Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão Drosophila Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos In Vivo

Resumo

Os microeletrodos afiados permitem a caracterização eletrofisiológica precisa da saída de fotorreceptores e interneurônios visuais em Drosophila viva. Aqui, mostramos como usar esse método para registrar respostas de voltagem de alta qualidade de células individuais à estimulação de luz controlada. Este método é ideal para estudar o processamento de informações neurais em olhos compostos de insetos.

Resumo

As respostas de voltagem de fotorreceptores de insetos e interneurônios visuais podem ser registradas com precisão com microeletrodos pontiagudos convencionais. O método descrito aqui permite ao investigador medir respostas intracelulares de alta qualidade de longa duração (de minutos a horas) de fotorreceptores R1-R6 de Drosophila e grandes células monopolares (LMCs) a estímulos luminosos. Como o sistema de gravação tem baixo ruído, ele pode ser usado para estudar a variabilidade entre células individuais no olho da mosca e como suas saídas refletem as propriedades físicas do ambiente visual. Descrevemos todas as etapas principais na execução dessa técnica. As etapas básicas na construção de uma configuração eletrofisiológica apropriada para registro, como projeto e seleção do equipamento experimental, são descritas. Também explicamos como se preparar para a gravação fazendo a gravação apropriada (nítida) e os eletrodos de referência (rombos). São fornecidos detalhes sobre como consertar uma mosca intacta em um porta-moscas sob medida, preparar uma pequena janela em seu olho e inserir um eletrodo de gravação através deste orifício com danos mínimos. Explicamos como localizar o centro do campo receptivo de uma célula, adaptar a célula estudada ao escuro ou à luz e registrar suas respostas de voltagem a estímulos dinâmicos de luz. Finalmente, descrevemos os critérios para gravações normais estáveis, mostramos as respostas de voltagem características de alta qualidade de células individuais a diferentes estímulos luminosos e definimos brevemente como quantificar seu desempenho de sinalização. Muitos aspectos do método são tecnicamente desafiadores e exigem prática e paciência para dominar. Mas, uma vez aprendido e otimizado para os objetivos experimentais do investigador, ele fornece dados neurofisiológicos in vivo excelentes.

Introdução

A mosca da fruta (Drosophila melanogaster) olho composto é um grande sistema modelo para investigar a organização funcional dos fotorreceptores e interneurônio matrizes para a amostragem de imagem neural e processamento, e para a visão animal. O sistema tem o esquema de ligações mais completa ^1,2 e é amável a manipulações genéticas e monitoramento da atividade neural preciso (de alta relação sinal-ruído e hora resolução) ^3-10.

O olho Drosophila é modular, contendo ~ 750 estruturas cobertas de lente aparentemente regulares chamados ommatidia, que juntos fornecem a um campo visual panorâmico que cobre quase todas as direções ao redor de sua cabeça voar. Informação primária do olho amostragem unidades são seus fotorreceptores rabdoméricos ^7,8,11. Cada omatídeo contém oito células fotorreceptoras (R1-R8), que compartilham a mesma lente faceta, mas estão alinhados com sete direções diferentes. Embora os fotorreceptores exteriores R1-R6 ARe mais sensível à luz azul-verde, sensibilidades espectrais das células internas R7 e R8, que se encontram em cima uns dos outros e apontam para a mesma direcção, apresentam três subtipos distintos: pálido, amarelo e a área de rebordo dorsal (DRA) ^{12- 15.}

Figura 1. Organização Funcional do Olho Drosophila. (A) Os dois primeiros gânglios óptico, retina e lâmina, são destacadas em cinza no interior do olho da mosca. Fotorreceptores da retina R1-R6 e lâmina grandes células monopolar (LMCs: L1-L3) são facilmente acessíveis in vivo para gravações microeletrodos afiada convencionais. O eletrodo esquemática destaca o caminho normal para gravar a partir de R1-R6 na retina. Um caminho para gravar a partir de LMCs na lâmina é deslocar paralelamente o eletrodo para a esquerda. (B) lâmina é uma matriz de órgão retinotopicallyized cartuchos, cada um dos quais é embalado com neurónios que processa informação a partir de uma pequena área específica no espaço visual. Devido à superposição neural, seis fotorreceptores de diferentes ommatidia vizinhos enviam seus axónios (R1-R6) para o mesmo cartucho de lâmina, formando sinapses de saída histamin�gicos para L1-L3 e uma célula amacrine (Am). (C) A difusão de informação entre os terminais de axónios neuronais R1-R6 e os interneurónios visuais (incluindo L4, L5, Lawf, C2, C3 e T1), no interior de um cartucho de lâmina é complexa. (D) R1-R6 axônios fotorreceptoras receber feedbacks sinápticos de células monopolares L2 e L4. (B) e (C) modificado a partir de Rivera-alba et al ^2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O olho Drosophila é do tipo neural superposição ^16. Isto significa tchapéu de sinais neurais de oito fotorreceptores pertencentes a sete ommatidia vizinha, que olham para o mesmo ponto no espaço, são agrupados em um cartucho de neural nos próximos dois neuropils: a lâmina e medula. Enquanto os seis fotorreceptores exteriores projecto R1-R6 seus terminais de axónios para colunas neurais na lâmina (Figura 1), as células R7 e R8 ignorar essa camada e fazer contactos sinápticos com a sua coluna correspondente medula ^17-19. Estas fiações exactas produzir o substrato neural para o mapeamento de mosca retinotópica visão inicial, após o que cada lâmina (Figuras 1A-C) e medula coluna (cartucho) representa um único ponto no espaço.

Entradas directas de fotorreceptores R1-R6 são recebidos pelos grandes células monopolar (LMCs: L1, L2 e L3) ea célula amácrina (AM) na lâmina ^1,2,20. Destes, L1 e L2 são as maiores células, mediadores principais vias de informação (Figura 1D), WHIch respondem a on e bordas Off-movimento, e, assim, formar a base computacional do detector de movimento ^21,22. Experimentos comportamentais sugere que pelo contraste intermediária, as duas vias facilitar a percepção do movimento de sentidos opostos: back-to-frente em L1 e para frente e para trás em células L2 ^23,24. Conectividade implica ainda que os neurônios L4 pode desempenhar papel fundamental na comunicação lateral entre cartuchos vizinhos ^25,26. sinapses recíprocas foram encontradas entre as células L2 e L4 localizados na mesma e dois cartuchos adjacentes. Jusante, cada célula L2 e seus três células L4 associados projetam seus axônios para um objectivo comum, o neurônio Tm2 na medula, onde se acredita entradas de cartuchos vizinhos para ser integrado para o processamento do movimento ^{27 de} front-to-back. Embora os neurônios L1 receber entrada a partir do mesmo cartucho L2s via ambas as junções comunicantes e sinapses, eles não estão diretamente ligados à cartuchos de lâmina L4s e, portanto adjacentes.

1,2 L1 (Figura 1D). Enquanto as conexões do mesmo cartucho são seletivamente de L2 a R1 e R2 e de L4 a R5, todos os fotorreceptores R1-R6 receber feedback sináptica de L4 de um ou de ambos os cartuchos vizinhos. Além disso, existem fortes ligações sinápticas de AM para R1, R2, R4 e R5, e células gliais, também estão sinapticamente ligado à rede e pode, assim, participar na neural de processamento de imagem ^6. Finalmente, axonais-gap junctions, ligando vizinha R1-R6 e entre R6 e R7 / R8 fotorreceptores na lâmina, contribuir para a representação da informação assimétrica e o processamento em cada cartucho ^14,20,28.

Gravações de tensão intracelulares de fotorreceptores individuais e interneurônios visuais em Drosophila quase intacto fornecer alta r sinal-ruídodados ATIO com resolução sub-milissegundo ^3,5,7-10,29, que é necessário para dar sentido às computações neurais rápidas entre os neurônios conectados. Este nível de precisão é impossível por técnicas de imagem ópticos atuais, que são significativamente mais ruidoso e tipicamente operam em 10-100 resolução ms. Além disso, porque os eletrodos têm muito pequenas e afiadas pontas, o método não é restrito aos corpos celulares, mas pode fornecer gravações diretas de estruturas neurais ativas pequenas; tais como árvores dendríticas os LMCs 'ou axônios fotorreceptoras, que não podem ser acessados ​​por muito maiores pontas dos eletrodos de patch-clamp. É importante ressaltar que o método também é estruturalmente menos invasivo e prejudicial do que a maioria das aplicações de patch-clamp, e assim afectam menos intracelular meio e informações de amostragem das células estudadas. Assim, as técnicas de microeletrodos afiada convencionais têm contribuído, e continuar a contribuir, descobertas fundamentais e uma visão original em infor neuralprocessamento de infor- na escala de tempo apropriado; melhorar o nosso entendimento mecanicista de visão ^3-10.

Este artigo explica como em gravações intracelulares vivo a partir de Drosophila fotorreceptores e LMCs R1-R6 são realizados no laboratório Juusola. Este protocolo irá descrever como construir uma plataforma de eletrofisiologia adequada, preparar a mosca, e realizar as gravações. Alguns dados representativo é apresentado, e alguns problemas comuns e as possíveis soluções são discutidas que podem ser encontrados quando utilizando este método.

Protocolo

O protocolo a seguir está em conformidade com todas as orientações de cuidados de animais da Universidade de Sheffield e Universidade Normal de Pequim.

1. Reagentes e Equipamentos para Preparação

1. Gravação e Configuração Luz Estimulação Equipment
   1. Escolha pelo menos uma área de gravação 2,5 x 2,5 m para a realização de experimentos eletrofisiológicos em um quarto que tem ar condicionado com umidade regulamentado e meios para proporcionar condições de gravação escuros. Certifique-se de que esta área é grande o suficiente para caber confortavelmente a: (i) 1 x 1 m mesa de vibração-isolamento que abriga o equipamento [voar estímulo e aparelhos de gravação], lupa e uma fonte de luz fria com dois pescoços de ganso, todos fechados dentro de um grandes> 180 cm de altura gaiola de Faraday; (Ii) um equipamento de rack de 38U para a habitação de um computador pessoal com um monitor LCD de tela plana, amplificador de microeletrodos, drivers de LED, filtros, unidades de controle de temperatura, osciloscópios e outros instrumentos elétricos necessários; e (iii) umpequena mesa e uma cadeira para o investigador.
   2. Coloque o equipamento longe de fontes de ruído elétricos e mecânicos, tais como refrigeradores, centrífugas e elevadores. Use protetores contra surtos separados para proteger os dispositivos elétricos da plataforma de picos de tensão que ocorrem na rede eléctrica. Idealmente, conectar o equipamento à sua própria fonte de alimentação ininterrupta (UPS bateria) para minimizar o ruído.
   3. Construir um fly-titular cónica de bronze e plástico preto (Figura 2). Faça um furo pequeno afunilamento através da unidade de bronze com o seu estreitamento aro externo para ~ 0,8 mm de diâmetro (igual a largura do tórax de uma mosca típico).
      Nota: Este buraco deve afunilar em direção à ponta do fly-titular da forma que uma maior que a média Drosophila, que é projetada a partir de baixo pelo fluxo de ar, iria ficar na altura dos ombros preso na borda superior.
   4. Projetar e construir um estímulo e aparelhos de gravação mecanicamente robusto e preciso, voar (Figura 3). Construir fora of alumínio ou latão (metais de alta condutividade) uma mosca plataforma preparação pólo e em torno dele um sistema de cardan de braço, com rolamentos de esferas incorporadas, para fornecer suaves e precisas x, y-posicionamento e de bloqueio da luz de estímulo.
      Nota: Este projeto composto integrado minimiza as vibrações mecânicas, que de outro modo poderia desalojar a ponta do eletrodo de gravação fora da célula estudada. Ele pode ainda incorporar um sistema de controle de temperatura de circuito fechado baseada em Peltier-elemento, permitindo que os investigadores para usar construções genéticas sensíveis à temperatura, como shibire ^TS, para avaliar os cálculos de circuitos sinápticos ^9,30. Anodize aparelho ou pintar de preto para minimizar estímulo dispersão de luz.
      1. Corrigir a estimulação mosca e aparelhos de gravação na placa de ensaio da mesa de anti-vibração; por exemplo, por M6-parafusos, utilizando os seus furos métricas. Use uma placa de ensaio preto ou cobri-lo com tecido preto para minimizar a dispersão de luz durante as experiências.
      2. Position e bloqueio (usando um parafuso de bloqueio) uma preparação mosca pólo plataforma ajustável verticalmente no centro de um sistema de Cardan-braço. Coloque o fly-preparação (dentro de fly-titular, consulte o passo 2) no pólo plataforma de modo que a fonte de luz ligado ao Cardan-braço radialmente aponta para a cabeça da mosca. Certifique-se de que o centro dos olhos mosca é exactamente no ponto de intersecção (0, 0) da X- do Cardan-braço e eixos y, como este permite que X precisos, Y-posicionamento do estímulo de luz para qualquer ponto dentro da mosca da campo visual.
         Nota: Esta funcionalidade é necessária para mapear as propriedades de resposta das células individuais para locais oculares específicos; por exemplo, ao procurar por evidência eletrofisiológica para adaptações estruturais, tais como zonas claras ou aguda, que mostram aumento da sensibilidade ou a resolução, respectivamente ^31.
   5. Montar o microscópio estereoscópico por trás da estimulação mosca e aparelho de gravação na tabela de anti-vibração de modoque proporciona uma visualização de alta ampliação confortável do olho da mosca.
   6. Montar a fonte de luz fria no topo do microscópio com guias da fonte de luz dupla cabeça semi-rígidas de pescoço de ganso de luz que aponta para baixo para o suporte da preparação mosca. Livremente móvel dois iluminação feixe torna mais fácil visualizar a ponta do eletrodo de gravação quando dirigi-lo através de uma pequena abertura no olho da mosca.
   7. Anexar um apropriado x, y, z definida-micromanipulador (grossa e fina) para o eletrodo de registro ea cabeça-estágio na mesa de anti-vibração, no lado direito do aparelho de estimulação mosca e gravação, usando M6-parafusos ou magnético stands.
      Nota: No laboratório Juusola, diferentes plataformas estão equipados com diferentes manipuladores; para mais detalhes veja a tabela de materiais e reagentes. Todos estes fornecem gravações intracelulares de alta qualidade.
   8. Montar um pequeno manual micromanipulador de 3 eixos para o titular do eletrodo de referência na f ajustável verticalmentely pólo plataforma de preparação. Orientar o eletrodo de referência de modo a que ele está apontando para a preparação mosca.
   9. Construir um blindado leve gaiola de Faraday free-standing de aço-painéis torno da mesa de anti-vibração, em torno do aparelho de estimulação mosca e gravação, para evitar interferências electromagnéticas exteriores. Deixar a frente da gaiola aberta, proporcionando um acesso para transportar a preparação mosca para os experimentos. Anexar cortinas pretas de tecido (com cobre-alumínio ou de malha implantados dentro deles para aterramento) na frente para proteger o ruído e luz. Pintar o interior da gaiola preto para minimizar a dispersão de luz e aparafusar os pés da gaiola no chão para evitar vibrações.
   10. Ligue a tensão e saídas de corrente do circuito de alta impedância amplificador de microeletrodos intracelular para as entradas de dois filtros passa-baixa separados (Bessel ou similares) utilizando BNC cabos. Da mesma forma, conecte as saídas de filtro para os canais apropriados dos blo AD-conectorCKS / tábuas do sistema de aquisição de dados (DA / DA cartões). Conecte o cartão DA / AD (s) em um computador pessoal por cabos especializados, de acordo com os manuais de fornecedores.
   11. Instalar o software de aquisição apropriado para o sistema de aquisição de dados de escolha no computador pessoal. Certifique-se de que os controladores de aquisição de dados são compatíveis com o sistema operacional no computador pessoal.
   12. Chão eletricamente a estimulação mosca e aparelhos de gravação, gaiola de Faraday, malha de cobre (dentro das cortinas), microscópio, micromanipuladores, fonte de luz fria, rack de 38U equipamento com todos os seus instrumentos (o amplificador intracelular, os filtros, a unidade de controle de temperatura, PC e monitor LCD etc.) a um único ponto de terra central por meio de fio de aterramento do equipamento e M6 friso extremidades do anel de aterramento. Use um multímetro elétrica para testar se todas as peças estão no mesmo terreno.
       Nota: Para obter os melhores possíveis condições de gravação de baixo ruído, as configurações de aterramento normalmente variam from um set-up para o outro.
       1. Se necessário, ligue o ponto de terra central ainda ao piso do edifício, e / ou terra central do amplificador de microeletrodos. Depois de testar o sistema em pleno funcionamento durante experimentos eletrofisiológicos reais, estar preparado para alterar a configuração de ligação à terra, conforme necessário para minimizar o ruído nas gravações.
   13. Configurar amplificação software (1 - 10x), filtragem de sinais (tipicamente filtros passa-baixa fixada em 500 Hz, que é adequado tanto para dados R1-R6 e LMC), ea taxa de amostragem (pelo menos 1 KHz). Certifique-se de que as definições de obedecer Nyquist-Shannon amostragem teorema ^32; por exemplo, quando a aquisição de dados que é de baixo pass-filtrada em 500 Hz, utilizar uma frequência de amostragem de 1 kHz ou superior para minimizar os efeitos de aliasing.
       1. Como respostas de tensão característicos de fotorreceptores R1-R6 são 40 - 65 mV, e aqueles de LMC 20 - 45 mV, definir a amplificação e visor, para permitir às escalas de alta resolução sampling e visualização de dados.

Figura 2. cónico Fly-holder A mosca-holder é feito de duas peças:. A unidade de bronze central e seu revestimento de plástico preto cônica. O orifício central no interior da unidade de latão se reduz a um diâmetro pequeno que mal permite que o fly through. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Visão geral do Rig eletrofisiológica. O set-up contém um blindado leve gaiola free-standing Faraday, a tabela de anti-vibração, o aparelho de estimulação mosca e gravação, e cortinas de tecido preto com cobre-alumínio ou de malha para dentro para aterramento. as inscremalheira trument é eletricamente conectada à mesma terra central com todos os equipamentos dentro da gaiola de Faraday. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. fabricação Microeletrodos
   1. Puxe o microeletrodo referência de borosilicato filamentado (diâmetro externo: 1,0 mm; diâmetro interno de 0,6 mm) ou de vidro de quartzo (diâmetro externo: 1,0 mm; diâmetro interno de 0,5, 0,6 ou 0,7 mm) tubulação usando um instrumento pipeta extrator. Tente conseguir uma pequena vela gradual.
      Nota: As configurações exatas do programa pipeta extrator variar de instrumento para instrumento; mais detalhes na Tabela de Materiais e regentes. O tamanho do poro na ponta não é crucial porque a ponta do eléctrodo de referência irá ser quebrado antes de ser inserido na preparação mosca.
   2. Puxe o microeletrodos de gravação a partir de (diâmetro externo de borosilicato filamentado: 1,0 mm; diâmetro interno de 0,6 mm) ou de vidro de quartzo (diâmetro externo: 1,0 mm; diâmetro interno de 0,5, 0,6 ou 0,7 mm) tubulação usando um instrumento pipeta extrator. Tente conseguir um longo (10 - 15 mm) cone bem gradual.
   3. Inspecione com um microscópio de luz que os eletrodos de registro mostram afilamento correta. Monte o eletrodo em uma lâmina de vidro com cola moldável e usar objetivo ar 40X para inspecionar sua ponta.
      Nota: Um bom eletrodo afila suavemente até à sua forma invisível ponta pequena, em torno do qual mais escura paralela contínua e padrões de interferência mais leves podem ser vistos. Algumas configurações do extrator gerar eléctrodos de alta resistência, que não pode produzir penetrações de células bem sucedidos porque suas dicas assemelham "trombetas". Assim, a inspecção visual dos eléctrodos é importante.
   4. Anexar os eletrodos horizontalmente em uma grande placa de Petri com massa de modelar (ou adesivo moldável similar) para a custódia e transporte para o equipamento de eletrofisiologia. Certifique-se de que as pontas dos eléctrodos umestá sempre no ar e não acidentalmente tocar em nada.
   5. Back-encher os eléctrodos de registo e de referência, pouco antes da experiência com a solução de sal apropriado. Use uma pequena seringa de 5 ml conectado a um filtro de partículas pequeno, com uma ponta de plástico fino (como um microloader).
      1. Para experimentos de fotorreceptores, encher o eléctrodo de registo até completo (forma-se uma gotícula na sua extremidade mais larga) com 3 M KCl como esta solução minimiza o efeito do potencial de junção líquida à tensão gravado.
      2. Para investigar os LMCs histaminérgicos, que respondem a entrada sináptica de fotorreceptores R1-R6 por mudanças de cloreto de-condutância, preencha os eletrodos de gravação com 3 M acetato de potássio e KCl 0,5 mM, já que esta solução tem menos efeito sobre a bateria de cloreto da célula. Encha o eléctrodo de referência com a mosca Ringer, contendo em mM: 120 NaCl, 5 KCl, 10 TES (C ₆ H ₁₅ NO ₆ S), 1,5 CaCl _2, 4 _MgCl2, e 30 sacarose
   6. Testar a resistência de um eléctrodo de registo recentemente puxada no sistema de registo.
      1. Certifique-se de que os fios de prata dentro do eléctrodo titulares são uniformemente revestido com cloreto de prata (aparecendo roxo-cinza - não brilhante prateado) para minimizar artefatos de gravação (como a deriva no potencial de junção). Se não, substituí-los com cabos devidamente chloridized.
      2. Se necessário, chloridize novos fios de prata. Limpe cuidadosamente os fios (passando-os rapidamente através de uma chama) para que estes aparecem prata brilhante na cor. Evitar tocar-los com os dedos, de modo a depositar sobre uma camada uniforme de AgCl. Mergulhe os fios em água sanitária força total para 15 - 30 minutos até que eles aparecem de cor roxo-cinza. Alternativamente, galvanizar cada fio (por tornando-positiva com respeito a uma solução contendo 3 M KCl e passagem de uma corrente através dele a uma taxa de 1 mA / ^cm2 de área de superfície) em 10 - 15 segundos até que adequadamente revestidos.
      Conectar-se a gravação cheia de trás e eletrodos de referência aos seus titulares eletrodo. Coloque banho de solução de uma pequena campainha na plataforma preparação mosca pólo verticalmente ajustável. Conduzir as pontas dos eléctrodos para a solução de Ringer e medir resistência de ponta do eletrodo de registro.
      Nota: Esta etapa só é necessária quando testar as propriedades resistivas de eletrodos, que são puxados a partir de um novo lote de tubos de vidro, ou quando otimizar os programas de instrumentos de microeletrodos extrator através de iteração.
   7. Antes de executar as medições de resistência, leia as instruções no manual do usuário do fabricante amplificador para as configurações adequadas de medição. Para um bom eletrodo de registro, têm uma resistência de ponta de ~ 100-220 mohms.

2. Preparação Drosophila

1. Colete 5 - 10 dias moscas idade (após a eclosão) e colocá-los em um tubo limpo mosca contendo stalimentos Andard. É possível conseguir boas gravações da mais jovem voa muito, até mesmo dos "recém-nascidos"; mas por causa dos seus olhos mais suaves, o corte de uma abertura da córnea para o eléctrodo de registo é mais difícil.
2. Construir um tubo de captura da mosca e uma preparação mosca pé (Figura 4). Veja a Figura 4 para a idéia geral de como essas ferramentas self-made foram colocados juntos.
   1. Para fazer um tubo de captura da mosca, cortou a ponta de fundo cónico de 50 ml de tubo de centrífuga de plástico. Em seguida, insira e cole a grande final de 1 ml ponteira sobre esta nova abertura.
   2. Finalmente, cortar a extremidade pequena pipeta para um tamanho que facilmente permite que uma mosca para percorrer. Consulte um oficina mecânica para montar uma pequena mosca fase de preparação que permite a rotação de 2 eixos e travamento da mosca-suporte para diferentes posições a.

Figure 4. Ferramentas e Devises necessários para tornar a preparação Fly. Voe tubo de captura é feita por meio de colagem a 1 ml ponta de plástico da pipeta para a 50 ml tubo de plástico de centrífuga. Encomenda suporte preparação mosca permite livre de rotação e bloqueio da mosca-titular e de uma posição preferida para a preparação da mosca. A mosca é fixado por cera de abelha, usando a cera-aquecedor elétrico. Vaselina é aplicada por um pequeno aplicador feito conectando um fio de cabelo tipo de espessura em uma alça. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Recolha uma mosca para o experimento em um 1 ml ponteira, que mal permite que uma mosca para passar. Anexar a mosca tubo de captura, com a ponta da pipeta sobre ele, ao tubo de mosca. Na captura uma mosca, tirar proveito de sua tendência inerente para subir para cima (antigravitaxis) na ponta da pipeta. De preferência, escolha a maior do sexo feminino, como o tamanho importas em eletrofisiologia.
   Nota: Quanto maior a mosca, quanto maior as suas células e melhor as chances de gravações intracelulares de alta qualidade. moscas menores (machos e fêmeas) podem também proporcionar gravações excelentes, mas a preparação é mais difícil de fazer. Uma vez que a mosca é preso em um grande ponta de pipeta, lembre-se de fechar o tubo mosca para parar outras moscas de escapar.
4. Ligar uma seringa de 100 ml com um tubo de plástico flexível para a maior abertura da ponta da pipeta - com a mosca ainda nele.
5. Coloque a extremidade mais estreita na grande ponta da pipeta, a qual é ampliada para deixar apenas um de Drosophila através de, para a abertura na parte inferior da mosca-titular o e apertar um pequeno volume de ar a partir da seringa para ejectar a voar em mosca-titular o .
   1. Olhe através do microscópio estereoscópico e gentilmente administrar mais ar até que a cabeça da mosca é saliente da extremidade cónica de fly-titular. Certifique-se de que a mosca está firmemente preso a partir do seu tórax para o pequeno opeNing no topo da mosca-da titular.
6. Use um aquecedor de cera para fixar a mosca com cera de abelha de seus "ombros" a mosca-titular. Ajustar a temperatura do aquecedor de cera para ser tão baixa quanto possível de forma limpa ainda derretendo a cera.
   Nota: Quando a temperatura está correta, a cera aparece transparente. Muito alto de uma temperatura faz com que a cera "queimar"; muito baixo mantém a dura cera. Ao fixar a mosca, ser precisa e breve como exposição ao calor prolongado pode danificá-lo. Usando cola dental fotopolimerizável não é recomendado aqui como sua aplicação é muito lento.

Figura 5. Preparação da mosca por experimentos in vivo. À esquerda, uma cabeça de Drosophila está posicionada em linha reta na fly-titular da e fixa a partir de sua tromba, olho direito e ombros para fly-titular ser aquecido aeswax. Direita, A pequena abertura é cortada na parte mais grossa do olho, um pouco acima do equador e apenas uma ommatidia poucos longe da cutícula para trás, usando uma borda de lâmina afiada. Um pedaço de córnea é cuidadosamente removida e o furo é vedado com vaselina para evitar o olho de secando. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Imobilizar a cabeça da mosca. Aplicar cera de abelha para a tromba (Figura 5) e no canto do olho direito, evitando a córnea, e fixar a cabeça de um desses pontos para fly-titular.
8. Produzir um micro-faca. Fixe uma lâmina de barbear não de aço inoxidável com dois suportes de lâmina / disjuntores (ambos com aperto plana) e crack uma pequena faixa de sua borda afiada. Para a saúde e segurança, usar óculos para proteção dos olhos (mesmo que é altamente improvável que as peças seriam ricochete quando a lâmina estiver rachada). Idealmente,produzir uma borda de lâmina afiada que se assemelha a uma torre. Certifique-se de que esta "agulha" está firmemente ligado à porta-lâmina, mas tenha cuidado para evitar qualquer auto-lesão!
9. Usando o micro-faca, preparar um pequeno tamanho da abertura de alguns ommatidia no olho esquerdo da mosca - em cerca de 4-5 ommatidia da cutícula dorsal logo acima do equador do olho para fornecer a passagem para o microeletrodos de gravação. Executar sob um microscópio estereoscópico, vendo a preparação com ampliação elevada.
   Nota: Como o olho da mosca se sente elástico e resistente à sondagem, o buraco é melhor corte com um -knife "torre". A técnica de corte é bastante desafiador, então preste muita atenção para a demonstração em vídeo. Mantendo fly-titular e de determinadas linhas de orientação (no stand preparação fly) pode fazer a dissecção mais fácil. Inicialmente, a microcirurgia pode sentir difícil de aprender, mas uma vez comprometida, a adaptação neural melhora gradualmente 3D-percepção e destreza do investigador.
10. Remove cuidadosamente o pequeno pedaço de córnea a partir da abertura que acabou de ser cortado, expondo a retina por baixo. Rapidamente cobrir o buraco no olho com uma pequena gota de vaselina usando o cabelo fino do aplicador vaselina.
    Nota: Vaselina serve múltiplos papéis aqui. Ele evita a desidratação de tecido e coagulação da hemolinfa que iria quebrar o eletrodo de registro inserido. Reveste também Aliás, o microeletrodos, reduzindo sua capacitância intramural. Isto pode melhorar a resposta de frequência do sistema de gravação, e por isso a resolução temporal dos sinais neurais registadas. Evitar manchas de vaselina sobre o resto do olho, pois isso confunde as ópticas.

3. Gravar a partir de R1-R6 fotorreceptores ou LMCs

1. Sempre ser aterrado ao operar o amplificador de microeletrodos (por exemplo, tocando na superfície metálica da gaiola de Faraday ou mesa anti-vibração), já que esta se opõe a uma acidentalmente entregaring uma carga estática para a cabeça-stage, o que poderia danificar o circuito.
2. Iluminar a plataforma pólo preparação mosca do alto por dois guias de luz pescoço de ganso (Figura 6A) (com a fonte de luz fria dentro da gaiola de Faraday) para que fly-titular da pode ser colocado no pólo na posição preferida sob controle visual de perto .

Figura 6. Posicionamento Fly-detentor e as Eletrodos para os Experimentos (AB) A mosca-caixa será colocada na plataforma de gravação que também fornece controle de temperatura através de um elemento Peltier (A: plataforma redonda branca no centro).. A Cardan-braço permite um posicionamento exacto do estímulo da luz a uma distância igual (através de X, Y-rotação) em torno da mosca, com a fonte de luz (uma extremidade de feixe de fibras ópticas de líquidos ou de quartzo) que aponta directamente para o olho. Em muitos dos UOplataformas de r, a estimulação de luz é gerada por LEDs (com correntes-drivers lineares) ou por um monocromador. Assim, seus estímulos levar um conteúdo específico espectral (passou-band), selecionados entre 300-740 nm e cobrir 4-6 log gama unidade de intensidade (como atenuada por filtros de densidade neutra separadas). (C) Dois microeléctrodos, controlado por micromanipuladores separadas, são posicionadas na cabeça mosca: o eléctrodo de referência (acima) através do ocelos; o eléctrodo de registo (esquerda) através da pequena abertura no olho esquerdo. (D) Para a obtenção de um número máximo de gravações de fotorreceptores, o microeléctrodo de gravação é conduzido para o buraco, paralela ao eixo tromba-ocelo. Quando os penetra ponta do eléctrodo e selos para um fotorreceptor, a fonte de luz é fixada pode rodar livremente para a posição em que a célula produz a resposta máxima tensão a um dado estímulo de luz. Este ponto encontra-se no espaço no centro do campo receptivo da célula. Se o i buracos perto da cutícula, penetrações LMC pode ainda ser alcançada com este mesmo ângulo eléctrodo (esquerda). Se o buraco é mais longe da cutícula, um outro ângulo abordagem eletrodo útil para obter gravações LMC também é mostrado (direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Montar fly-titular da (com a mosca na mesma!) No pólo mosca plataforma de preparação. Gire fly-titular da forma que o olho esquerdo do fly está enfrentando diretamente o investigador (Figura 6B).
4. Insira o eletrodo de referência sem corte suavemente através Occelli da mosca dentro da cápsula cabeça usando uma pequena micromanipulador grossa enquanto observa a preparação através do microscópio estereoscópico (Figura 6C). Não empurre o eletrodo muito profundo, pois isso pode danificar o cérebro da mosca.
   1. Alternativamente, inserir o eléctrodo de referência para a parte de trás do tórax. Sempre, garantir que a mosca parece vegetação rasteira (move suas antenas) e seus olhos estão intactos; não acidentalmente danificado. Se a preparação parece menos do que imaculado, preparar uma nova mosca para os experimentos.
5. Conduzir o microeletrodos de gravação afiada no olho esquerdo através da vaselina coberta pequena abertura preparada anteriormente. Use alta ampliação no microscópio estereoscópico e mover as guias de luz e o plano focal de modo que o local ponta do eletrodo se torna aparente em 3D por seus padrões de reflectância.
   Nota: A Figura 6D mostra como cabeça da mosca deve ser posicionado de forma ligeiramente diferente (em relação ao ângulo do microeletrodos de gravação entra no olho) para fotorreceptores e gravações LMC. Conduzir o eletrodo dentro do olho sem quebrá-lo é a fase mais difícil do experimento. Se a ponta do eletrodo perde a pequena abertura no olho, atingindo a córnea, que normalmente rompe.
6. Ligue o amplificador de microeletrodosuma vez que os dois eléctrodos estão firmemente dentro da preparação, em contacto eléctrico com os fluidos corporais da mosca.
7. Desligue a fonte de luz fria (dentro da gaiola de Faraday) e desligue-o da tomada. Conecte seu plug no chão central para minimizar o rés-do-circuito induzida ruído eléctrico, e mover as guias de luz pescoço de ganso afastado para que o sistema Cardan-braço pode ser movido livremente ao redor da mosca. Desligue as luzes da sala para garantir que a preparação mosca está agora em relativa escuridão.
8. Meça a resistência do eletrodo de registro no olho (conforme indicado no manual do usuário do amplificador). Use eletrodos única gravação em que a resistência é 100-250 mohms.
   Nota: É praticamente impossível conseguir gravações intracelulares de alta qualidade por <70 eletrodo mohms. Se a resistência for <80 mohms, é provável que a extremidade do eléctrodo é quebrado. Neste caso, desligue o amplificador e mudar o eletrodo de registro.
   1. Uma vez que o eléctrodoe é substituído no olho, ligar o amplificador para medir a sua resistência. Por vezes, a ponta do eléctrodo pode tornar-se bloqueado por alguns detritos, uma vez que entra no tecido. Isto pode ser resolvido usando as funções de zumbido capacitivo e pulso de corrente do amplificador que normalmente claro que por ressonância rápida ou repulsão.
9. Definir o amplificador à corrente-clamp (CC) ou modo de gravação ponte. Cancelar qualquer diferença de tensão arbitrária entre os eléctrodos de registo e de referência, como ambos estão agora descansando no espaço extracelular eletricamente interligados, definindo o desvio de sinal (tensão de gravação) para zero. Siga o deslocamento de sinal alterações usando leitura de tela do amplificador ou tela de um osciloscópio.
10. Espere 2-3 min para o olho da mosca para dark-se adaptar.
11. Conduzir a ponta do eletrodo de gravação gradualmente mais profundo no olho com pequenos passos mícron 0,1 a 1. Faça isso com um eixo-x piezo-passo de um micromanipulador ou b por controle remotoy suavemente girando o botão de resolução fina de um manipulador manual.
12. Estimular o olho da mosca com um breve (1-10 ms) flashes de luz como o eletrodo de registro está sendo avançado no tecido.
    Nota: Se o eléctrodo de registo está posicionado na retina e as funções do olho, normalmente, cada um flash de luz irão provocar uma queda breve e pequena na tensão (0,2-5 mV hiperpolarização), chamado o electrorretinograma (ERG). Esta mudança no potencial de campo do espaço extracelular é causada por resposta colectiva as células da retina 'à luz. No entanto, uma vez que a ponta do eletrodo entra a lâmina, fechando nos LMCs, o ERG inverte, mostrando respostas despolarizantes.
13. Mover a fonte de luz em torno do olho da mosca, utilizando o sistema de Cardan-braço e a posição onde a luz provoca a maior resposta do ERG.
    Nota: Esta posição marca a pequena área no espaço visual onde os fotorreceptores (ou LMC), que estão localizados ao lado da ponta do eléctrodo de registo, Provar a sua entrada de luz.
14. Penetrar uma célula com o eléctrodo de registo.
    Nota: A penetração pode ocorrer espontaneamente, ou quando o eletrodo é micro-se adiantou. Pode ser ainda mais facilitada batendo suavemente o sistema micromanipulador ou usando a função zumbido do amplificador; essas ações ressoar a ponta do eletrodo no tecido. Quando o eletrodo espeta a membrana de fotorreceptores, entrando em seu espaço intracelular, a diferença de tensão entre a gravação e eletrodo de referência cai repentinamente de 0 mV para ~ -65 mV (entre -55 e -75 mV); Considerando que, durante as penetrações LMC, essa queda é tipicamente menor (entre -30 e -50 mV). Estas diferenças de tensão representam os potenciais de repouso das células negativas dadas. Dependendo da qualidade do eléctrodo de registo (a sua nitidez) e o processo celular que penetrou, a leitura da voltagem do eléctrodo de registo pode estabilizar rapidamente ou gradualmente para o potencial de repouso, como a membrana celularvedações para a camada exterior do eléctrodo. Mas se a penetração é apenas parcial ou pobres, o eléctrodo normalmente desliza para fora da célula com o potencial escalar gravado volta para zero.
15. Localizar o centro do campo receptivo da célula penetrou quando o eletrodo aparece devidamente selado, mostrando o potencial de membrana estável (potencial de repouso escuro). Mova o estímulo luminoso intermitente em torno do olho da mosca, utilizando o sistema de Cardan-braço, para encontrar o ponto no espaço visual, onde o flash de luz evoca resposta tensão máxima da célula. Bloquear a Cardan-braço quando o estímulo luminoso enfrenta diretamente (pontos em) o centro campo receptivo.
    Nota: Na escuridão, fotorreceptores Drosophila responder aos pulsos de luz brilhantes com 40 - 65 mV respostas despolarizantes tensão ^{de 4,5,} enquanto que gravações LMC estáveis ​​mostrar 20 a 45 respostas hiperpolarizantes mV ^9,10,14. penetrações glia pode acontecer raramente, indicado por <-80 mV potenciais de repouso e muito mais lentoe mais pequeno (~ 5 mV) despolarizações induzidas pela luz saturado. Fotorreceptores Drosophila com diferentes pigmentações oculares, tais como white-eye ⁷ e cinábrio, mostrar tamanhos de resposta ao tipo selvagem.
16. Usando o modo do amplificador de corrente-clamp (CC), compensar a capacitância do eléctrodo de registo através da injeção de pequena 0,1 nA e breve (100 - 200 ms) pulsos de corrente para dentro da célula estudada para minimizar artefatos de gravação durante o carregamento da membrana.
    Nota: Este procedimento importante é explicado em detalhe no manual do utilizador do amplificador, e deve ser praticado com uma célula de modelo eléctrico antes das experiências reais.
17. respostas de tensão registro a pulsos de luz e outros estímulos de interesse, tendo diferentes qualidades estatísticos ou físicos (como naturalista séries temporais de intensidade de luz ou padrões de contraste aleatórios). Teste, por exemplo, como as respostas gravadas mudar com claras ou escuras-adaptação.
    Nota: Pode-se com precisão liluta-se adaptar a célula estudada por luz contínua de intensidade pré-selecionado pela adição de filtros de densidade neutra no caminho da luz ^4,5. Alternativamente, para dark-adaptação prolongado desligar o estímulo luminoso durante um tempo pré-definido. Por causa da estabilidade mecânica do sistema de gravação, a qualidade dos eléctrodos de registo e o intacto da preparação, condições de gravação estáveis ​​por vezes pode durar várias horas. Assim, em um dia bom, é possível a recolha de uma grande quantidade de dados em diferentes condições de adaptação por uma única célula. Quando o eléctrodo desliza para fora da célula, as respostas registadas e diminuir a tensão média começa a aproximar-se de zero.
18. Avançar cuidadosamente o eléctrodo de gravação com a multa de controle do eixo-x do micromanipulador até o eletrodo faz contato e penetra na célula seguinte (este é normalmente o vizinho mais próximo neural). Não mova o eletrodo ao longo do eixo z y ou como estas manobras faria o eletrodo para "plough o tecido "de lado, danificando as estruturas do olho!
    Nota: Com um bom eléctrodo e uma preparação saudável, pode-se registar as respostas de alta qualidade a partir de muitas fotorreceptores (mas raramente a partir de muitas LMC) na mesma mosca ao longo de um período de várias horas; Ocasionalmente, durante todo o dia de trabalho (> 8 horas), sem deterioração sinal claro.
19. Salve arquivos de dados periodicamente com informações de identificação, tais como data, genótipo, e o tipo de célula gravado. Por causa da grande quantidade de dados que podem ser recolhidos em uma sessão de gravação de sucesso, manter bons registros escritos em um laboratório-book para análise de dados futuros.

Resultados

O método de gravação de microeletrodos afiada, tal como adaptado aqui para o olho Drosophila, pode ser usado para quantificar de forma fiável de amostragem neural de informação e processamento nas células da retina e lâmina, e comunicação entre eles ^{4,5,7,8,10,33.} Ao usá-lo para estudar a codificação em diferentes estoques de tipo selvagem, mutantes ou linhagens de moscas geneticamente modificadas, o método tem provado o seu valor; não só para quantificar os efeitos de uma mutação, temperatura, dieta ou de expressão seleccionado ^{3,4,6,9,10,14,30,34,} mas também em revelar razões mecanística para comportamentos visuais alteradas ^14,34. O método também é facilmente aplicável a outras preparações de insetos ^35,36, capacitando estudos visão neuroetológica. Em seguida nós mostrar alguns exemplos de suas aplicações bem sucedidas.

Figura 7. TensãoRespostas de uma mosca da fruta R1-R6 fotorreceptores a um pulso de luz a 20 e 25 ^° C. Uma vez que as penetrações microeléctrodo afiadas são, frequentemente, muito estável, é possível gravar as respostas tensão da mesma fotorreceptores R1-R6 a um dado estímulo a luz diferentes temperaturas ambiente pelo aquecimento ou arrefecimento da mosca. Em nossos set-ups, fly-titular da é colocada em um sistema de controle de temperatura de circuito fechado baseada Peltier-element-. Isso nos permite alterar a temperatura da cabeça da mosca em segundos. Temperatura mais elevada acelera as respostas de tensão e caracteristicamente reduz o potencial de repouso de fotorreceptores R1-R6 (como indicado pelas setas vermelhas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudando o efeito da temperatura na saída de fotorreceptores

o C (Figura 7). Quantificada antes de ^4,9, o aquecimento reduz potencial de repouso de um fotorreceptor na escuridão, e acelera as respostas de tensão.

Figura 8. Desempenho sinalizando uma Fruit Fly R1-R6 fotorreceptores melhora com a intensidade de luz (A) a saída de fotorreceptores para escurecer (abaixo) e brilhantes. (Acima; 10.000 vezes uma luz mais brilhante) repetiu naturalista séries temporais de intensidade de luz registado pela mesma microeletrodosna mesma célula a 20 ^° C. As respostas ao estímulo luminoso são maiores, porque integram mais amostras, respostas elementares (solavancos) para fótons individuais ^4,5,7,8. (B) 20 respostas tensão de um segundo de duração consecutivos são sobrepostos. As respostas individuais (cinza claro) foram tomadas após as tendências adaptativas (seta em A) tinha diminuído (caixa pontilhada em A). Os meios de resposta correspondente (os sinais) são os vestígios mais escuras. A diferença entre o sinal e as respostas individuais é o ruído. (C) As células 'desempenho sinalização foi quantificada pelas gravações de' relações sinal-ruído (SNR) usando os métodos padrão ^4,5,7,8. Saída de fotorreceptores tem cerca de 64 Hz mais ampla gama de sinalização de confiança no estímulo luminoso ( '≥1 _brilhante, até 84 Hz do que no dim (SNR SNR)' _Dim ≥1, até 20 Hz), com signal-to-noise ratio melhorando consideravelmente; de SNR _Dim ^MAX = 87 a SNR _brilhante ^MAX = 1.868. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudar Adaptação e codificação neural por repetitivo Estimulação

O noninvasiveness do método, causando relativamente pouco dano nas estruturas da retina e da lâmina, faz com que seja ideal para estudar o desempenho de sinalização de células individuais a diferentes estímulos luminosos no seu próximo estado fisiológico natural in vivo. A Figura 8 mostra respostas de tensão de um R1- R6 fotorreceptor a um repetido naturalista série estímulo luminoso tempo de intensidade fraca e brilhante a 20 ^° C, enquanto que a Figura 9 o C. As gravações pré e pós-sinápticos foram realizadas separadamente a partir de duas moscas diferentes, porque as gravações intracelulares simultâneos entre dois microeletrodos afiada na mesma mosca, um na retina e o outro na lâmina, são muito difíceis de ser viável ^30.

Figura 9. Respostas tensão de uma mosca de fruto R1-R6 fotorreceptores e LMC à Estimulação naturalista repetida a 25 ^o C. (A) R1-R6 (cinza) e LMC (preto) Saídas gravada por diferentes microeletrodos de diferentes moscas. (B) 20 totalmente pré-luz adaptado consecutivo (acima) e pós-sinápticos (abaixo) as respostas ao mesmo padrão de estímulo naturalista com respostas individuais, mostrado em cinzento claro de umd os correspondentes meios de resposta (os sinais) como os traços mais escuros. A diferença entre o sinal e as respostas individuais é o ruído. (C) As células 'desempenho sinalização foi quantificada pelas gravações de' relações sinal-ruído (SNR). Saída LMC tem cerca de 10 Hz mais ampla gama de sinalização confiável (SNR _'LMC ≥1, até 104 Hz) do que a produção R1-R6 (SNR' _R ≥1, até 94 Hz). Ambos os rácios de sinal-para-ruído são elevados (SNR _LMC ^MAX = 142, SNR _R ^MAX = 752), e como o ruído de gravação era baixa, as suas diferenças refletem diferenças de codificação reais entre as células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Após o início do estímulo, as gravações típicoly mostrar rápida adaptação tendências que em grande parte desaparecem dentro de 5-6 seg. A partir de então, as células produzem respostas altamente consistentes para cada apresentação longa estímulo 1 segundo (cada caixa pontilhada inclui 20 destes). A reprodutibilidade das medidas torna-se óbvio quando estes são sobrepostos (Figura 8B e Figura 9B). As respostas individuais são os traços cinzas finas, e sua significa o traço mais escura mais grosso. A resposta média é tomada como o sinal neuronal, ao passo que o ruído neural é a diferença entre a média e cada resposta individual ^4,5,9,37,38. As respectivas relações sinal-para-ruído no domínio da frequência (Figura 8C e Figura 9C) foram obtidos por Fourier-transformar os fragmentos de dados de sinal e de ruído na espectros de potência, e dividindo-se o espectro de potência do sinal significativo com o correspondente espectro de potência média de ruído ^{4, 5,9,37,38.} Caracteristicamente, as proporções máximas de sinal-para-ruído óf as saídas neurais registados para estimulação naturalista são elevadas (100 - 1000), e nas preparações mais estáveis ​​com muito baixo ruído de gravação pode atingir valores >> 1000 (por exemplo, Figura 8C.). Observe também que o aquecimento expande as células "largura de banda de confiança sinalização ⁴ (SNR _'brilhante ≥ 1); por exemplo, a diferença relativa entre os dois R1-R6s nas Figuras 8 e 9, respectivamente, é de 10 Hz (84 a 20 ^o C e 94 Hz a 25 ^o C).

Pode-se estimar a taxa de mais de cada célula de transferência de informação a partir da sua relação sinal-ruído através da utilização da equação de Shannon ^32, ou através do cálculo da diferença entre as taxas de entropia entropia e de ruído das respostas através do método de extrapolação triplo ^39. Mais detalhes sobre as informações de análises teóricas, e seu uso e limitaçõess especificamente com este método são apresentados nas publicações anteriores ^7,8,39.

Figura 10. Respostas tensão de uma mosca assassina R1-R6 fotorreceptores e LMC à Estimulação naturalista repetida a 19 ^o C. (A) R1-R6 (cinza) e LMC (preto) envia registado pela mesma microeletrodos da mesma mosca; primeira pós-sinapticamente e, posteriormente, pré-sináptico, como eletrodo foi avançado no olho. (B) 20 pré consecutiva (acima) e pós-sinápticos (abaixo) as respostas (traços cinza claro) para o mesmo padrão de estímulo naturalista foram capturados após a adaptação inicial (caixa pontilhada em A). Seus meios são os sinais (os traços mais escuros no topo), enquanto as suas respectivas diferenças para as respostas individuais dão o barulho. (C) O correspondente SignaRácios l-a-ruído (SNR) foram calculados como nas Figuras 8C e 9C. Saída LMC tem cerca de uma faixa de 100 Hz mais amplo de sinalização confiável (SNR _'LMC ^MAX ≥1, até 234 Hz) do que a produção R1-R6 (SNR' _{R ^MAX} ≥1, até 134 Hz). Ambos os rácios de sinal-para-ruído são elevados (SNR _LMC ^MAX = 137, SNR _R ^MAX = 627), e como o mesmo microeletrodos foi utilizado nas gravações, suas diferenças refletem diferenças reais nas saídas pré e pós-sinápticos neurais. Estes resultados implicam que o sistema de gravação tinha baixo nível de ruído, e sua influência sobre as análises foi marginal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudos Visão neuroetológica

O método também pode ser utilizado para registar as respostas pré- e pós-sinápticos de tensão dos olhos compostos de diferentes espécies de insectos ^7,8,35,36 (Figura 10), que permite estudos comparativos neuroetológica de processamento de informações visuais. Para o sistema de gravação apresentada, a única adaptação necessária é de preparação titulares novos, cada um com uma abertura de dimensões adequadas para as espécies estudadas. Estas gravações exemplares são provenientes de um assassino fêmea de mosca (Coenosia attenuata). Eles mostram respostas intracelulares de tensão de um fotorreceptor R1-R6 e LMC à estimulação repetitiva de luz idêntica, tal como se utiliza para os homólogos de Drosophila na Figura 9, mas a 19 ^o C. Neste caso, tanto o pré- e pós-sinápticos, os dados foram registados a partir do mesmo mosca; uma após a outra, com o mesmo eléctrodo de registo (cheia com 3 M KCl) primeiro avançando através da lâmina lateral, antes de entrarção da retina frontal. Em comparação com os dados de Drosophila a 25 ^° C, os dados Coenosia - até à temperatura de refrigerador - mostra as respostas com dinâmica mais rápidos; expandir a gama de sinalização fiável (relação sinal-ruído >> 1) ao longo de uma gama de frequência mais ampla. Essas adaptações funcionais na codificação neural de estímulos naturalistas são consistentes com estilo de vida predatório 's Coenosia ^36, que exigem alta precisão informações espaço-temporal para alcançar rápidos comportamentos caça aérea.

Discussão

Apresentamos as principais etapas básicas de como usar microeletrodos convencionais afiados para registrar as respostas intracelulares dos fotorreceptores R1-R6 e LMCs em olhos de moscas intactos. Este método foi otimizado, juntamente com ferramentas de hardware e software sob medida, nos últimos 18 anos para fornecer gravações de alta qualidade e longa duração para responder a uma ampla gama de questões experimentais. Ao investir tempo e recursos para construir configurações experimentais robustas e precisas e produzir microeletrodos com propriedades elétricas favoráveis, gravações de alta qualidade podem se tornar a norma em qualquer laboratório que trabalhe com neurofisiologia visual de Drosophila . Embora sistemas de gravação e estimulação de luz bem projetados sejam importantes para a execução rápida de diferentes paradigmas experimentais, existem três etapas processuais que são ainda mais críticas para obter gravações bem-sucedidas: (i) fazer a preparação da mosca com o mínimo de danos aos olhos, (ii) puxar microeletrodos com as propriedades elétricas corretas e (iii) conduzir o eletrodo de gravação para o olho sem quebrar sua ponta. Em última análise, para registrar dados significativos, o investigador precisa entender a base física da eletrofisiologia e como fabricar microeletrodos adequados para os tipos de células visadas.

Portanto, as limitações dessa técnica são definidas principalmente pela paciência, experiência e capacidade técnica do investigador. Como essa técnica pode levar muito tempo para ser dominada por pequenas células de Drosophila , é aconselhável que os eletrofisiologistas em treinamento pratiquem primeiro com olhos de insetos maiores, como a mosca varejeira³⁶ ou o gafanhoto³⁵, usando o mesmo equipamento. Uma vez que a realização de registros intracelulares de alta qualidade dos fotorreceptores e interneurônios maiores se torne rotina, é hora de passar para o olho da Drosophila . Outra limitação da técnica diz respeito à identificação celular. As células penetradas de Drosophila podem ser carregadas eletroforeticamente com corantes, incluindo amarelo de Lúcifer ou neurobiotina. No entanto, devido ao pequeno tamanho da ponta dos microeletrodos, a eletroforese funciona com menos eficiência do que com eletrodos de menor resistência, como eletrodos de remendo. Além disso, os microeletrodos preenchidos com corante caracteristicamente têm propriedades elétricas menos favoráveis, tornando muito mais difícil registrar respostas de alta qualidade com eles de fotorreceptores de Drosophila e LMCs.

Um problema técnico que ocorre às vezes é o sinal de entrada instável ou a completa falta dele. Isso geralmente está associado ao sinal de tensão estar constantemente à deriva ou mais alto/mais baixo do que o alcance de gravação do amplificador. Na maioria das ocasiões, esse comportamento é causado pelo bloqueio do eletrodo de gravação (ou sua ponta é muito fina - com resistência muito alta ou capacitância intramural - para conduzir adequadamente mudanças rápidas de sinal). Embora se possa tentar desbloquear a ponta zumbindo a capacitância do eletrodo, o que às vezes funciona, muitas vezes a situação é melhor resolvida simplesmente trocando o eletrodo de gravação. Isso pode exigir ajustes de parâmetros no instrumento extrator de microeletrodos para diminuir a resistência da ponta dos novos eletrodos. A ponta do eletrodo também pode ficar bloqueada em preparações, para as quais demorou muito para cobrir o orifício da córnea com vaselina. O contato prolongado com o ar pode secar o tecido retiniano recém-exposto, transformando sua camada superficial em uma substância semelhante a cola. Se for esse o caso, o investigador normalmente vê uma bolha vermelha de tecido presa no eletrodo de gravação ao puxá-lo para fora do olho. A única solução aqui é fazer uma nova preparação. A vaselina pode proporcionar muitos benefícios para os registros eletrofisiológicos: (i) evita a coagulação da hemolinfa que poderia romper a ponta do eletrodo; (ii) reveste a ponta do eletrodo reduzindo sua capacitância intramural, o que diminui a constante de tempo do eletrodo e, portanto, tem o potencial de melhorar a resolução temporal dos sinais neurais registrados^40,41; (iii) mantém a ponta do eletrodo limpa, facilitando as penetrações; e após a penetração, (iv) pode até ajudar a selar a ponta do eletrodo na membrana celular⁴².

O sinal pode ainda ser instável ou perdido quando o fio de cloreto de prata do porta-eletrodo é quebrado ou descloridado; nesse caso, basta substituir ou reclorar o fio antigo. O sinal ausente também pode resultar de um (ou ambos) dos porta-eletrodos não estarem conectados com segurança aos seus conectores. No entanto, é extremamente incomum que um equipamento esteja com defeito. Se o sinal for indetectável e todas as outras possibilidades tiverem sido esgotadas, testar se cada parte do aparelho de registo, incluindo o headstage, amplificador, filtros passa-baixo e conversores AD/DA, estão correctamente ligados e a funcionar normalmente. Uma maneira de conseguir isso é substituir cada instrumento por outro de um equipamento que funcione normalmente. Como alternativa, use um gerador de sinal para verificar o desempenho dos componentes eletrônicos um por um.

Mas talvez o problema técnico mais comum enfrentado pelo eletrofisiologista seja o de registrar ruído. Em termos gerais, o ruído de gravação é a atividade elétrica observada além da resposta neuronal direta a um determinado estímulo. Como a preparação da mosca, quando feita corretamente, é muito estável, o ruído observado (além da variável natural das respostas) geralmente resulta de loops de aterramento no equipamento de gravação ou é captado de dispositivos elétricos próximos. Esse ruído é tipicamente um zumbido principal de 50/60 Hz e seus harmônicos; mas às vezes composto de formas de onda mais complexas. Para descobrir a origem do ruído, remova o suporte de preparação da mosca da configuração, conecte os eletrodos de gravação e referência através de uma gota de Ringer de mosca (ou coloque-os em um pequeno banho de solução de Ringer; consulte a etapa 1.2.6) e grave o sinal no modo CC ou ponte. Se o ruído for observável no sinal gravado, isso provavelmente significa que o ruído é externo à preparação da mosca.

Outro bom teste para identificar a origem do ruído é substituir os porta-eletrodos por um modelo de célula elétrica conectada ao amplificador. Em uma configuração idealmente configurada e aterrada, o sinal gravado agora deve estar praticamente livre de ruído, mostrando apenas o ruído de bits estocástico do conversor AD (na melhor das hipóteses, nem isso!). Se o ruído ainda estiver presente, verifique novamente se todos os equipamentos da plataforma estão devidamente aterrados. Uma abordagem conveniente para detectar loops de aterramento é: (i) desconectar todos os fios de aterramento de todas as peças dentro da plataforma; ii) assegurar que, depois de o fazer, todas as partes sejam efectivamente isoladas do solo, por meio de um ohmímetro; (iii) conectar as partes, uma a uma, diretamente ao aterramento central, não através de qualquer outra parte da plataforma. Tente também alterar as configurações do equipamento. Por exemplo, às vezes, mover o computador e o monitor para mais longe do equipamento pode reduzir o ruído; No entanto, em outras ocasiões, mover o computador dentro do rack do equipamento reduz o ruído. Também vale a pena desconectar o equipamento próximo para ver se o ruído é reduzido ou proteger componentes adicionais. Além disso, tente desconectar ou substituir diferentes componentes do equipamento de gravação, especialmente cabos BNC (que podem ter conexões de aterramento defeituosas). Se apenas ruído de bit for observado ao usar o modelo de célula, a fonte de ruído inicial são os eletrodos ou a própria preparação da mosca. Por exemplo, pode ser que o eletrodo de referência esteja inadvertidamente tocando um nervo motor ou fibras musculares ativas dentro da cápsula da cabeça (ou perturbando os músculos de vôo no tórax - se colocado lá). Geralmente é mais simples preparar uma nova mosca para gravação, tomando cuidado para minimizar os danos à mosca. Mas se o ruído persistir e for de banda larga, é provável que os eletrodos estejam abaixo do ideal para os experimentos; muito afiado / fino (portanto, muito barulhento) ou apenas errado para o propósito; Vimos até eletrodos de quartzo agindo como antenas - captando sinais de transmissão fracos! Embora a iteração das configurações de parâmetros do instrumento extrator para gerar os microeletrodos certos para gravações consistentes de alta qualidade de tipos específicos de células possa exigir muito esforço, vale a pena. Uma vez que os eletrodos de gravação estejam bem adaptados para os experimentos, eles podem fornecer gravações duradouras de excelente qualidade.

Técnicas de gravação de microeletrodos afiados podem ser aplicadas de forma semelhante para estudar o processamento de informações neurais em uma infinidade de preparações, incluindo diferentes camadas de processamento nos olhos e no cérebro do inseto^43,44. Como as pontas dos microeletrodos podem ser muito finas, elas normalmente danificam menos as células estudadas do que a maioria das aplicações de patch-clamp. É importante ressaltar que os modernos amplificadores de microeletrodos de amostra e retenção permitem um bom controle das propriedades elétricas das pontas^40,45-47. Assim, quando aplicada corretamente, essa técnica pode fornecer dados confiáveis de preparações in vivo^3,5,7-10,44 ou in vitro⁴⁸ com alta relação sinal-ruído com resolução inferior a milissegundos. Essa precisão seria impossível com as técnicas de imagem óptica atuais, que são mais barulhentas e lentas. Além disso, o método pode ser usado para caracterizar as propriedades da membrana elétrica de pequenas células em configurações de pinça de corrente e tensão^{5,29,33,36,40-42,49}, fornecendo dados valiosos para abordagens de modelagem biofísica e empírica^{7,8,11,33,49-54} que ligam experimentos à teoria.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio Zoom Estéreo para fazer a preparação da mosca	Oculares Olympus	SZX12 DFPLFL1.6x PF: WHN30x-H/22	Capaz de ampliação de ~150X com longa distância de trabalho; suporte de montagem de mesa de aço pesado sob medida
Estereomicroscópio na configuração intracelular	·   Olympus	Olympus SZX7; oculares: WHN30x-H/22	As oculares de 30X são necessárias para ver bem os reflexos da ponta do eletrodo ao conduzi-lo através do pequeno orifício da córnea para o olho
Microscópio Nikon	SMZ645; oculares: C-W30x/7
Mesa antivibração	Melles Griot	Com furos métricos M6 na placa	de ensaioNossos equipamentos sob medida têm um grande orifício perfurado através da placa de ensaio grossa que permite a entrada do poste da plataforma de preparação de moscas (abriga um dissipador de calor de cobre com eletrônicos) por baixo dos
Newport
	Narishige	Narishige NMN-21	Em nossas configurações intracelulares, diferentes sistemas de micromanipuladores são usados para conduzir os eletrodos de gravação de modelagem no olho da mosca. Todos os manipuladores listados estão fornecendo com sucesso gravações estáveis e duradouras de fotorreceptores de Drosophila e LMCs.
Huxley Bertram	Huxley eixo xyz com controle
Sensapex	Sensapex eixo triplo
Mä rzhä usuário	Mä rzhä usuário DC-3K com passo piezo de eixo x adicional e controlador
Suportes magnéticos	Qualquer base magnética com interruptor liga/desliga servirá		Por exemplo, para gerenciar cabos dentro da gaiola de Faraday
Suportes de Eletrodos	Aparelho Harvard	ESP/W-F10N
Fio de Prata	World Precision Instruments	AGW1510	0,3 - 0,5 mm de diâmetro; precisa ser cloridizado para os porta-elétrodos
Fonte de Luz de Fibra Óptica	Muitos diferentes, incluindo Olympus
Pacotes de Fibra Óptica	Tecnologia		Para fornecer o estímulo de luz LED ao sistema de braço Cardan. Usamos guias de luz líquida e de quartzo (variam de UV a IR)
Tubo
P80-50P 50ml Cent. Tubo PP., Pacote de 100 Pcs	Corte o fundo cônico de um tubo de centrífuga de plástico de 50 ml e cole uma ponta de pipeta de 1 ml nele.
Sistema de Aquisição Digital	National Instruments
Amplificador de microeletrodo de corrente/braçadeira de tensão de eletrodo único	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html	Excelente desempenho!
Padrão de estágio principal	(+/- 150 nA)	npi SEC-10LX
e drivers	2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK)		Muitos de nossos sistemas de estímulo são construídos internamente
de Aquisição e Análise auto-projetado e construído
	Muitas empresas para escolher entre		Biosyst; sistema baseado em Matlab escrito sob medida para trabalho experimental e teórico no laboratório Juusola
Computador pessoal ou Mac			Garantir que PC ou Mac seja compatível com o sistema de aquisição de dados e software
Sistema de braço cardan	Auto-projetado e construído		Fornecendo posicionamento preciso x, y, z dos estímulos de luz
Sistema de controle de temperatura Peltier	auto-projetada e construída
	Blindagem auto-construída		contra ruído eletromagnético
Capilares de vidro de borossilicato filamentado	Diâmetro externo: 1 mm
	Sutter Instrument Company	Modelo P-2000 laser Extrator de Micropipetas Flamejante/Marrom	Para eletrodos de referência de borosilicato, use o programa predefinido #11 (eletrodos de patch): Calor = 350; Filamento = 4; Velocidade 36; Atraso = 200).1.2.1). Para eletrodos de gravação de borosilicato, use o programa predefinido #12 (isso normalmente puxa bons sharps convencionais  para gravações de fotorreceptores): Calor = 355; Filamento = 4; Velocidade 50; Atraso = 225; Puxe = 150. Para gravações LMC, que requerem eletrodos com pontas mais finas, esses valores precisam ser ajustados. Para puxar capilares de quartzo, o manual P-2000 sugere programas para microeletrodos de ponta fina. Esses programas' Os parâmetros predefinidos servem como pontos de partida úteis para modificações sistemáticas para gerar eletrodos com bom sucesso de penetração e baixo ruído de gravação.
Solução de Ringer Extracelular para o	eletrodo de referência Produtos químicos da Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacarose	Veja a receita na seção do protocolo
3 M Solução KCl para preencher o microeletrodo de registro filamentado	Sais da Fisher Scientific	10010310, KCl
Vaselina Vaselina
Lâminas
Porta-lâminas/quebrador	Ferramentas de Ciência Fina Por Dumont	10053-09	9 cm
Blu-tack	Bostik		Alternativamente, use argila de moldagem
Fórceps	Fine Science Tools Por Dumont	11252-00	#5SF (pontas superfinas)