A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.
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Artigo de método
Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Compreender o papel dos fatores que regulam a homeostase epitelial intestinal e a resposta à lesão e regeneração é importante. A literatura atual descreve várias abordagens metodológicas diferentes para obter imagens de tecidos intestinais para validação de dados. Neste artigo, delineamos um protocolo comum relacionado à derivação e processamento de tecidos intestinais de camundongos. A fixação adequada dos tecidos intestinais e as técnicas de rolo suíço que melhoram a morfologia epitelial intestinal são discutidas. O processamento pós-ressecção e a reorientação dos tecidos intestinais incorporados são críticos na obtenção de blocos embebidos em parafina que exibem características estruturais intestinais intactas após a secção. A técnica de rolamento suíço auxilia na avaliação histológica dos cortes intestinais ou colônicos completos examinados. A capacidade de diferenciar as características estruturais intestinais pode ser vital em medições quantitativas de inflamação intestinal e tumorigênese ao longo de todo o comprimento. Finalmente, as seções embebidas em parafina são ideais para processamento robusto usando métodos de detecção imuno-histoquímica e imunofluorescente. Cortes imuno-histoquímicos não fluorescentes fornecem uma imagem vibrante do tecido detalhando diferentes características estruturais celulares, mas não fornecem flexibilidade para experimentos de co-localização intracelular. Múltiplos canais fluorescentes podem ser utilizados adequadamente com detecção imunofluorescente para experimentos de co-localização, dando suporte a estudos mecanicistas.
Introdução
O epitélio intestinal de mamífero compreende uma única camada de células colunares. No intestino delgado, as células proliferativas são confinados às criptas enquanto que as células diferenciadas ocupar a região da vilosidade. No entanto, porque não há nenhum vilosidades no intestino grosso, as células proliferativas são localizadas na parte inferior das criptas e células diferenciadas ocupar a região superior das criptas. O epitélio intestinal sofre reposição rápida (cerca de 3-5 dias) que é accionado por divisão contínua das células proliferativas nas criptas. As células proliferativas das criptas não são uma população homogénea e são ainda subdivididas em células ....
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Protocolo
1. Ratos
- Todos os estudos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Stony Brook University (IACUC). Os ratinhos foram mantidos num ciclo de luz-escuro 12:12 h.
- Comercialmente obter ratinhos C57BL / 6. Obter camundongos C57BL / 6 com alelos Klf5 flanqueadas por locais loxP (Klf5 f l / f l). Estes ratos foram previamente descritos 21 e graciosamente cedido pelo Dr. Ryozo Nagai.
- Comprar camundongos C57BL / 6 portadores do gene induzível recombinase Cre sob regulação do promotor Lgr5 (ratos Lgr5-EGFP / CreERT2). ....
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Resultados
A técnica de rolamento suíça em combinação com coloração imuno-histoquímica permite a análise abrangente do tecido intestinal pequeno ou grande. O exemplo de coloração de H & E de um intestino grosso de um C57BL / 6 de ratinho (Figura 1) é uma ilustração da exequibilidade e a eficácia desta técnica. Como mostrado na Figura 1, a imagem é capaz de capturar todas as porções do cólon: proximal, médio e distal. Assim, permite a avaliação .......
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Discussão
A técnica de laminação Swiss é um método poderoso para a preparação de tecido intestinal para avaliação histológica e morfológica em grande escala. Em contraste com a técnica Swiss-laminagem anteriormente descrita, que foi originalmente desenvolvido para preparação de secções congeladas 18,19, o processo aqui apresentado permite a preparação do tecido intestinal rápida e a fixação para a fixação de formalina e embebidos em parafina (FFPE). Em comparação com tecido congelado, o tecido FFPE tem muito maior vida.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Ainara Ruiz de Sabando por fornecer imagens de H&E. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (DK052230, DK093680 e CA172113) concedidas ao Dr. Vincent W. Yang.
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Materiais
T2
Tecido detecção de polímero AP de coelho da Biocare Medical M3R533L Kit de cromogênio vermelho de urdidura Biocare Medical WR806 H Lgr5-EGFP/CreER camundongos
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kits de dissecação em aço inoxidável | VWR | 25640-002 | |
| Câmara de desmontagem | Biocare Medical | DC2012 | |
| Seringa 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| de incorporação/processamento de tecidos com tampa | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [tamanho: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Conjunto de coloração manual | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Prato de coloração verde | Prato de coloração Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Branco | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| Suporte de slides de 24 slides com alça destacável | |||
| Microscópio de dissecação | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Microscópio de fluorescência | Nikon | Eclipse 90i | Luz brilhante e fluoerescente, com objetivas: 10X, 20X |
| Caneta PAP Bloqueador de Super-Líquido Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Etanol 200 prova | AAPR | 111000200 | |
| Metanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Ácido acético glacial | AAPR | 281000ACS | |
| Xileno | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Solução de peróxido de hidrogênio a 25% em água | ACROS | 202465000 | |
| formalina buferizada a 10% | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Soro bovino fração V, choque térmico | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Citrato de sódio | Fisher Scientific | S279 | |
| Agulha de gavagem | VWR | 20068-624 | |
| Anticorpo anti Klf5 de coelho | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Diluição 1:150 |
| Anticorpo anti-EGFP de frango | Diluição de AB16901 Millipore 1:500 | ||
| Anticorpo | anti Ki67 de coelhoKit | de | Mach3 de diluição de CRM325B |
| Jackson Labs | 008875 | ||
| Processador automatizado | Leica | Leica TP1020 |
Referências
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. ....
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Reimpressões e permissões
