mantê-lo durante 30 min.
4. Lava-se a câmara de fluxo com 1 x TE, e carregar 40 ul de FP-DBP ^{de 10} (~ 80 nM).
5. Observar ADN sob um microscópio de fluorescência com o fluxo contínuo de moléculas de coloração em 1 × TE numa lente objectiva 60X. Use 488 nm laser em estado sólido para excitação do FP (eGFP) -DBP. Para a completa extensão de moléculas de DNA, aplicar diferentes taxas de fluxo de acordo com os comprimentos de DNA usadas. Por exemplo, aplicam-se 50? L / min durante 48,5 kpb de ADN λ, e 100 ul / min durante 166 kpb de ADN de T4.
   1. Para reciclagem do titular do acrílico, mergulhe câmaras de fluxo montados em uma solução de detergente doméstico ^12. Retirar fitas ou epóxi com uma lâmina de barbear e esfregar com as mãos para levá-los completamente desligado. Desobstruir furos com agulhas de seringa. Mantenha os titulares em água deionizada até à sua utilização.

Resultados

A Figura 1 mostra dois métodos de ADN de ancoragem diferentes dependendo das estruturas terminais da molécula de DNA. A Figura 1a ilustra a forma como as moléculas de ADN casquilhos pegajosos são hibridados com os oligonucleótidos biotinilados complementares, que são imobilizadas na superfície de PEG a revestida com avidina. A Figura 1B mostra a adição de biotinilado ou ddNTP de dNTP para o grupo hidroxilo 3 'de um ADN de extremos cerses...

Discussão

Aqui nós apresentamos uma plataforma para visualização de moléculas de DNA longos biotinilados para a ancoragem em superfícies. Nós relatamos uma abordagem para moléculas de DNA amarrados em uma superfície revestida de proteína avidina com albumina sérica bovina biotinilado. ⁶ Na abordagem anterior, verificou-se uma questão crucial de DNA photo-clivagem causada por corantes bis-intercalação que mancham moléculas de DNA amarrados na superfície. Como estes fluoróforos continuamente animado têm uma elevada proba...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Biotinilação de DNA
1.1) Biotinilação de DNA de extremidade romba usando Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Fornecido com tampão de reação 10x, cloreto de cobalto 2.5 mM
Biotina-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotina-ddNTP também está disponível
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinilação de DNA de extremidade pegajosa Usando DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Fornecido com tampão de reação 10x
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Também disponível em New England Biolabs
2. Derivatização de superfície funcionalizada
2.1) Limpeza de piranha
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm x 22 mm,
		teflon	Fabricação personalizada
Fita de vedação de rosca PTFE	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ fita
de ácido sulfúrico	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4,
peróxido de hidrogênio	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% na água
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Limpador ultrassônico de mesa
2.2) Aminosilanização na superfície do vidroN-[3-(Trimetoxissilil)propil] etilenodiamina Sigma-Aldrich 104884 Ácido acético glacial Duksan Chemicals 414 99% de pureza do álcool metílico Jin Chemical Co., Ltd.
		M300318	99,9%
	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co., Ltd.	A300202	99,9% de pureza
2.3) PEGilação da lamínula
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
	Sartorius	16534----------K
Biotina-PEG-SC	Laysan Bio	Biotina-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetona	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	pureza de 99%
	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1  mm
3. Montagem de uma Câmara de Fluxo
Suporte Acrílico			Fabricação
Personalizada Fita Dupla Face	3M		Tipo transparente
Epoxy de secagem rápida Tubulação	3M
	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
À prova de gás 250 µ l Seringa	Hamilton	81165
Bomba de Seringa	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Carregamento de Amostras na Câmara de Fluxo
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Base Tris Microscópio	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Base Trizma
	Câmera Olympus	IX70
EMCCD	Q Imaging	Laser de estado sólido Rolera EM-C2
(488  nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.