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Artigo de método

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

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DOI:

10.3791/54167

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29 de agosto de 2016

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um novo modelo de fígado de camundongo humanizado gerado em camundongos knockout celular mediado por receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID após o transplante de células-tronco hepáticas humanas imaturas e expansíveis.

Resumo

Um novo modelo animal envolvendo camundongos quiméricos com fígados humanizados estabelecidos por meio de transplante de hepatócitos humanos foi desenvolvido. Esses camundongos, nos quais o fígado foi repovoado com hepatócitos humanos funcionais, podem servir como uma ferramenta útil para investigar a biologia das células hepáticas humanas, o metabolismo de drogas e outras aplicações pré-clínicas. Um dos principais fatores necessários para o transplante bem-sucedido de hepatócitos humanos em camundongos é a eliminação dos hepatócitos endógenos para evitar a competição com as células humanas e fornecer um espaço e microambiente adequados para promover a expansão e diferenciação de células de doadores humanos. Até o momento, dois modelos principais de camundongos com lesão hepática utilizando camundongos fumarilacetoacetato hidrolase (Fah) e ativador de uroplasminogênio (uPA) foram estabelecidos. No entanto, os camundongos Fah são usados principalmente com hepatócitos maduros e a aplicação do modelo uPA é limitada pela diminuição da reprodução. Para superar essas limitações, camundongos nocaute celular mediado por receptor de toxina alb (TRECK)/SCID foram usados para diferenciação in vivo de hepatócitos humanos imaturos e geração de fígado humanizado. As células-tronco hepáticas humanas (HpSCs) repovoaram com sucesso os fígados de camundongos Alb-TRECK / SCID que desenvolveram insuficiência hepática fulminante letal após o tratamento com toxina diftérica (DT). Este modelo de fígado humanizado em camundongos Alb-TRECK/SCID terá aplicações funcionais em estudos envolvendo metabolismo de drogas e interações medicamentosas e promoverá outros estudos in vivo e in vitro.

Introdução

Os camundongos são comumente usados para testes farmacêuticos, uma vez que a pesquisa biomédica em humanos é restrita1; no entanto, esses modelos nem sempre são úteis, pois podem simular de forma imprecisa os efeitos observados em humanos. A maioria dos medicamentos em uso médico atual é metabolizada principalmente no fígado. No entanto, a mesma droga pode ser metabolizada em diferentes metabólitos em fígados de camundongos e humanos devido a diferenças entre espécies. Assim, muitas vezes é difícil determinar durante o desenvolvimento se um medicamento potencial apresenta algum risco para aplicações clínicas2,3.

Para resolver esse problema, fígados de camundongos "humanizados" foram desenvolvidos pelo cultivo de células hepáticas humanas dentro de camundongos4-6; esses modelos exibem respostas a medicamentos semelhantes às observadas no fígado humano. Os principais modelos de camundongos atualmente usados para geração de fígado humanizado incluem camundongos ativadores de uroplasminogênio (uPA+/+)4,7, camundongos fumarilacetoacetato hidrolase (Fah−/−) 6 e os camundongos timidina quinase (TK-NOG) recentemente relatados.

No entanto, relatórios anteriores mostraram que células humanas imaturas transplantadas ou células-tronco são menos competitivas do que hepatócitos humanos adultos em fígados de camundongos Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)8-10. Além disso, os camundongos Fah−/− fornecem uma vantagem de crescimento apenas para hepatócitos diferenciados e não para células progenitoras hepáticas imaturas11. O transplante de células-tronco hepáticas humanas (HpSCs) em camundongos TK-NOG no laboratório não teve sucesso. Portanto, não existe atualmente nenhum modelo de camundongo útil para o enxerto eficiente de células hepáticas humanas imaturas.

Assim, desenvolvemos um novo modelo de camundongo Alb-TRECK/SCID que poderia ser repovoado de forma eficiente com hepatócitos humanos imaturos. Este modelo de camundongo transgênico expressa receptores de fator de crescimento semelhante a EGF de ligação à heparina humana (HB-EGF) sob o controle de um promotor de albumina específico para células hepáticas. Após a administração da toxina diftérica (TD), esses camundongos desenvolvem hepatite fulminante devido à ablação condicional dos hepatócitos, permitindo a residência e proliferação de células doadoras12. Embora os hepatócitos de camundongos tenham sido transplantados com sucesso em camundongos Alb-TRECK / SCID em estudos anteriores13,14, a geração de um fígado humanizado usando camundongos Alb-TRECK / SCID ainda não foi relatada.

Neste estudo, fígados humanizados foram gerados em camundongos Alb-TRECK/SCID via transplante de HpSCs. Este fígado humanizado fornece um ambiente in vivo para a diferenciação universal de células-tronco e a capacidade de prever padrões de metabolismo de drogas humanas e interações medicamentosas.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados de acordo com as Diretrizes de Proteção aos Animais de Yokohama City University.

1. geração do modelo Hepática Aguda Lesão Rato

  1. Adicionar 1 ml de solução de NaCl a 0,85% de fenol (0,6 g de fenol em 100 ml de solução de NaCl a 0,85%) para 1 mg de toxina da difteria (DT) para fazer um / ml de solução stock de 1 mg DT. Nota: DT a uma concentração de 1 mg / ml pode ser armazenado por cerca de 2 anos a 3 ° C e 8 ° C.
  2. Serialmente diluir a solução de 1 mg / ml da DT para 0,3 ug / mL em solução de DT fenol a 0,85% de NaCl e preparar-se uma alíquota da solução de DT / ml 0,3 ug como uma solução de trabalho. Nota: Esta solução de trabalho deve ser preparada.
  3. Para realizar experiências utilizando uma dose subletal (~ 50% de letalidade), administrar ratinhos de 8 semanas de idade, um / kg de dose de 1,5 ug de DT.
    1. Realizar uma injeção intraperitoneal de DT, mantendo o rato em decúbito dorsal e inserir o needle abaixo da curva dos joelhos, para a esquerda ou direita da linha média. Evitar a linha média para evitar a penetração da bexiga. Ângulo a agulha em aproximadamente 45 ° em relação ao corpo.
    2. Usando uma seringa de insulina, administrada a ratos com 100 uL de recém-preparados 0,3 ug / ml de DT por 20 g de peso do rato. Por exemplo, um 18-g rato deve recebem 90 ul da solução de DT / ml 0,3 ug.
  4. A 48 h após a injecção DT, recolha de sangue a partir da veia da cauda, ​​colocando o rato num limitador e o aquecimento da cauda do rato num banho de água a 37 ° C durante aproximadamente 10 min para dilatar os vasos sanguíneos. Em seguida, fazer uma de 1 mm do entalhe em cauda de 2 cm da ponta com um bisturi afiado da lâmina e recolher o sangue com um tubo microcapilar.
    1. Centrifuga-se o tubo microcapilar contendo o sangue a 1500 xg durante 5 minutos e recolher o soro, separando o sobrenadante e pelete de células.
  5. Pipeta 50 ul de 01:20 soro de ratinho diluído Onto GOT / AST-PIII desliza. Medir a absorvância do produto de reacção (corante azul) a 650 nm, utilizando um multi-usos analisador automático de química seca de acordo com o protocolo do fabricante.
    NOTA: A leitura de aspartato aminotransferase (AST) / atividade glutâmico transaminase oxalacética (GOT) é exibido automaticamente. 2 dias após a injecção de DT, cerca de 60% dos ratinhos exibiram valores de AST entre 12.000 - 16.000 UI / L e foram consideradas como sofrendo de lesão hepática aguda. Estes ratos foram transferidos para uma gaiola nova e utilizada como receptores de transplante de células.

2. Preparação de células-tronco hepáticas humanas

  1. Isolar células estaminais hepáticas humanas a partir de células fetais humanas primárias do fígado, com um classificador de células utilizando os antigénios de células CDCP1, CD90, e CD66 para obter uma subpopulação CDCP1 + CD90 + CD66-, em seguida, propagar a população de células isoladas em placas de cultura de colagénio IV-revestidas, como relatado anteriormente 15. Use células fetais humanas primárias do fígado de um embriãoidade entre as semanas 14 e 18.
  2. Recolher as células estaminais hepáticas humanas cultivadas para 80% - 90% de confluência em placas de cultura de 100 mm, aspirar o meio de cultura, lavar as células com 10 ml de PBS, e em seguida remover o PBS. Tripsinizar as células com solução de tripsina / EDTA a 2 ml de 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Nota: As células em mais do que 90% de confluência não são adequados para o transplante de células uma vez que a diferenciação das células pode influenciar a sua capacidade proliferativa em murganhos.
  3. Monitorizar o estado de dispersão de células sob um microscópio. Quando as células parecem ser flutuante ou fluindo livremente, parar a digestão enzimática por adição de 8 ml de DMEM / F12 contendo 10% de FBS.
  4. Suspender as células lentamente com uma pipeta serológica de 10 ml e transferência das células para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células durante 5 min a 100 xg e 4 ° C.
  5. Cuidadosamente ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM / F12 contendo 10% de FBS e determinar o número de células utilizando um microscópio de câmara de contagem.
  6. Dividir as células em 1,0 x 10 6 culas por 50 ul de PBS alíquotas para cada ratinho individual e armazenar em gelo até à transplantação.

3. interna do baço transplante de células-tronco hepáticas humanas

  1. Coloque uma gaiola limpa em uma temperatura de 37 ° C almofada de aquecimento elétrico.
  2. Anestesiar o rato usando isoflurano inalação (1 - 1,5% (vol / vol) em 2 L de oxigénio por minuto), colocando-o por debaixo do bocal. Como alternativa, use tubos contendo gaze embebida com isoflurano.
    1. Certifique-se de que o rato é anestesiado por beliscar levemente na pata traseira. Se um empurrão de joelho é provocada, coloque o mouse de volta na câmara. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
  3. Raspar o local da cirurgia usando cortadores elétricos e aplicar 70% (/ vol vol) de etanol e iodopovidona para esterilizar. Em seguida, fazer uma incisão na pele de 1 cm no flanco esquerdo, logo abaixo da borda costal das costelas, seguido por uma incisão naa parede abdominal, bem como o peritoneu.
  4. Cuidadosamente expor o baço. Utilize uma seringa microinjecção de 100 ul, com uma agulha de 32 G 1/2-inch de injectar directamente 1,0 x 10 6 células estaminais hepáticas humanas em 50 ul de PBS para o baço de cada rato. Inclinar a agulha com um ângulo de 5 ° para injecção.
    1. Assegure-se que a profundidade de injecção é menos do que metade da espessura do baço. A agulha deve entrar no baço em uma extremidade (cabeça) e depositar as células na outra extremidade (a cauda).
  5. Para evitar vazamento das células após a injeção, aplicar suavemente pressão usando um dedo por 2 min e em seguida, remover a agulha.
  6. Colocar o baço de volta para dentro do corpo do rato e fechar a cavidade com uma sutura contínua normal para a musculatura e da pele.
  7. Transferir os ratos em uma gaiola de 37 ° C pré-aquecido imediatamente após o transplante. Para garantir o mouse é capaz de respirar confortavelmente, coloque o mouse sobre o seu lado na gaiola, umanulando o contacto entre a cama gaiola e no local da cirurgia.
  8. Monitorar os ratos até que a anestesia desgasta fora para garantir as suturas permanecem fechados e os ratos regressar às condições-cirurgia pré.
  9. Assegurar a ratinhos são fornecidas com água de beber normal e comida. Depois de 1 hora, volte a gaiola para a sala de rato do centro do animal e monitorar os ratos diariamente.

4. Detecção de Transplanted hepática estaminais humanas hepatócitos derivados de células do fígado do rato

Nota: Para os seguintes procedimentos, todos os animais a eutanásia, usando uma overdose de cetamina e xilazina, seguido por deslocação cervical.

  1. Aos 4 - 6 semanas após o transplante, eutanásia os ratos e abrir a cavidade abdominal, cortando simultaneamente, a cútis e fáscia usando uma tesoura cirúrgica.
  2. Dissecar o tecido conjuntivo acima do peritônio, usando a tesoura como um difusor, e cortar o peritônio ao longo da linha alba para abrir o peritonealcavidade.
  3. Levante o esterno com uma pinça, perfurar o diafragma, e cortar cada lado do esterno-se através do cinto de colo do útero.
  4. Cortar a veia cava do lado torácica do fígado e puxar o esófago através do fígado na direcção anterior. Remover o diafragma, a fim de remover o fígado.
    Nota: Tenha cuidado para manter as pontas das tesouras apontou para cima, a fim de evitar qualquer dano aos órgãos torácicos embaixo. O timo tem uma tendência a agarrar-se ocasionalmente para o lado dorsal do esterno e isso deve ser evitado com cuidado.
  5. Usando o diafragma como uma pega, começam a puxar o fígado para fora da cavidade abdominal. A veia cava interior vai realizar o fígado no lugar. Corte o interior da veia cava; ter cuidado para não libertar prematuramente da adrenal direita.
    Nota: Os ratos têm um fígado de quatro lóbulos consistindo de um lobo médio, lobo esquerdo, lobo direito e do lobo caudado. A vesícula é suspenso na pequena bifurcaçãoo lobo mediano.
  6. Separa-se os lóbulos de cada outro nas junções e incorporá-los no composto óptima temperatura de corte (OCT), de acordo com o protocolo do fabricante. Congelar o OCT contendo o tecido do fígado nas grades de metal do criostato.
  7. Cortar secções de amostra de 5 um de espessura, utilizando um criostato a -18 ° C e montá-los em lâminas de microscópio RT. Armazenar o estoque a -80 ° C. Preparar as lâminas para hematoxilina e eosina (H & E) e imunofluorescência de acordo com os procedimentos relatados anteriormente 16.

5. Detecção de albumina humana e Secreção Cálculo da proteína quimérica Classificação

  1. Para medir a reconstituição de fígado humano, albumina humana realizar ELISA utilizando soro de albumina e um kit de ELISA humano de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Calcula-se a taxa de fígado quimérico humanizado por em tempo real A análise de PCR dos níveis de expressão no todo-o fígado humanizado. Determine o ex relativapression rácio nível de actina específicos de humano para cruz actina de ratinho-humano (razão 1) e a razão entre actina específica-rato a cruz actina de ratinho-humano (razão 2). A taxa quimérica é calculado como a relação 1 / (proporção de 1 +, entre 2).

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Resultados

Alb-TRECK / hepatócitos ratos SCID expressam o receptor DT gene HB-EGF humano sob o controlo de um promotor de albumina e exibem efeitos citotóxicos após a administração DT 12. Para avaliar os efeitos do tratamento sobre a lesão hepática DT, DT doses de 1,5 ug / kg foram injectadas em ratinhos SCID de 8 semanas de idade, Alb-TRECK / e as alterações patológicas no administração DT hr pós fígado 48 foram avaliados histologicamente. Em comparação com ratos de controlo (não tratad...

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Discussão

Estudos recentes têm mostrado que o fígado do rato podem ser repovoada com hepatócitos humanos, incluindo hepatócitos e células estaminais adultas hepáticas proliferativas 17. Estes repopulated fígados foram utilizados como modelos experimentais pré-clínicos para drogas de teste do metabolismo e da descoberta e desenvolvimento de medicamentos 18; Além disso, eles têm proporcionado um ambiente in vivo para a maturação e diferenciação celular 19. O principal objetivo do presente e...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Projeto de Genética de Mamíferos, Instituto Metropolitano de Ciências Médicas de Tóquio, por fornecer os camundongos. Também agradecemos a S. Aoyama e Y. Adachi do ADME (Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção) e Instituto de Pesquisa em Toxicologia, Sekisui Medical Company Ltd., Japão, e K. Kozakai e Y. Yamada pela assistência com a análise de LC-MS/MS. Este trabalho foi apoiado em parte por Grants-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão para YWZ (18591421, 20591531 e 23591872); pelo projeto inovador e empreendedor de Jiangsu para a introdução de talentos de alto nível e pelo projeto de planejamento científico e tecnológico de Jiangsu (BE2015669); e por doações à H.T. para Promoção Estratégica de Pesquisa e Desenvolvimento Inovadores (S-innovation, 62890004) da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina humanaSigmaA6684Camundongo
Humano CK19DakoM088801Rato
Núcleos humanosMilliporeMAB1281Rato
Humano CK8/18ProgenGP11Cobaia
CDCP1Biolegend324006Rato
CD90BD559869 Rato
CD66BD551479 Mouse
GOT/AST-PIIIFujifilm14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0.05% Tripsina-EDTA Gibco25300-054
Toxina DiftéricaSigmaD0564-1MG
Kit ELISA de Albumina HumanaBethyl LaboratoriesE88-129
Seringa (1 ml)TerumoSS-01T
32G 1/2" agulhaTSKPRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)Sakura Finetek Japão4583
Classificador de células de alta velocidade MoFloBeckman CoulterB25982
DRI-CHEM 7000Fujifilm14B2X10002000046

Referências

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