O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares

Em animais adultos jovens e saudáveis, a junção neuromuscular (NMJ) é uma conexão altamente estável entre a pré-sinapse, a terminação nervosa de um axônio α-motor, e a pós-sinapse, a região especializada de uma fibra muscular extrafusa, onde os receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRs) agregam seletivamente¹. A aposição quase perfeita dos aparelhos pré e pós-sinápticos é necessária para a neurotransmissão adequada, sobrevivência dos neurônios α-motores e fibras musculares e função motora. Infelizmente, a função da JNM é afetada negativamente pelo envelhecimento, doenças como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doenças autoimunes e lesão dos músculos e nervos periféricos^2-5. Esses insultos geralmente resultam na degeneração das terminações nervosas pré-sinápticas, deixando os músculos desnervados e alterando significativamente as habilidades motoras. Por esse motivo, a identificação de moléculas que funcionam para manter e reparar a JNM tornou-se uma prioridade. Como os nervos periféricos se regeneram e reinervam os alvos, os modelos de lesão de nervos periféricos têm sido usados para identificar alterações moleculares associadas à regeneração de NMJs.

Os modelos de lesão de nervos periféricos geralmente envolvem o corte ou esmagamento completo de ramos nervosos específicos⁶. Após um corte, o tubo endoneural deve ser reformado, atrasando a regeneração axonal e a reinervação das células-alvo e tecidos. A gravidade desse tipo de lesão também faz com que os axônios se afastem de seu caminho original, resultando em sua falha em atingir os alvos originais. Isso contrasta com os nervos lesionados por esmagamento, onde o endoneuro permanece contíguo, fornecendo um caminho para o crescimento eficiente e adequado dos axônios em regeneração. Também permite que os axônios encontrem e reinervam seus parceiros originais de fibras musculares. Independentemente do modelo de lesão, há uma série de alterações celulares e moleculares que devem ocorrer para que os axônios se regenerem e reinervam os alvos. Após uma lesão, o segmento nervoso proximal ao alvo é quebrado e removido por meio de um processo denominado Degeneração Walleriana⁷. Esse processo envolve a reprogramação e desdiferenciação das células de Schwann em células não mielinizantes que secretam fatores regenerativos, limpam a mielina e recrutam macrófagos para o local da lesão⁸. Os macrófagos, por sua vez, completam a depuração da mielina e dos detritos axonais, o que, de outra forma, impediria o crescimento do axônio⁹ em regeneração. Paralelamente, os neurônios motores e sensoriais ativam os mecanismos necessários para promover a regeneração de seus axônios cortados. Uma vez que o axônio regenerador atinge o alvo, ele deve se transformar de um cone de crescimento em uma terminação nervosa capaz de transmitir adequadamente (para axônios motores) ou receber (para axônios sensoriais) informações¹⁰. Nesse sentido, os axônios motores alfa sofrem uma série de mudanças bem orquestradas que culminam em seu cone de crescimento diferenciando-se em uma terminação nervosa pré-sináptica totalmente funcional que se opõe quase perfeitamente ao local pós-sináptico na fibra muscular alvo¹¹.

Os nervos ciático, tibial e acessório têm sido as principais escolhas para o estudo da regeneração axonal e da^JNM12-14. No entanto, há uma série de desvantagens ao usar esses modelos para examinar as alterações celulares e moleculares associadas à regeneração de NMJs entre animais e sob diferentes condições. Em primeiro lugar, o nervo ciático supre a maioria dos músculos do membro posterior, com lesões limitando significativamente o movimento e a sensação. Portanto, não é possível usar esse método para estudar o impacto do exercício sozinho ou em combinação com outros fatores. Além disso, o nervo ciático é uma estrutura bastante espessa e, portanto, requer uma grande quantidade de força compressiva para ferir totalmente todos os axônios. Isso, por sua vez, pode resultar na transecção completa dos axônios mais superficiais, deixando intacto o tubo endoneural dos axônios mais profundos, introduzindo variabilidade significativa na taxa e fidelidade de regeneração entre esses axônios. A transecção completa desse nervo é ainda menos desejável, pois muitos axônios não conseguirão se reconectar com as mesmas fibras musculares. Para complicar as coisas, o nervo ciático possui variabilidade anatômica intrínseca, tanto no número quanto no local de origem de seus ramos nervosos terminais. Portanto, é muito difícil lesionar o mesmo local. Embora o nervo tibial seja menor e mais passível de lesões por esmagamento, também não há um ponto de referência prontamente disponível para servir como local de lesão para esse ramo nervoso.

O ramo do nervo acessório (parte do nervo craniano XI) que supre o músculo esternocleidomastóideo também tem sido usado para estudar a regeneração das^JNMs15. Este nervo é particularmente atraente porque as JNMs no músculo esternocleidomastóideo podem ser mais facilmente visualizadas em animais vivos em comparação com as JNMs em outros músculos. Mas, semelhante aos nervos ciático e tibial, não há um ponto de referência específico que possa ser usado para lesar esse nervo no mesmo local, limitando-o como um modelo para comparar a regeneração de NMJs entre animais individuais de uma coorte experimental. Um local de lesão inconsistente introduz variabilidade nas taxas de reinervação da JNM. Devido a essas deficiências, o procedimento apresentado aqui utiliza a lesão de um ramo nervoso periférico diferente para examinar as JNMs em regeneração.

O nervo fibular comum, também chamado de nervo fibular comum, contém muitas características que o tornam um nervo confiável para examinar a regeneração de NMJs entre animais e em diferentes tratamentos. O nervo fibular comum tem um curso anatômico previsível à medida que passa sobre o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio no joelho, a intersecção servindo como um ponto de referência estável para lesões. O nervo é acessado através de uma incisão pequena e minimamente invasiva próxima, mas anatomicamente segregada dos músculos de interesse. Os resultados apresentados aqui demonstram que os axônios motores em regeneração começam a reformar as JNMs no músculo extensor longo dos dedos (EDL) 8 dias após o esmagamento do nervo fibular em camundongos fêmeas adultas jovens de 70 dias de idade. É importante ressaltar que o padrão e a taxa de reinervação são consistentes entre animais da mesma idade e sexo e, portanto, fornecem um modelo de lesão confiável que acelerará significativamente nossa compreensão das mudanças celulares e moleculares necessárias para manter e reparar as JNMs.

Todos os experimentos foram realizados sob as diretrizes do NIH e protocolos de animais aprovados pela Comissão de Virginia Tech Institucional animal Cuidado e Uso.

1. Os animais que se preparam para Cirurgia

1. Anestesiar ratos com uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) via injecção subcutânea inguinal com uma seringa de 1 ml estéril insulina. solução portadora contém uma mistura de solução salina a 0,9%, 17,4 mg / ml de cetamina e 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque animais de volta em gaiolas enquanto espera para a medicação fazer efeito.
   NOTA: Se a dose de carga não proporcionar anestesia suficientes para a duração do processo, um adicional de 25% da dose de carga pode ser injectado.
2. animais do monitor após a injecção para verificar se há taxas respiratórias estáveis ​​e depressão adequada dos níveis de excitação. Verifique o nível de excitação com uma pitada pata traseira, o que deve provocar nenhuma resposta quando suficientemente anestesiados.
   NOTA: Isso normalmente leva 3-5min para um rato adulto jovem, com média de 25 a 30 g. Se o animal ainda é responsivo após a injecção de pós de 10 min, um adicional de 25% da dose de carga de anestésico pode ser injectado.
3. Aplicar vaselina e pomada oftálmica óleo mineral leve para os olhos do animal para evitar a secura. Remover animais de gaiola e coloque sobre uma superfície plana e limpa. Raspar o membro posterior desejado de pé para pelve, por um aparador de cabelo elétrico, expondo apenas o aspecto lateral do membro.
4. Aplicar um removedor de cabelo química para o local raspada durante 1 min. remover manualmente o cabelo usando lenços de laboratório. Limpe a área depilada com o laboratório toalhete embebido em álcool.

2. Procedimento Cirúrgico

1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos através de autoclave ou outro método adequado. Limpar o local da cirurgia e tábua cirúrgico com 80% de etanol / H ₂ 0. Desinfectar o local cirúrgico com proviodine. Coloque o mouse na placa cirúrgica e alinhar-se com as restrições dos membros. Guardao membro alvo traseira em uma posição anatomicamente natural com a articulação do joelho ligeiramente estendido sem rotação interna ou externa.
2. Coloque o animal e tábua sob o microscópio cirúrgico. Orientar para o local da incisão adequada através da palpação dos marcos superficiais, especificamente a articulação do joelho ossudo eo cume entre o tibial anterior e gastrocnêmio.
3. Fazer uma cerca de 3 cm da incisão através da pele utilizando um bisturi ou uma tesoura de mola enquanto estiver usando uma pinça gerais para emocionante. Fazer a incisão perpendicular ao curso subjacente do nervo fibular comum.
4. Continue a incisão através da fáscia superficial, expondo o bíceps femoral e vasto lateral. Separar estes músculos cortando a fáscia profunda ligação. A 1-2 cm corte deve ser suficiente.
5. Retrair o músculo bíceps femoral caudal com afastadores mecânicas, revelando o nervo fibular comum.
6. Trace o nervo proximal até suas interseção com o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio é encontrado. Nota: A exposição pode requerer manipulação adicional da pele retraída e músculo. Esta intersecção é utilizado como o ponto de referência estável para a lesão do nervo.
7. Segure o nervo com uma pinça fina, alinhando as pontas de uma forma paralela à borda lateral do tendão gastrocnêmio. Esmagar o nervo fibular comum, aplicando pressão constante, dura por 5 s.
8. Corroboram queda completa do nervo por inspeção visual com o espaço cirúrgico. Ele aparece translúcido no local da lesão. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, a fluorescência irá desaparecer do local da lesão.
9. Remover afastadores e realinhar os músculos em suas posições anatômicas. Feche o local da incisão com 6-0 seda. 1-3 suturas interrompidas simples é suficiente. Coloque recuperando do mouse sobre uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa.
10. Monitorar todos os animais para 2 horas pós-óperação para verificar se há respiração e quaisquer reacções adversas à anestesia. Administrar uma dose inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg por via de injecção subcutânea inguinal imediatamente a seguir à recuperação da cirurgia. Dê 3 doses adicionais a cada 12 horas durante o próximo 48 horas. Após a recuperação completa, voltar ratos para a instalação de cuidados com os animais.

3. Isolamento e Coloração de extensor longo dos dedos músculos (EDL)

1. Sacrificar animais com isoflurano. Pipetar 0,5 ml de isoflurano líquido para um tubo de 50 mL embalada com labwipes absorventes. Colocar o tubo destapado com o animal numa câmara selada 2,500 centímetros ^3. Pelo menos 4 min de exposição é suficiente. Teste para perda de palpebral bilateral, toe-beliscão, e reflexos rabo-de aperto para garantir que cada animal está inconsciente antes de prosseguir com a perfusão.
2. Transcardialmente perfundir ¹⁶ animais em primeiro lugar com 10 ml de 0,1 M de PBS, em seguida, 25 ml de 4% de paraformaldeído em 0,1 M de PBS (pH 7,4). Heparina (30 unidades / 20g de peso do animal), pode ser adicionado com o PBS (10 unidades / ml) para evitar a coagulação do sangue em pequenos capilares, melhorando os resultados de perfusão.
3. Remover a pele que cobre os membros posteriores, utilizando uma tesoura para cortar transversalmente através da pele em torno da circunferência do abdómen. Descascar para baixo a pele após os membros e patas traseiras com a pinça.
4. Remover fáscia superficial de membros posteriores, segurando e peeling com fórceps. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, pós-fix ratos toda a noite em 4% PFA em tubos de 50 ml. Lavar três vezes com PBS.
   NOTA: Fixa ratinhos podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C. Se não, pule esta etapa e vá para a etapa 3.6, sem animais pós-fixação.
5. Dissecar músculos EDL ¹⁸ de rato membros traseiros, tendo a certeza de manter proximal e distal tendões tão intacto quanto possível.
6. Incubar músculos EDL em tampão de bloqueio (PBS 1x contendo 0,5% de Triton X-100, BSA a 3% e soro de cabra a 5%) durante pelo menos 1 h.
7. Manchar o contralateral ileso EDL como um controlo positivo para a inervação completa MNJ. Os controlos negativos devem incluir uma EDL obtido em 4 dias pós-ferimento, um ponto de tempo onde o JNM é completamente desnervado, bem como uma EDL coradas com anticorpo secundário única.
8. Incubar músculos com anticorpos secundários marcados fluorescentemente apropriadas para detectar neurofilamento e sinaptotagmina-2 durante 1 dia. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. Nota: Este passo pode ser realizado juntamente com o passo 3.10. Pule esta etapa se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos.
9. Para visualizar a postsynaptic região do MNJ, músculos incubar com 5 ug / mL de Alexa-555 conjugado alfa-bungarotoxina diluído em tampão de bloqueio durante, pelo menos, 2 h. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez.
10. Para montar músculos inteiros em lâminas de vidro com carga positiva, coloque o músculo diretamente sobre o slide, adicionar algumas gotas de glicerol com base médio no slide de montagem e cobrir com uma lamela. Pressione a lamela contra o slide para achatar o músculo. Mergulhe off meios de montagem a partir do perímetro da lâmina e lamela usando lenços de laboratório. Aplique unha polonês para selar as arestas entre as lamelas e slide.

4. Imagem e Análise de Dados

1. Para analisar a estrutura da NMJs, imagem do músculo EDL usando um microscópio confocal de varrimento laser equipado para excitar 488, 555 e 633 nm de luz e capturar a luz emitida com 20X e 40X objectivos.
2. Para visualizar toda NMJs, criar imagens projeção de intensidade máxima de sec ópticações espaçadas de 1 a 2 mm que se estende para além do menor para o maior regiões visíveis do MNJ. Crie projeções de intensidade máxima, utilizando software de imagens disponível no mercado.
3. Para determinar as taxas de reinervação, categorizar NMJs como: 1) completamente desnervado = sítio pós-sináptico é completamente desprovida de contacto com axônio, menos de 5% co-localização entre o axônio e AChRs. 2) parcialmente inervado = o axónio sobrepõe parcialmente o postsynapse, 5-95% de co-localização entre o axónio e AChRs. 3) inervação completa = cerca de aposição perfeita entre o pré e pós-sinapse, superior a 95% co-localização entre o axônio e AChRs. Excluir NMJs que se encontram perpendiculares ao plano de imagem, ou não são totalmente visualizadas na imagem. Nota: Em todas estas experiências, pelo menos, 3 animais e 50 NMJs por animal foram examinados. Os resultados foram considerados significativos usando um teste t de Student, com um valor P inferior a 0,05.
4. Para cegar o operador, indivíduos separados pode executara análise de cirurgia e imagem. Sem o conhecimento dos grupos de tratamento, o analisador pode ser objectivo com JNM de pontuação. Alternativamente, as imagens podem ser aleatorizados e apresentados ao operador para análise sem o conhecimento do animal de origem.

5. Quantitative PCR

1. Sacrificar animais utilizando isoflurano e deslocamento cervical. Retire a pele e fáscia superficial que cobre os músculos da perna de acordo com o passo 3.3. Dissecar tibial anterior e músculos EDL acordo com o passo 3.4.
2. Flash congelar todo o tibial anterior e músculos EDL em um tubo de 1,5 ml sobre azoto líquido. Remover o tecido do tubo e colocar num almofariz pré-arrefecido parcialmente submerso em azoto líquido. Moer músculo congelado em um pó fino usando um almofariz e pilão.
3. Dissolve-se pó de músculo congelado em um reagente de extracção de ARN comercialmente disponível e efectuar a extracção de ARN e a remoção de DNA genómico com um kit disponível comercialmente de acordo com I do fabricantenstructions.
4. Realizar a transcrição reversa com uma transcriptase reversa mistura disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
5. Execute qPCR utilizando um kit disponível comercialmente usando genes de limpeza adequados (ver tabela de materiais). Use um quantitativo termociclador PCR comercialmente disponível para realizar PCR (ver tabela de materiais).
6. Ajuste temperatura de recozimento de 58 ° C. Ajustar os parâmetros de ciclismo adicionais às especificações do fabricante de Taq polimerase / SYBR mix verde. Incluir um passo final da curva de fusão do programa de termociclador consistindo de 0,5 ° C aumentos incrementais de 65 ° C a 95 ° C para testar a especificidade do iniciador e o iniciador a formação de dímeros.
7. Determinar os níveis de expressão de ARNm relativa pelos 2 ^- Método ^{ΔΔCT 21} utilizando 18S ARN como o gene de controlo.

O nervo fibular comum, também chamado o nervo fibular comum, surge a partir do nervo ciático acima da fossa poplítea, onde ele oscila ao redor da cabeça da fíbula ao aspecto anterior da perna (Figura 1A). Lá ramificações nos nervos fibulares superficial e profunda, em conjunto fornecendo os dorsiflexores do pé e dos dedos (tibial anterior, extensor longo dos dedos e brevis, e hálux músculos extensores longus), e os everters do pé (músculos fibulares). Este nervo também transporta fibras sensoriais que se projectam para o dorso do pé e face lateral da parte inferior da perna. É uma estrutura relativamente fina composta por motor e axónios sensoriais. Este ramo do nervo segue um curso anatômica previsível. Lateral para o joelho, o nervo é mais superficial como ele é executado sobre o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio (Figura 1 e Figura 2). ºé a localização serve como um ponto de referência estável que pode ser facilmente alcançado com uma pequena incisão, limitando os danos para a pele e fáscia (Figura 1A). O diâmetro menor do nervo, quando comparado com o nervos ciático e tibial, faz com que seja possível para esmagar todos os axônios usando menos força, reduzindo a probabilidade de separar completamente os axónios mais superficiais.

Camundongos que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) apenas em neurônios 17 foram usadas para otimizar o processo de esmagamento no nervo fibular comum e sem ambiguidade visualizar os axônios em regeneração. O nervo foi esmagado na borda do tendão do gastrocnémio mais proximal para os músculos do alvo porque neste sítio são mais acessíveis a partir do local da incisão. Este local também serve como um ponto de referência anatómica fiável, tornando-se possível comparar a regeneração de NMJs entre animais da mesma idade e sexo. Comprimindo o nervo durante 5 segundos usando uma pinça fina resÜLTS no desaparecimento de YFP a partir do local da lesão (Figura 2B). No entanto, o tecido conjuntivo e células que residem no perineuro permanecem contíguo, servindo como uma conduta para regeneração rápida e precisa dos axónios para os seus objectivos originais (Figura 2B). Em camundongos fêmeas de 70 dias de idade, esta lesão é suficiente para causar a degeneração de todos os segmentos axonal distais da soma neuronal (Figura 4B).

Para determinar a confiabilidade e reprodutibilidade deste método lesão, foi examinado reinervação do músculo extensor longo dos dedos (EDL). Este músculo foi escolhido por várias razões: 1) É proximal ainda fisicamente separados dos sítios de lesão de nervos e de incisão (Figura 3A). Assim, o músculo só podem ser alterados por degeneração de axónios inervação cortadas. Sua proximidade com o local do esmagamento minimiza o tempo necessário para que possa ser reinervadas e atroph musculary. 2) Ele é composto principalmente de tipo rápido fibras musculares esqueléticas, que são mais suscetíveis ao envelhecimento e doenças. 3) Seus NMJs sofrer alterações estruturais significativas durante a progressão de doenças e envelhecimento que pode ser atenuada por exercício e restrição calórica. 4) É de fácil acesso para imagens ao vivo e manipulação molecular (Figura 3D). 5) Pode ser facilmente separado nos seus quatro componentes falangeais que pode ser todo montado tornando-se possível totalmente imagem de todos os seus axónios inervação e suas conexões usando microscopia de luz (Figura 3B).

Reinervação dos previamente desocupado locais pós-sinápticos após o esmagamento do nervo fibular na perna direita foi avaliada em três ratos fêmeas 70 dias de idade que expressam YFP em axônios motores. locais pós-sinápticas foram visualizadas utilizando fluorescente etiquetado alfa-bungarotoxina (BTX), que se liga selectivamente e com elevada afinidade para os músculos nACHRS. Músculos foram consideradas ser desnervado, parcial ou totalmente reinervadas seguindo estes critérios: 1) No caso das fibras do músculo desnervado, axônios motores estavam completamente ausentes dos locais pós-sinápticos e menos de 5% co-localização entre o axônio e foi observado AChRs. 2) fibras musculares parcialmente inervados foram categorizados por alguns, mas aposição incompleta de axônios motores com locais pós-sinápticos e 5-95% co-localização entre o axônio e foi observado AChRs. 3) No caso das fibras musculares totalmente inervados, houve aposição quase perfeita entre as terminações nervosas motoras e locais de pós-sinápticos e maior do que 95% de co-localização entre o axónio e foi observada AChRs. NMJs individuais foram excluídas da contagem de se estabelecer as suas placas terminais perpendicular ao plano de imagem ou toda a JNM não foi visualizado. Utilizando estes critérios, foi observada alta concordância na tarifa e grau de reinervação entre todos os ratos examinados. Aos 4 dias pós-esmagamento, os músculos foram encontrados totalmente desnervado em todos os animais examinado (Figura 4B). Esta descoberta mostra que o esmagamento do nervo fibular comum por 5 s, como descrito acima, é suficiente para romper todos os axônios. Por 7 dias pós-esmagamento, terminações nervosas estavam no processo de reocupar locais pós-sinápticos previamente desocupado (Figura 4C, 4E-F). No entanto, a maioria das fibras musculares foram ainda encontradas apenas parcialmente inervados. Com dias adicionais de pós-esmagamento, terminações nervosas continuou a se diferenciar em sites e NMJs pré-sinápticos foram encontrados totalmente reinervados por 12 dias (Figura 4D, 4E-F). Importante, houve pouca variabilidade entre ratos desnervados para o mesmo período de tempo (Figura 4E-F), demonstrando que o esmagamento do nervo fibular pode ser utilizado como um ensaio para comparar reinervação dos músculos entre animais da mesma idade e sexo.

A capacidade de comparar fielmente NMJs regeneração entre os animais oferece oportunidadespara entender as características celulares associados com cada passo necessário para reparar completamente este sinapse. Para examinar a arquitetura do NMJs desnervados e regeneração obtidos com ratos de idade de 70 dias usado anteriormente para comparar as taxas de reinervação, foram obtidas imagens de alta resolução de microscopia confocal de NMJs. Como esperado, esta análise revelou uma série de mudanças que ocorrem no α-motoras terminações nervosas do axônio como eles reinnervate fibras musculares (Figura 4G-I). Cones crescimento axonal aparecem para expandir e começar a ramificar-se como eles entrar em contato com sites de pós-sináptico (Figura 4G). Estes ramos axonais depois crescer em regiões específicas do postsynapse, culminando no próximo justaposição completa do nervo axon terminando com o site pós-sináptica (Figura 4H-I). características estruturais adicionais na regeneração de terminações nervosas motor que muito se assemelham aos encontrados durante o desenvolvimento foram observadas, incluindo vários axônios concorrentes para o s-alvo ame (Figura 4H), culminando com apenas um axônio que inervam uma fibra muscular por 12 dias pós-esmagamento. Além disso, ramos axonais que se estendem além dos sites pós-sinápticos, referido aqui como brotos, em todas as fases pós-lesão foram observados (Figura 4I). Esses brotos foram altamente prevalentes, mesmo em NMJs totalmente inervados sugerindo que a fase final de reparação axonal envolve retração de ramos axonais extrajuncional. Apesar destas mudanças óbvias em terminações nervosas, locais pós-sinápticos permaneceu praticamente indistinguíveis em todas as fases pós-lesão em comparação com aqueles nos músculos lesionados, incluindo a 4 dias após o esmagamento quando as fibras musculares são encontrados totalmente desnervado. Não havia nenhum sinal óbvio de fragmentação ou perda significativa e redistribuição para as regiões extra-sinápticos de AChRs. Estes resultados indicam fortemente que o método fibular esmagamento do nervo pode ser utilizado como um ensaio para identificar e testar agentes moleculares, farmacológicos e de estilo de vida tchapéu de promover a reparação de terminações nervosas nas sinapses, incluindo o MNJ.

Apesar dos avanços recentes, muito pouco progresso tem sido feito na identificação dos fatores derivadas de músculos necessários e suficientes para manter e reparar o MNJ. Por isso, perguntou se o método de lesão do nervo fibular comum pode ser usado para identificar moléculas alteradas em fases específicas do processo de reinervação e com potenciais papéis na reparação do MNJ. Como prova do capital, a análise dos dois genes associados JNM-expressão, a subunidade gama AChR e a quinase específicos do músculo, almíscar 18 foi executada. Tal como demonstrado por PCR quantitativo, estes genes são aumentadas seguinte desnervação e diminuiu à medida que são NMJs reinervadas (figura 5a-b). Estes genes são regulados positivamente em 4 dias pós-esmagamento, conforme relatado anteriormente usando os músculos completamente desnervados 19. Como fibras musculares reinnervate nervos, os níveis destes genes e diminuir rapiDivina retornar à linha de base. Entre os animais examinados, o padrão de expressão de ambos os genes é quase idêntica, o que demonstra uma correlação estreita entre as alterações celulares e moleculares na NMJs regeneração. Por conseguinte, este método proporciona oportunidades únicas para identificar alterações moleculares associados a diferentes estágios de MNJ regeneração.

Figura 1:. Fibular comum anatomia do nervo (A) Representação esquemática detalhando o curso do nervo ciático e seus ramos terminais em relação a pontos de referência superficiais e ósseas. SCN = nervo ciático, TN = Tibial Nerve, SRN = nervo sural, CPN = fibular comum do nervo, SPN = Superficial fíbula, nervo DPN = profunda fíbula. O local da incisão desejado está indicado. (B) Diagrama do local comum nervo fibular em relação aos músculos que rodeiam com a pele removida.local da incisão relativo é mostrado que cobre o fascia investir. TA = tibial EDL Anterior Muscle = Extensor longo dos dedos do músculo. (C) ciático exposto e nervo fibular comum. PCN atravessa ao longo do tendão do músculo gastrocnémio (Gn) ao nível do joelho. Local do esmagamento em relação ao tendão mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. Esmagamento do nervo fibular comum Cirurgia (A) A incisão inicial precisa ser apenas alguns centímetros de comprimento. Depois de penetrar através da pele e fáscia superficial, a incisão deve ser prosseguido através do investimento fascia / profunda situada entre os bíceps femoral e músculos TA. (A1) O nervo fibular comum é facilmente visualizado sem microscopia through a incisão (Gn = músculo gastrocnêmio). (A2) A intersecção do nervo e músculo gastrocnêmio tendão fibular comum pode ser facilmente visualizado se a incisão é alargada (necessária apenas para fins fotográficos). O esmagamento deve ser colocado na posição marcada pela linha vermelha perpendicular ao nervo e paralela ao tendão Gn. (B) O CPN é ainda mais facilmente visualizadas com camundongos transgênicos YFP sob um escopo de dissecação fluorescente. (B1) O nervo perde fluorescência no local de esmagamento, permitindo a confirmação de uma lesão por esmagamento completo. (B2) Uma queda CPN completo ainda pode ser visualizado com a iluminação dos olhos e quarto nu. O nervo vai tornar translúcida. Esta imagem destaca o fato de que o epineuro e superestrutura do CPN permanecem intactos, limitando simultaneamente danos aos tecidos e vasos sanguíneos próximos.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:. Anatomia do músculo extensor longo dos dedos (EDL) (A) 3 uma imagem bidimensional do EDL em relação aos ossos do membro posterior do rato. Gerado usando JAtlasView (B) Parcialmente dissecados músculo EDL separados em suas quatro divisões falanges e marcação dos dígitos controladas por cada divisão. (C) YFP rotulados ramo do nervo fibular profundo, uma vez que inerva o band-placa final da divisão EDL controlar o segundo dígito. (D) ramos axonal e seus sites de contato podem ser facilmente identificados, permitindo a análise consistente de NMJs selecionados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f.

Figura 4: taxas semelhantes de reinervação entre animais da mesma idade e sexo Análise de NMJs no músculo EDL após esmagamento do nervo fibular.. Locais (A) pós-sinápticos estão completamente ocupadas por axônios em ratos lesionados. (B) a 4 dias após o esmagamento, os músculos são encontrados totalmente desnervado. (C) Os axônios começar a reinnervate músculos 7 dias pós-queda e (D) completamente reocupar locais pós-sinápticos por 12 dias. (E - F) A taxa de MNJ re-ocupação é quase indistinguível entre animais desnervado para o mesmo período de tempo. (G - I) Imagens representativas de terminações nervosas axonal diferenciação re-em locais pré-sinápticos amadurecidas. Reocupação de locais pós-sinápticos segue umpadrão previsível, começando com o cone de crescimento o desenvolvimento de ramos que ocupam, eventualmente, completamente sem locais pós-sinápticos que se estende para além do MNJ region.Similar para o desenvolvimento, sítios pós-sinápticos são inicialmente inervado por múltiplos axónios em crescimento re-mas apenas um axónio permanece uma vez que o MNJ foi completamente regenerada. (H) Exemplos de axônios exuberante, inervação parcial sem completa sobreposição entre pré e pós-sinápticos aparelhos, e inervação por vários axônios indicados. 70 ratos fêmeas dias de idade foram examinados; Barra de escala = 50 uM (AD), de 20 um (GI). barra de erro = SEM. N = 3 ratos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O nervo fibular Esmagar Método como umn ensaio para identificar genes candidatos envolvidos na reparação do MNJ (A - B). O nível de mRNA de dois genes JNM-associados, a subunidade gama AChR e almíscar, são igualmente alterados no músculo TA de ratos desnervado para o mesmo período de tempo . Com o aumento da lesão pós nervo tempo, níveis de ambas as transcrições diminuir, retornando à linha de base, corroborando análise histológica mostrando reinervação progressiva de NMJs. Cada linha representa um ratinho individual. Barra de erro = erro padrão da média de repetições técnicas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.