Desenvolvemos um método de lesão nervosa para examinar de forma confiável a reinervação muscular e, portanto, a regeneração das junções neuromusculares em camundongos. Esta técnica envolve a lesão do nervo fibular comum por meio de uma cirurgia simples e altamente reprodutível. A reinervação muscular é então avaliada pela montagem completa do músculo extensor longo dos dedos.
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Artigo de método
O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares
Neste artigo
Resumo
Resumo
A junção neuromuscular (MNJ) sofre alterações estruturais e funcionais deletérios, como resultado do envelhecimento, ferimentos e doenças. Assim, é imperativo compreender as alterações celulares e moleculares envolvidos na manutenção e reparação NMJs. Para esta finalidade, desenvolvemos um método fiável e consistente para examinar regenerar NMJs em ratinhos. Este método envolve a lesão do nervo esmagamento do nervo fibular comum, uma vez que passa por cima da cabeça lateral do tendão do músculo gastrocnêmio, perto do joelho. Usando ratos fêmeas mais velhas 70 dias, demonstramos que axônios motores começam a reinnervate metas pós-sinápticos anteriores no prazo de 7 dias após o esmagamento. Eles reocupar completamente suas áreas sinápticas anteriores por 12 dias. Para determinar a confiabilidade desse método de lesão, foram comparadas as taxas de reinervação entre camundongos fêmeas velhas 70 dias individuais. Verificou-se que o número de sítios pós-sinápticos reinervados foi semelhante entre os ratinhos em 7, 9, e 12 dias pós-esmagamento. Para determinar seeste ensaio de lesão também pode ser utilizado para comparar as alterações moleculares em músculos, que examinaram os níveis de gama-a subunidade do receptor nicotínico muscular (gama-AChR) e a quinase específica do músculo (almíscares). A subunidade gama-AChR e almíscar que são altamente regulada seguinte desnervação e retornar aos níveis normais após a reinervação dos NMJs. Encontramos uma relação estreita entre os níveis de transcrição para estes genes e status inervação dos músculos. Acreditamos que este método irá acelerar nossa compreensão das mudanças celulares e moleculares envolvidos na reparação do MNJ e outras sinapses.
Introdução
Em animais adultos jovens e saudáveis, a junção neuromuscular (NMJ) é uma conexão altamente estável entre a pré-sinapse, a terminação nervosa de um axônio α-motor, e a pós-sinapse, a região especializada de uma fibra muscular extrafusa, onde os receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRs) agregam seletivamente1. A aposição quase perfeita dos aparelhos pré e pós-sinápticos é necessária para a neurotransmissão adequada, sobrevivência dos neurônios α-motores e fibras musculares e função motora. Infelizmente, a função da JNM é afetada negativamente pelo envelhecimento, doenças como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doenças autoimunes e lesão dos músculos e nervos periféricos2-5. Esses insultos geralmente resultam na degeneração das terminações nervosas pré-sinápticas, deixando os músculos desnervados e alterando significativamente as habilidades motoras. Por esse motivo, a identificação de moléculas que funcionam para manter e reparar a JNM tornou-se uma prioridade. Como os nervos periféricos se regeneram e reinervam os alvos, os modelos de lesão de nervos periféricos têm sido usados para identificar alterações moleculares associadas à regeneração de NMJs.
Os modelos de lesão de nervos periféricos geralmente envolvem o corte ou esmagamento completo de ramos nervosos específicos6. Após um corte, o tubo endoneural deve ser reformado, atrasando a regeneração axonal e a reinervação das células-alvo e tecidos. A gravidade desse tipo de lesão também faz com que os axônios se afastem de seu caminho original, resultando em sua falha em atingir os alvos originais. Isso contrasta com os nervos lesionados por esmagamento, onde o endoneuro permanece contíguo, fornecendo um caminho para o crescimento eficiente e adequado dos axônios em regeneração. Também permite que os axônios encontrem e reinervam seus parceiros originais de fibras musculares. Independentemente do modelo de lesão, há uma série de alterações celulares e moleculares que devem ocorrer para que os axônios se regenerem e reinervam os alvos. Após uma lesão, o segmento nervoso proximal ao alvo é quebrado e removido por meio de um processo denominado Degeneração Walleriana7. Esse processo envolve a reprogramação e desdiferenciação das células de Schwann em células não mielinizantes que secretam fatores regenerativos, limpam a mielina e recrutam macrófagos para o local da lesão8. Os macrófagos, por sua vez, completam a depuração da mielina e dos detritos axonais, o que, de outra forma, impediria o crescimento do axônio9 em regeneração. Paralelamente, os neurônios motores e sensoriais ativam os mecanismos necessários para promover a regeneração de seus axônios cortados. Uma vez que o axônio regenerador atinge o alvo, ele deve se transformar de um cone de crescimento em uma terminação nervosa capaz de transmitir adequadamente (para axônios motores) ou receber (para axônios sensoriais) informações10. Nesse sentido, os axônios motores alfa sofrem uma série de mudanças bem orquestradas que culminam em seu cone de crescimento diferenciando-se em uma terminação nervosa pré-sináptica totalmente funcional que se opõe quase perfeitamente ao local pós-sináptico na fibra muscular alvo11.
Os nervos ciático, tibial e acessório têm sido as principais escolhas para o estudo da regeneração axonal e daJNM12-14. No entanto, há uma série de desvantagens ao usar esses modelos para examinar as alterações celulares e moleculares associadas à regeneração de NMJs entre animais e sob diferentes condições. Em primeiro lugar, o nervo ciático supre a maioria dos músculos do membro posterior, com lesões limitando significativamente o movimento e a sensação. Portanto, não é possível usar esse método para estudar o impacto do exercício sozinho ou em combinação com outros fatores. Além disso, o nervo ciático é uma estrutura bastante espessa e, portanto, requer uma grande quantidade de força compressiva para ferir totalmente todos os axônios. Isso, por sua vez, pode resultar na transecção completa dos axônios mais superficiais, deixando intacto o tubo endoneural dos axônios mais profundos, introduzindo variabilidade significativa na taxa e fidelidade de regeneração entre esses axônios. A transecção completa desse nervo é ainda menos desejável, pois muitos axônios não conseguirão se reconectar com as mesmas fibras musculares. Para complicar as coisas, o nervo ciático possui variabilidade anatômica intrínseca, tanto no número quanto no local de origem de seus ramos nervosos terminais. Portanto, é muito difícil lesionar o mesmo local. Embora o nervo tibial seja menor e mais passível de lesões por esmagamento, também não há um ponto de referência prontamente disponível para servir como local de lesão para esse ramo nervoso.
O ramo do nervo acessório (parte do nervo craniano XI) que supre o músculo esternocleidomastóideo também tem sido usado para estudar a regeneração dasJNMs15. Este nervo é particularmente atraente porque as JNMs no músculo esternocleidomastóideo podem ser mais facilmente visualizadas em animais vivos em comparação com as JNMs em outros músculos. Mas, semelhante aos nervos ciático e tibial, não há um ponto de referência específico que possa ser usado para lesar esse nervo no mesmo local, limitando-o como um modelo para comparar a regeneração de NMJs entre animais individuais de uma coorte experimental. Um local de lesão inconsistente introduz variabilidade nas taxas de reinervação da JNM. Devido a essas deficiências, o procedimento apresentado aqui utiliza a lesão de um ramo nervoso periférico diferente para examinar as JNMs em regeneração.
O nervo fibular comum, também chamado de nervo fibular comum, contém muitas características que o tornam um nervo confiável para examinar a regeneração de NMJs entre animais e em diferentes tratamentos. O nervo fibular comum tem um curso anatômico previsível à medida que passa sobre o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio no joelho, a intersecção servindo como um ponto de referência estável para lesões. O nervo é acessado através de uma incisão pequena e minimamente invasiva próxima, mas anatomicamente segregada dos músculos de interesse. Os resultados apresentados aqui demonstram que os axônios motores em regeneração começam a reformar as JNMs no músculo extensor longo dos dedos (EDL) 8 dias após o esmagamento do nervo fibular em camundongos fêmeas adultas jovens de 70 dias de idade. É importante ressaltar que o padrão e a taxa de reinervação são consistentes entre animais da mesma idade e sexo e, portanto, fornecem um modelo de lesão confiável que acelerará significativamente nossa compreensão das mudanças celulares e moleculares necessárias para manter e reparar as JNMs.
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados sob as diretrizes do NIH e protocolos de animais aprovados pela Comissão de Virginia Tech Institucional animal Cuidado e Uso.
1. Os animais que se preparam para Cirurgia
- Anestesiar ratos com uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) via injecção subcutânea inguinal com uma seringa de 1 ml estéril insulina. solução portadora contém uma mistura de solução salina a 0,9%, 17,4 mg / ml de cetamina e 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque animais de volta em gaiolas enquanto espera para a medicação fazer efeito.
NOTA: Se a dose de carga não proporcionar anestesia suficientes para a duração do processo, um adicional de 25% da dose de carga pode ser injectado. - animais do monitor após a injecção para verificar se há taxas respiratórias estáveis e depressão adequada dos níveis de excitação. Verifique o nível de excitação com uma pitada pata traseira, o que deve provocar nenhuma resposta quando suficientemente anestesiados.
NOTA: Isso normalmente leva 3-5min para um rato adulto jovem, com média de 25 a 30 g. Se o animal ainda é responsivo após a injecção de pós de 10 min, um adicional de 25% da dose de carga de anestésico pode ser injectado. - Aplicar vaselina e pomada oftálmica óleo mineral leve para os olhos do animal para evitar a secura. Remover animais de gaiola e coloque sobre uma superfície plana e limpa. Raspar o membro posterior desejado de pé para pelve, por um aparador de cabelo elétrico, expondo apenas o aspecto lateral do membro.
- Aplicar um removedor de cabelo química para o local raspada durante 1 min. remover manualmente o cabelo usando lenços de laboratório. Limpe a área depilada com o laboratório toalhete embebido em álcool.
2. Procedimento Cirúrgico
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos através de autoclave ou outro método adequado. Limpar o local da cirurgia e tábua cirúrgico com 80% de etanol / H 2 0. Desinfectar o local cirúrgico com proviodine. Coloque o mouse na placa cirúrgica e alinhar-se com as restrições dos membros. Guardao membro alvo traseira em uma posição anatomicamente natural com a articulação do joelho ligeiramente estendido sem rotação interna ou externa.
- Coloque o animal e tábua sob o microscópio cirúrgico. Orientar para o local da incisão adequada através da palpação dos marcos superficiais, especificamente a articulação do joelho ossudo eo cume entre o tibial anterior e gastrocnêmio.
- Fazer uma cerca de 3 cm da incisão através da pele utilizando um bisturi ou uma tesoura de mola enquanto estiver usando uma pinça gerais para emocionante. Fazer a incisão perpendicular ao curso subjacente do nervo fibular comum.
- Continue a incisão através da fáscia superficial, expondo o bíceps femoral e vasto lateral. Separar estes músculos cortando a fáscia profunda ligação. A 1-2 cm corte deve ser suficiente.
- Retrair o músculo bíceps femoral caudal com afastadores mecânicas, revelando o nervo fibular comum.
- Trace o nervo proximal até suas interseção com o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio é encontrado. Nota: A exposição pode requerer manipulação adicional da pele retraída e músculo. Esta intersecção é utilizado como o ponto de referência estável para a lesão do nervo.
- Segure o nervo com uma pinça fina, alinhando as pontas de uma forma paralela à borda lateral do tendão gastrocnêmio. Esmagar o nervo fibular comum, aplicando pressão constante, dura por 5 s.
- Corroboram queda completa do nervo por inspeção visual com o espaço cirúrgico. Ele aparece translúcido no local da lesão. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, a fluorescência irá desaparecer do local da lesão.
- Remover afastadores e realinhar os músculos em suas posições anatômicas. Feche o local da incisão com 6-0 seda. 1-3 suturas interrompidas simples é suficiente. Coloque recuperando do mouse sobre uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa.
- Monitorar todos os animais para 2 horas pós-óperação para verificar se há respiração e quaisquer reacções adversas à anestesia. Administrar uma dose inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg por via de injecção subcutânea inguinal imediatamente a seguir à recuperação da cirurgia. Dê 3 doses adicionais a cada 12 horas durante o próximo 48 horas. Após a recuperação completa, voltar ratos para a instalação de cuidados com os animais.
3. Isolamento e Coloração de extensor longo dos dedos músculos (EDL)
- Sacrificar animais com isoflurano. Pipetar 0,5 ml de isoflurano líquido para um tubo de 50 mL embalada com labwipes absorventes. Colocar o tubo destapado com o animal numa câmara selada 2,500 centímetros 3. Pelo menos 4 min de exposição é suficiente. Teste para perda de palpebral bilateral, toe-beliscão, e reflexos rabo-de aperto para garantir que cada animal está inconsciente antes de prosseguir com a perfusão.
- Transcardialmente perfundir 16 animais em primeiro lugar com 10 ml de 0,1 M de PBS, em seguida, 25 ml de 4% de paraformaldeído em 0,1 M de PBS (pH 7,4). Heparina (30 unidades / 20g de peso do animal), pode ser adicionado com o PBS (10 unidades / ml) para evitar a coagulação do sangue em pequenos capilares, melhorando os resultados de perfusão.
- Remover a pele que cobre os membros posteriores, utilizando uma tesoura para cortar transversalmente através da pele em torno da circunferência do abdómen. Descascar para baixo a pele após os membros e patas traseiras com a pinça.
- Remover fáscia superficial de membros posteriores, segurando e peeling com fórceps. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, pós-fix ratos toda a noite em 4% PFA em tubos de 50 ml. Lavar três vezes com PBS.
NOTA: Fixa ratinhos podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C. Se não, pule esta etapa e vá para a etapa 3.6, sem animais pós-fixação. - Dissecar músculos EDL 18 de rato membros traseiros, tendo a certeza de manter proximal e distal tendões tão intacto quanto possível.
- Incubar músculos EDL em tampão de bloqueio (PBS 1x contendo 0,5% de Triton X-100, BSA a 3% e soro de cabra a 5%) durante pelo menos 1 h.
- Para visualizar os axônios a motor e seus terminais nervosas, músculos lugar em tubos contendo neurofilamentos (1: 1000) e sinaptotagmina-2 (1: 250) anticorpos diluídos em tampão de bloqueio durante 3 dias. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. Nota: Ignore esta etapa se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes (XFP) em axônios periféricos.
- Manchar o contralateral ileso EDL como um controlo positivo para a inervação completa MNJ. Os controlos negativos devem incluir uma EDL obtido em 4 dias pós-ferimento, um ponto de tempo onde o JNM é completamente desnervado, bem como uma EDL coradas com anticorpo secundário única.
- Incubar músculos com anticorpos secundários marcados fluorescentemente apropriadas para detectar neurofilamento e sinaptotagmina-2 durante 1 dia. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. Nota: Este passo pode ser realizado juntamente com o passo 3.10. Pule esta etapa se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos.
- Para visualizar a postsynaptic região do MNJ, músculos incubar com 5 ug / mL de Alexa-555 conjugado alfa-bungarotoxina diluído em tampão de bloqueio durante, pelo menos, 2 h. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez.
- Para montar músculos inteiros em lâminas de vidro com carga positiva, coloque o músculo diretamente sobre o slide, adicionar algumas gotas de glicerol com base médio no slide de montagem e cobrir com uma lamela. Pressione a lamela contra o slide para achatar o músculo. Mergulhe off meios de montagem a partir do perímetro da lâmina e lamela usando lenços de laboratório. Aplique unha polonês para selar as arestas entre as lamelas e slide.
4. Imagem e Análise de Dados
- Para analisar a estrutura da NMJs, imagem do músculo EDL usando um microscópio confocal de varrimento laser equipado para excitar 488, 555 e 633 nm de luz e capturar a luz emitida com 20X e 40X objectivos.
- Para visualizar toda NMJs, criar imagens projeção de intensidade máxima de sec ópticações espaçadas de 1 a 2 mm que se estende para além do menor para o maior regiões visíveis do MNJ. Crie projeções de intensidade máxima, utilizando software de imagens disponível no mercado.
- Para determinar as taxas de reinervação, categorizar NMJs como: 1) completamente desnervado = sítio pós-sináptico é completamente desprovida de contacto com axônio, menos de 5% co-localização entre o axônio e AChRs. 2) parcialmente inervado = o axónio sobrepõe parcialmente o postsynapse, 5-95% de co-localização entre o axónio e AChRs. 3) inervação completa = cerca de aposição perfeita entre o pré e pós-sinapse, superior a 95% co-localização entre o axônio e AChRs. Excluir NMJs que se encontram perpendiculares ao plano de imagem, ou não são totalmente visualizadas na imagem. Nota: Em todas estas experiências, pelo menos, 3 animais e 50 NMJs por animal foram examinados. Os resultados foram considerados significativos usando um teste t de Student, com um valor P inferior a 0,05.
- Para cegar o operador, indivíduos separados pode executara análise de cirurgia e imagem. Sem o conhecimento dos grupos de tratamento, o analisador pode ser objectivo com JNM de pontuação. Alternativamente, as imagens podem ser aleatorizados e apresentados ao operador para análise sem o conhecimento do animal de origem.
5. Quantitative PCR
- Sacrificar animais utilizando isoflurano e deslocamento cervical. Retire a pele e fáscia superficial que cobre os músculos da perna de acordo com o passo 3.3. Dissecar tibial anterior e músculos EDL acordo com o passo 3.4.
- Flash congelar todo o tibial anterior e músculos EDL em um tubo de 1,5 ml sobre azoto líquido. Remover o tecido do tubo e colocar num almofariz pré-arrefecido parcialmente submerso em azoto líquido. Moer músculo congelado em um pó fino usando um almofariz e pilão.
- Dissolve-se pó de músculo congelado em um reagente de extracção de ARN comercialmente disponível e efectuar a extracção de ARN e a remoção de DNA genómico com um kit disponível comercialmente de acordo com I do fabricantenstructions.
- Realizar a transcrição reversa com uma transcriptase reversa mistura disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
- Execute qPCR utilizando um kit disponível comercialmente usando genes de limpeza adequados (ver tabela de materiais). Use um quantitativo termociclador PCR comercialmente disponível para realizar PCR (ver tabela de materiais).
- Ajuste temperatura de recozimento de 58 ° C. Ajustar os parâmetros de ciclismo adicionais às especificações do fabricante de Taq polimerase / SYBR mix verde. Incluir um passo final da curva de fusão do programa de termociclador consistindo de 0,5 ° C aumentos incrementais de 65 ° C a 95 ° C para testar a especificidade do iniciador e o iniciador a formação de dímeros.
- Determinar os níveis de expressão de ARNm relativa pelos 2 - Método ΔΔCT 21 utilizando 18S ARN como o gene de controlo.
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Resultados
O nervo fibular comum, também chamado o nervo fibular comum, surge a partir do nervo ciático acima da fossa poplítea, onde ele oscila ao redor da cabeça da fíbula ao aspecto anterior da perna (Figura 1A). Lá ramificações nos nervos fibulares superficial e profunda, em conjunto fornecendo os dorsiflexores do pé e dos dedos (tibial anterior, extensor longo dos dedos e brevis, e hálux músculos extensores longus), e os everters do pé (músculos fibulares). Este nervo também t...
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Discussão
O método apresentado neste manuscrito oferece oportunidades únicas para identificar mecanismos envolvidos na reparação de junções neuromusculares (JNM). Este método envolve o esmagamento do nervo fibular comum que passa sobre o tendão gastrocnêmio, perto do joelho. Mostramos que após apenas 5 segundos de compressão do nervo com um fórceps, degeneração completa é conhecida por 4 dias após a lesão. Em ratos adultos jovens, os axônios alfa-motoras começam a reinnervate sítios sinápticos anteriores no músculo extensor longo...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos membros do laboratório Valdez pela contribuição intelectual sobre os experimentos e comentários sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cetamina | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorfina | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Barbeador Elétrico | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH / H < sub>2< / sub>0 | |||
| 10% Proviodo | |||
| 1 ml Seringa | |||
| Insulina Tesoura de Mola | Bisturi Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Fórceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 sutura de seda em agulha de corte reverso | Sutura Express | 752B | |
| Almofada de Aquecimento para Roedores | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 Sondas Moleculares Alfa-BTX Conjugadas | B35451 | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Microscópio Estéreo Zoom Olympus | 562037192 | ||
| Microscópio Confocal Zeiss 700 Zeiss | |||
| Bomba de perfusão peristáltica de fluxo variável | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Pomada | VetPuralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 anticorpo | Anticorpos-Online | ABIN401605 | |
| Anticorpos anticorpo de neurofilamento-ABIN2475842 | online |
Referências
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Reimpressões e permissões
