Mucinas são glicoconjugados de alto peso molecular, com tamanho variando de 0,2 a 200 megadalton (MDa). Como resultado de seu tamanho, as mucinas não penetram nos géis convencionais de poliacrilamida e requerem poros maiores para separação. Fornecemos um protocolo detalhado para eletroforese em gel de mucina agarose para avaliar a quantificação relativa e estudar a montagem do polímero.
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Artigo de método
Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mucinas, as proteínas altamente glicosiladas que revestem as superfícies das mucosas, evoluíram como um componente chave da defesa inata, protegendo o epitélio contra patógenos invasores. O principal papel destas macromoléculas é facilitar aprisionamento de partículas e ao promover a lubrificação depuração da mucosa. Durante a síntese de proteínas, mucinas submetidos a intensa O-glicosilação e multimerização, o que aumenta drasticamente a massa e tamanho destas moléculas. Estas modificações pós-translacionais são essenciais para as propriedades viscoelásticas do muco. Como um resultado da natureza bioquímicas e biofísicas complexo destas moléculas, que trabalha com mucinas fornece muitos desafios que não podem ser superadas por meio de métodos convencionais de análise de proteína. Por exemplo, o seu elevado peso molecular evita a migração electroforética através de géis de poliacrilamida regulares e a sua natureza pegajosa promove a adesão a uma tubagem experimental. No entanto, a investigar o papel de mucinas na saúde(Por ex., Manter a integridade da mucosa) e doenças (por ex., Hiper-concentração, mucostasis, cancro) recentemente ganhou interesse e mucinas estão a ser investigados como um alvo terapêutico. Uma melhor compreensão da função e produção de mucina macromoléculas pode conduzir a novas abordagens farmacêuticas, por exemplo, inibidores da exocitose da mucina do grânulo e / ou agentes mucolíticos. Portanto, protocolos consistentes e confiáveis para investigar a biologia mucina são fundamentais para o avanço científico. Aqui, descrevemos métodos convencionais para separar macromoléculas de mucina por electroforese usando um gel de agarose, a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose, e detectar o sinal com anticorpos específicos de mucina, bem como leitor de gel fluorescente no infravermelho. Estas técnicas estão amplamente aplicável para determinar a quantificação de mucina, a multimerização e para testar os efeitos dos compostos farmacológicos sobre mucinas.
Introdução
As mucinas são normalmente produzidos por superfícies mucosas que revestem as cavidades expostas ao ambiente exterior (por exemplo., Respiratório, digestivo, reprodutivo, extensões da superfície ocular), bem como os órgãos internos (por exemplo, pâncreas, vesícula biliar, glândulas mamárias). A presença destas glicoproteínas mantém a hidratação da superfície e forma uma barreira física contra os agentes patogénicos. Embora a produção de mucina é essencial para a saúde das mucosas, hiper-concentração de mucina e / ou as propriedades do muco aberrantes pode conduzir a obstrução do canal, a colonização bacteriana e inflamação crónica, o que pode causar....
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Protocolo
1. Prepare tampões para mucina Gel Western Blotting
- Prepare 1 litro de tampão 50x TAE (Tris-acetato-EDTA).
- Em 700 ml de água destilada (dH2O) adicionar 242 g de Tris base (0,4 M), 57,1 g de ácido acético glacial (peso líquido) (0,2 M) e 14,61 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (50 mM).
- Ajustar o pH para 8,0 e perfazer o volume a 1 litro com dH2O
- Preparar 10 ml de 10x tampão de carga.
- Prepare 5 ml de tampão 1 x TAE. Para fazer isso, adicionar 5 ml de glicerol (50%), 25 mg de azul de bromofenol (0,25%), e 100 mg de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) (1%).
- Prepa....
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Resultados
Nós mostramos resultados representativos de expressão de mucina a seguir a electroforese em gel de agarose na LBA dos pulmões de ratinhos (Figura 1). Neste exemplo, utilizou-se o gel de agarose a mostrar sobre-regulação de produção de mucina na sequência de IL-13 de tratamento do modelo de ratinho Tg-MUC5AC. O Western blot mostra uma representação visual de expressão de mucina, o qual pode ser usado para a análise quantitativa de multímero ou intensidade de sinal de band.......
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Discussão
O protocolo de mucina transferência de Western descrito neste vídeo combina técnicas convencionais utilizados em biologia molecular para separar e transferir grandes macromoléculas, tais como ADN, com técnicas normais para a detecção da proteína, isto é., Imunotransferência. A mesma técnica pode ser aplicada para estudar a biologia dos glicosaminoglicanos complexas, tais como a desagregação de alta peso molecular do ácido hialurónico 18. Embora esta técnica poderia ser utilizada numa vasta gama de en.......
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Divulgações
Os autores não têm qualquer conflito de divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. John Sheehan e à Dra. Lubna Abdullah por sua orientação e orientação que foram fundamentais para a conclusão deste trabalho. Este trabalho foi apoiado por fundos dos Institutos Nacionais de Saúde (P01HL108808, UH2HL123645) e da Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey é apoiada por uma bolsa de pesquisa em início de carreira do NHMRC.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Ácido Acético Glacial | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glicerol | Fisher | BP229-1 | L |
| Azul de Bromofenol | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Citrato Salino de Sódio) Tampão | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Citrato Trissódico (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (ditiotreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| de leite em pó | Saco | Leite em pó instantâneo desnatado | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anticorpo primário de cabra anti-GFP (amostras de camundongo) | Anticorpos e ensaios Rockland | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Anticorpo primário de coelho (amostras de camundongo) | UNC | ||
| Anticorpos primários anti-MUC5B H300 (amostras humanas) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μ g |
| 45M1 Anticorpos Primários Anti-MUC5AC (amostras humanas) | Abcam | ab3649 | 100 μ g |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0,5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0,5 mg |
| Caixa de Gel de Eletroforese e Bandeja de Fundição | Sistemas de Separação | ||
| Caixa de Fonte de Alimentação | Biorad | Modelo 200/20 | |
| Papel Absorvente de Membrana | Amersham | 10600016 | |
| Membrana de papel e nitrocelulose Whatman | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Sistema de Fluorescência Infravermelha | LI-COR Biosciences |
Referências
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotei....
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Reimpressões e permissões
