Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Resumo

A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.

Resumo

Compreender o papel dos fatores que regulam a homeostase epitelial intestinal e a resposta à lesão e regeneração é importante. A literatura atual descreve várias abordagens metodológicas diferentes para obter imagens de tecidos intestinais para validação de dados. Neste artigo, delineamos um protocolo comum relacionado à derivação e processamento de tecidos intestinais de camundongos. A fixação adequada dos tecidos intestinais e as técnicas de rolo suíço que melhoram a morfologia epitelial intestinal são discutidas. O processamento pós-ressecção e a reorientação dos tecidos intestinais incorporados são críticos na obtenção de blocos embebidos em parafina que exibem características estruturais intestinais intactas após a secção. A técnica de rolamento suíço auxilia na avaliação histológica dos cortes intestinais ou colônicos completos examinados. A capacidade de diferenciar as características estruturais intestinais pode ser vital em medições quantitativas de inflamação intestinal e tumorigênese ao longo de todo o comprimento. Finalmente, as seções embebidas em parafina são ideais para processamento robusto usando métodos de detecção imuno-histoquímica e imunofluorescente. Cortes imuno-histoquímicos não fluorescentes fornecem uma imagem vibrante do tecido detalhando diferentes características estruturais celulares, mas não fornecem flexibilidade para experimentos de co-localização intracelular. Múltiplos canais fluorescentes podem ser utilizados adequadamente com detecção imunofluorescente para experimentos de co-localização, dando suporte a estudos mecanicistas.

Introdução

O epitélio intestinal de mamífero compreende uma única camada de células colunares. No intestino delgado, as células proliferativas são confinados às criptas enquanto que as células diferenciadas ocupar a região da vilosidade. No entanto, porque não há nenhum vilosidades no intestino grosso, as células proliferativas são localizadas na parte inferior das criptas e células diferenciadas ocupar a região superior das criptas. O epitélio intestinal sofre reposição rápida (cerca de 3-5 dias) que é accionado por divisão contínua das células proliferativas nas criptas. As células proliferativas das criptas não são uma população homogénea e são ainda subdivididas em células estaminais e células-amplificação de trânsito (TA) ^1. As células estaminais reside na parte inferior da cripta, dentro das primeiras 4 - 5 células a partir da parte inferior ^2. O modelo atual suporta a existência de dois tipos de células-tronco: as células-tronco da cripta colunar base (CBC) e de reserva de células estaminais quiescentes. A CBC scélulas dez estão se proliferando de forma activa e são marcados por rica em leucina contendo repetição G-proteína receptor acoplado 5 (Lgr5) ^3, Olfactomedin 4 (Olfm4) ⁴ e Achaete scute-like 2 (Ascl2) ^5. Por outro lado, as células estaminais quiescentes de reserva são rotulados por Moloney site B específico da célula vírus da leucemia murina de integração 1 (Bmi1) ^6, a telomerase rato transcriptase reversa (mTert) ^7, HOP homeobox (Hopx) ^8, duplacortina-like e CAM Kinase -como 1 (Dclk1) ^9, e leucina-ricos repete e do tipo imunoglobulina domínios 1 (Lrig1) ^10. As células estaminais que proliferam activamente dar origem a células TA, em seguida, submetido a posterior diferenciação em células absortivas (enterócitos) e células secretoras (enteroendócrinas, caliciformes, células de Paneth e flocos). divisão celular contínua na zona proliferativa resulta em movimento ascendente de células epiteliais ao longo do eixo de cripta-vilosidade até atingirem a parte superior da vilosidade, onde eles sofrem apoptose e sãodescartadas a partir da superfície do epitélio. Os diferentes tipos de células epiteliais intestinais estão marcados pela expressão de proteínas diferentes (por exemplo, células caliciformes intestinais podem ser reconhecidos através de coloração com anticorpo contra células de Paneth MUC2 e com anticorpo contra lisozima). Nós estudar o papel de factores como Krüppel-(KLFs) na homeostase e patobiologia do epitélio intestinal ^11-13. Os resultados aqui apresentados apoiar a viabilidade de uma técnica de laminagem Swiss modificado baseiam-se em estudos anteriores sobre o papel do factor-Krüppel como 5 (KLF5) na manutenção das proliferam activamente células estaminais epiteliais intestinais ^14. KLF5 é um factor de transcrição dedo de zinco que é altamente expresso na haste intestinal activa e ¹² alvéolos Ta. Estudos anteriores demonstraram que KLF5 é co-expressa com Ki-67, um marcador conhecido proliferativa nas criptas intestinais.

O tr gastrointestinal ato não é um tecido estruturalmente ou funcionalmente homogénea. O intestino delgado é dividido em duodeno, jejuno e íleo e o intestino grosso no ceco e no cólon, com esta última ainda divididas em segmentos proximal, médio e distal. Cada uma destas secções tem características histológicas únicas e desempenha papéis distintos ^15. Como tal, os efeitos de insultos e o grau de resposta do epitélio intestinal pode depender da região de tecido estudado ^16. Além disso, várias estirpes de ratos demonstrar a diversidade da resposta ao nível histológico com base no tipo de insulto utilizado nos estudos ^16. Assim, condizente com a preparação do tecido é necessário para permitir histológico apropriado e análise molecular dos tecidos intestinais. Como tal, a-rolo suíço análise bolsas técnica de todo o comprimento do epitélio intestinal de uma só vez e, assim, verifica conclusões bem informadas com base numa informação global.

e_content "> A técnica Swiss-rolo foi mencionado pela primeira vez por Magnus ^17, e descrito em detalhe por Moolenbeck e Ruitenberg e Park et al., como um método para a preparação de tecidos e realizando análises histológicas do intestino roedor ^18,19, respectivamente. O protocolo delineada na presente publicação apresenta uma versão melhorada do método original que permite a preparação do tecido oportuna e confiável para fins de diagnóstico. esta técnica modificada permite coleções e preparação do epitélio intestinal de técnicas universalmente utilizados, tais como imuno-histoquímica, imunofluorescência, bem eficientes como hibridação in situ (fluorescente e cromogénico ^20). Além disso, o tecido modificado espécime método de preparação utiliza reagentes facilmente disponíveis e relativamente pouco dispendiosos, enquanto que oferecem um método de fixação rápida dos tecidos e permite a recuperação de proteína, ADN e ARN para a avaliação adicional. Tomados juntos, this técnica é excelente para avaliação abrangente dos aspectos histopatológicos, patológicas e moleculares do epitélio intestinal.

Protocolo

1. Ratos

1. Todos os estudos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Stony Brook University (IACUC). Os ratinhos foram mantidos num ciclo de luz-escuro 12:12 h.
   1. Comercialmente obter ratinhos C57BL / 6. Obter camundongos C57BL / 6 com alelos Klf5 flanqueadas por locais loxP (Klf5 ^{f l / f l).} Estes ratos foram previamente descritos ²¹ e graciosamente cedido pelo Dr. Ryozo Nagai.
2. Comprar camundongos C57BL / 6 portadores do gene induzível recombinase Cre sob regulação do promotor Lgr5 (ratos Lgr5-EGFP / CreERT2).
3. Para estabelecer Lgr5-EGFP / creer ^T2 / Klf5 ^{f l / f l} ratos, atravessar Klf5 ^{fl / f l} camundongos com ratos / creer ^T2 Lgr5-EGFP e depois retrocruzamento a prole para Klf5 ^{fl / f l} ratos.
4. Camundongos deleite com tamoxifeno como por o protocolo previamente descrito ^22. Injectar 8 semanas de idade, os ratinhos de controlo e experimentais por via intraperitoneal (IP) com 1 mg de tamoxifeno (10 mg / mL), dissolvidos em óleo de milho estéril, durante 5 dias consecutivos.
5. No dia 14 após a primeira injecção tamoxifeno, sacrificar os ratinhos utilizando asfixia com CO _2, colocando-os em uma câmara ligada ao CO ₂ fonte de gás. Permitir que o gás flua para dentro da câmara até que os ratinhos são inconsciente e todo o movimento cessa. Para assegurar a eutanásia executar deslocamento cervical.

2. Preparação de tecidos e Swiss Rolamentos

1. Utilizando fórceps de dissecção e uma tesoura, corte de uma incisão na pele do lado abdominal. Com um par de fórceps, segure a pele na incisão e puxe para fora do tecido do músculo abdominal. Utilizar um par de tesouras para cortar a pele abdominal e expor os músculos abdominais.
2. Segurar e puxar para cima o peritoneum com a pinça. Certifique-se de não estar segurando e puxando os intestinos. Cuidadosamente fazer uma incisão no tecido peritoneal e continuar a cortar afastado da pele para expor os músculos abdominais. Cuidadosamente fazer uma incisão nos músculos abdominais e continuar cortando-a para expor os intestinos.
3. Identificar os dois pontos e traço para a extremidade distai onde se junta o recto / ânus. Com um par de tesouras, cortar o mais próximo possível da abertura anal quanto possível.
4. Identificar o estômago e de rastreio, onde se junta com o intestino delgado. Com uma tesoura, corte libertar o intestino cerca de 1 cm de distância do estômago. Transferir todo o comprimento do intestino delgado e cólon libertado para uma placa de Petri limpa contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS).
5. Com uma mão ou um par de fórceps, segure a extremidade distai do cólon e utilizar a outra mão para desvendar suavemente todo o comprimento do cólon a partir de qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura mesentérica.
6. Identificar o ceco(Pequena bolsa entre o intestino delgado e grosso) e cortar onde o ceco e no cólon join (a extremidade proximal do cólon) para libertar no cólon.
7. Com uma mão ou um par de fórceps, segurar o intestino delgado e utilizar a outra mão para desvendar suavemente todo o comprimento do intestino delgado a partir de qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura mesentérica. Cortar o ceco e descarte se não houver necessidade.
   Nota: O processo pode ser interrompido aqui por incubação dos intestinos dissecados em fixador de Bouin modificada (50% de etanol / 5% ácido acético em dH ₂ O) durante a noite e continuar o procedimento no dia seguinte.
8. Manipulação de um segmento do intestino (intestino delgado ou do cólon), encher uma seringa de 10 ml com fixador de Bouin modificado e anexar uma agulha de gavagem a ele. Inserir a agulha cerca de meio centímetro na abertura anterior do segmento intestinal.
9. Segurar a agulha de gavagem no interior do segmento intestinal por aplicação de uma pressão firme com um instrumentono segmento intestinal. Com a outra mão segura a seringa, aplique pressão suave, mas consistente para liberar o conteúdo do segmento intestinal usando fixador modificado de Bouin. Este passo permite que a limpeza simultânea do segmento intestinal e fixação imediata. Use uma placa de Petri para recolher os resíduos de fluxo. A fixação pode ser observado pela cor cólon transformando opaco.
   Nota: Certifique-se de não aplicar muita pressão durante a lavagem ou o segmento intestinal poderia estourar aberto.
10. Com uma tesoura, cortar abrir o segmento intestinal longitudinalmente ao longo da linha mesentérica. Segure-o com um par de fórceps e lave-o brevemente em uma placa de Petri contendo PBS.
    1. Cortar o intestino delgado em 3 segmentos iguais: proximal, médio e distal. O segmento proximal é a um imediatamente a seguir ao estômago, e o segmento distai é a única imediatamente antes do cólon. O segmento proximal é equivalente para o duodeno, o meio para o jejuno, eo distalo íleo.
    2. Para cada segmento de marcar as extremidades proximal e a extremidade distal. A extremidade proximal é a que foi inicialmente apontando para o estômago, e distal apontou para o cólon.
11. Usar a parte superior de uma placa de Petri para colocar o segmento intestinal limpa e aberta. Colocar o segmento intestinal com o lado luminal voltada para cima.
    1. Para o cólon, identificar o lado luminal pelos variegations / nervuras correndo através da sua largura e estão presentes na extremidade proximal. As regiões médias e distais têm algumas variegations que correm longitudinalmente. Para o intestino delgado, identificar o lado luminal por a superfície áspera de aparência, que marca as vilosidades.
       Nota: Para o intestino delgado, não há a demarcação anatómica macroscópica externo proximal, médio e distal. No entanto, estas regiões podem ser podem ser identificados em secções sob o microscópio. As vilosidades são mais longa na região proximal e tornar-se gradualmente mais curto distally onde eles estãoo mais curto em comprimento. Microscopicamente, as criptas do cólon são mais curtos na região proximal que também pode ser identificado pela presença de saliências. As criptas colônicas são o mais alto no meio e mais curto na região distal e ainda mais alto do que na região proximal.
12. Prossiga com a Swiss rolando o cólon:
    1. Manter o cólon plana aberta e puxá-lo com uma pinça a partir da sua extremidade proximal para a extremidade da placa de Petri.
    2. Mantenha lado luminal voltado para cima e segure a extremidade proximal com a pinça com uma mão e com a outra mão segure um palito.
    3. Enrole a borda da extremidade proximal em torno do palito usando a pinça e um pouco beliscar a ponta envolto contra o palito para segurá-la no lugar.
    4. Suave e lentamente começar a rolar o palito com os dedos para rolar os dois pontos em torno do palito para formar um rolo suíço.
    5. Uma vez que todo o comprimento do cólon tem sido enrolado, use um par de fórceps para deslizar cuidadosamente o cOlon Swiss roll off o palito e em um tecido de processamento / cassete Embedding. Coloque a gaveta em 10% de formalina tamponada durante a noite à temperatura ambiente.
13. Prossiga com a Swiss rolando o intestino delgado:
    1. Manipulação de um segmento de cada vez, manter o segmento plano aberto com o lado luminal para cima e puxe-o com uma pinça de sua extremidade proximal em direção à borda da placa de Petri.
    2. Continuar com a laminagem do Swiss tal como descrito para o cólon.
14. Prosseguir com o processamento de tecidos fixados em formalina para inclusão em parafina. Proceda da seguinte forma:
    NOTA: Use um processador automatizado (ver Materiais e equipamentos para obter detalhes).
    1. Enquanto o tecido está na cassete, lavar o tecido com PBS até fixador é completamente removido.
    2. Desidratar o tecido utilizando etanol na sequência seguinte: 50% de etanol durante 10 min, 70% de etanol durante 10 min, 80% de etanol durante 10 min, 95% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min , e 100% de etanol durante 10 min.
    3. etanol Exchange com xileno na seguinte sequência: 2: 1 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 1 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 2 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 100% de xileno para 10 - 15 min, 100% de xileno durante 10 - 15 min, e 100% de xileno durante 10 - 15 min. CUIDADO: O xileno é um perigo para a saúde, assim, o local de trabalho deve ser equipado com uma ventilação de exaustão local com um capuz adequada e o equipamento de protecção adequado deve ser usava por pessoal.
    4. xileno intercâmbio com parafina. Executar os seguintes passos num forno de vácuo regulado para 54-58 ° C: 2: 1 xileno: parafina, durante 30 min, 1: 1 xileno: parafina, durante 30 min, 1: 2 xileno: parafina, durante 30 min, 100% de parafina para 1 - 2 horas, e% de parafina 100 para 1 - 2 horas ou durante a noite.
       Nota: Não deixe que a parafina superior a 60 ° C por períodos prolongados de tempo, porque isso irá degradar os polímeros de parafina e torná-lo duro e quebradiço.
    5. Incorporar no novo tecido parafina e oriental fresco como dedesejado antes da parafina endurece. Para os rolos suíços, seguindo parafinização tecido, é importante para reposicionar cada rolo no seu lado durante a inclusão em parafina. Isso garante que, durante o corte, vão ser produzidas secções de todo o comprimento de cada rolo.
15. Para a coloração, corte 5 mm de espessura usando micrótomo. Recolher as secções em lâminas carregadas e secá-las (bake) em um 65 ° C forno durante a noite; deixe esfriar à temperatura ambiente e subsequentemente utilizado para a coloração.
    Nota: O tempo de cozedura pode ser reduzido para 1 - 2 horas dependendo de como acabada de cortar as lâminas são. Se menos de um mês desde o corte, então é aconselhável para assar durante a noite. Se ele tem sido mais de um mês, em seguida, 1-2 hr de bicarbonato é suficiente para poupar tempo. Se correndo contra o tempo, o apoio durante a noite pode ser sempre utilizado.

3. Análise histológica e por imunofluorescência Coloração

Realizar a análise histológica e immunofluorescence coloração como descrito anteriormente ^23,24, com modificações. Para reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) imunofluorescência:

1. Coza os diapositivos num forno de 65 ° C durante 1 hora, para inactivar a actividade de fosfatase alcalina endógena e subsequentemente Desparafinar em xileno.
2. Incubar secções em um banho de 3% de peróxido de hidrogénio em metanol para bloquear peroxidases endógenas de tecido; em seguida, re-hidratados por incubação em série decrescente banho de álcool (100%, 95%, 70%), seguido por recuperação de antigénios em solução tampão de citrato (10 mM de citrato de sódio, 0,05% de Tween-20, pH 6,0) a 125 ° C durante 10 min usando uma câmara decloaking.
3. Desenhar um círculo em torno de secções de tecido utilizando pena de marcação que proporciona uma barreira hidrofóbica e incubar secções com um tampão de bloqueio (2,5% de albumina de soro bovino [BSA] em TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C e, em seguida, com o anticorpo primário contra EGFP (diluição 1 : 500) a 4 ° C durante a noite numa câmara humidificada, agitando suavemente.
4. Lave os cortes e incubar com o anticorpo secundário fluorescente marcada com a concentração apropriada, durante 30 min a 37 ° C.
5. Lavagem das lâminas após tratamento com o anticorpo e mancha núcleos secundários com Hoechst e montar com meios de montagem.
   1. Para Klf5 / EGFP / Ki-67 co-coloração, as lâminas de processo como descrito nas etapas 3.1 - 3.3 e realização da coloração Klf5 por incubação com anticorpo Klf5 (diluição 1: 150) durante a noite.
   2. Aplicar detecção de polímero AP coelho para slides como por protocolo.
   3. Revelar KLF4 coloração com coloração imuno-histoquímica cromógeno, conforme o protocolo do fabricante.
   4. Realizar a eluição do anticorpo utilizando o protocolo previamente descrito ^25. Incubar as lâminas a 50 ° C em glicina-SDS (pH 2,0) solução com agitação durante 1 h.
   5. Lave as lâminas cuidadosamente com água destilada e incubar com um tampão de bloqueio (2,5% de BSA em TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C.
   6. Adicionar o Ki-67 (diluição 1: 500) e a EGFP (diluição 1:500) Anticorpos simultaneamente e incubar a 37 ° C durante 1 h.
   7. Realizar a detecção fluorescente com anticorpos secundários apropriados antes da coloração com Hoechst (dados não mostrados) e de montagem com meio de montagem.
6. Observar a morfologia histológica dos tecidos na coloração seções 5 mícrons com hematoxilina e eosina (H & E) ^26. Para imagens fluorescentes, usar comprimentos de onda de emissão de 535, 646 e 700 para visualizar EGFP, Klf5 e Ki-67 coloração, respectivamente.

Resultados

A técnica de rolamento suíça em combinação com coloração imuno-histoquímica permite a análise abrangente do tecido intestinal pequeno ou grande. O exemplo de coloração de H & E de um intestino grosso de um C57BL / 6 de ratinho (Figura 1) é uma ilustração da exequibilidade e a eficácia desta técnica. Como mostrado na Figura 1, a imagem é capaz de capturar todas as porções do cólon: proximal, médio e distal. Assim, permite a avaliação ...

Discussão

A técnica de laminação Swiss é um método poderoso para a preparação de tecido intestinal para avaliação histológica e morfológica em grande escala. Em contraste com a técnica Swiss-laminagem anteriormente descrita, que foi originalmente desenvolvido para preparação de secções congeladas ^18,19, o processo aqui apresentado permite a preparação do tecido intestinal rápida e a fixação para a fixação de formalina e embebidos em parafina (FFPE). Em comparação com tecido congelado, o tecido FFPE tem muito maior vida...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kits de dissecação em aço inoxidável	VWR	25640-002
Câmara de desmontagem	Biocare Medical	DC2012
Seringa 10 ml	VWR	89215-218
de incorporação/processamento de tecidos com tampa	Simport	M515
Superfrost Plus Slides [tamanho: 25 x 75 x 1 mm]	VWR	48311-703
Conjunto de coloração manual	Tissue-Tek/Sakura	4451
Prato de coloração verde	Prato de coloração Tissue-Tek/Sakura	4456
Branco	Tissue-Tek/Sakura	4457
Suporte de slides de 24 slides com alça destacável
Microscópio de dissecação	Zeiss	Stemi 2000C
Microscópio de fluorescência	Nikon	Eclipse 90i	Luz brilhante e fluoerescente, com objetivas: 10X, 20X
Caneta PAP Bloqueador de Super-Líquido Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
Etanol 200 prova	AAPR	111000200
Metanol	VWR	BDH1135-4LP
Ácido acético glacial	AAPR	281000ACS
Xileno	Fisher Scientific	X5P-1GAL
Solução de peróxido de hidrogênio a 25% em água	ACROS	202465000
formalina buferizada a 10%	Fisher Scientific	22-026-213
Soro bovino fração V, choque térmico	Roche	3116956001
Tween 20	Sigma Aldrich	P7949
Citrato de sódio	Fisher Scientific	S279
Agulha de gavagem	VWR	20068-624
Anticorpo anti Klf5 de coelho	Santa Cruz Biotechnology	sc-22797	Diluição 1:150
Anticorpo anti-EGFP de frango	Diluição de AB16901 Millipore 1:500
Anticorpo	anti Ki67 de coelhoKit	de	Mach3 de diluição de CRM325B
	Jackson Labs	008875
Processador automatizado	Leica	Leica TP1020