Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Resumo

Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.

Resumo

As recentes melhorias no Förster transferência de energia de ressonância (FRET) sensores permitiram a sua utilização para detectar várias moléculas pequenas, incluindo íons e aminoácidos. No entanto, a fraca intensidade do sinal dos sensores de FRET inato é um grande desafio que impede a sua aplicação em vários campos e torna o uso de caro, de ponta fluorómetros necessário. Anteriormente, nós construímos, um analisador de FRET relação custo-benefício de alto desempenho que podem especificamente medir a razão de duas bandas de comprimento de onda de emissão (530 e 480 nm) para alcançar alta sensibilidade de detecção. Mais recentemente, descobriu-se que os sensores traste com proteínas de ligação periplasmática bacteriana detectar ligandos com a máxima sensibilidade na gama da temperatura crítica de 50 - 55 ° C. Este relatório descreve um protocolo para avaliar teor de açúcar em amostras de bebidas disponíveis comercialmente usando o nosso analisador FRET portátil com um sensor de FRET específicas de temperatura. Os nossos resultados mostraram que o pré-aquecimento adicionaldo processo do sensor de FRET aumenta significativamente a relação sinal de FRET, para permitir uma medição mais precisa do teor de açúcar. O analisador e o sensor de FRET feito por encomenda foram aplicadas com sucesso para quantificar o teor de açúcar, em três tipos de bebidas comerciais. Prevemos que reforçar ainda mais a redução de tamanho e desempenho do equipamento vai facilitar o uso de analisadores portáteis em ambientes onde o equipamento high-end não está disponível.

Introdução

Förster transferência de energia de ressonância (FRET) tem sido amplamente utilizado como um sensor biométrico para detectar pequenas moléculas tais como os açúcares, os iões de cálcio, e os aminoácidos ^1-4. biossensores FRET contêm proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes ciano (CFP) e proteínas fluorescentes amarelas (YFPs), que estão fundidos a ambas as extremidades de proteínas de ligação a periplásmicas (PBPs). Açúcares se ligar a PBP situadas no meio do sensor de FRET, causando alterações estruturais do sensor que, posteriormente, alterar a orientação e a distância transição dipolo das duas proteínas fluorescentes em cada extremidade da PLP. ....

Protocolo

1. Preparação de Biosensor

1. Construir o plasmídeo pET21a (+) - PCP-MBP-YFP-His6, seguindo o protocolo estabelecido ^{anteriormente-2.}
2. Inocular 5 ml de caldo Luria (LB) com uma única colónia de uma estirpe de Escherichia coli DE3 e incubar a 37 ° C durante 16 horas com agitação.
3. Transferir 1 ml da cultura D / N para um balão de 500 ml contendo 100 ml de LB e incubar a 37 ° C num incubador com agitação, até a densidade óptica a 600 nm (DO ₆₀₀₎ atingir de 0,5 (cerca de 3 h).
4. Colher as células num tubo cónico de 50 ml por centrifugação a 1000 × g durante 20 min a 4 ° C.
5. Ressuspender o sediment....

Resultados

Para realizar a análise quantitativa do conteúdo de açúcar usando o analisador de FRET, que é necessário para construir uma curva ajustada a estimativa da concentração de açúcares alvo a partir da razão observada FRET. Seja r definir a razão entre a intensidade de emissão de PCP a 480 nm e a intensidade de emissão de YFP gerado a 530 nm (Eq. 1).

Discussão

Este protocolo permite a quantificação rápida e eficiente do teor de açúcar em amostras de bebidas, utilizando um feito por medida de FRET analisador de ⁷ a uma temperatura óptima para sensores de FRET. O analisador foi projetado com um recém-desenvolvido, barato banda de 405 nm de ultravioleta do LED como fonte de luz e dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Este dispositivo é mais rentável do que outras fluorímetros comparáveis. O dispositivo mostrou alta sensibilidade de detecção, especialmente q.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
LB	BD	# 244620
isopropil β -D-tiogalactosídeo (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicilina	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4
SOC			2% triptona, 0,5% Extrato de levedura, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM
Glucose Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 &vezes; coluna de cromatografia de troca aniônica de 30 mm
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Cubeta de quartzo	Sigma	Z802875
AKÄ KTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	uma cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		um espectrofotômetro de fluorescência
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	um leitor de placas multietiquetas
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Células eletrocompetentes
A (Bebida)	Korea Yakult Co. (Coreia)	Birak	Bebidas fermentadas
B (Bebida)	Lotte Foods (Coreia)	Epro	Soft drink
C (Bebida)	Lotte Foods (Coreia)	Getoray	Sports drink