Name: O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Aprenda o método de lesão do nervo fibular em camundongos para avaliar a reinervação muscular e a regeneração de junções neuromusculares. Esta técnica cirúrgica permite comparar taxas de regeneração entre grupos experimentais com alta confiabilidade.

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Os autores agradecem aos membros do laboratório Valdez pela contribuição intelectual sobre os experimentos e comentários sobre o manuscrito.

Todos os experimentos foram realizados sob as diretrizes do NIH e protocolos de animais aprovados pela Comissão de Virginia Tech Institucional animal Cuidado e Uso. 1. Os animais que se preparam para Cirurgia <ol><li> Anestesiar ratos com uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) via injecção subcutânea inguinal com uma seringa de 1 ml estéril insulina. solução portadora contém uma mistura de solução salina a 0,9%, 17,4 mg / ml de cetamina e 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque animais de volta em gaiolas enquanto espera para a medicação fazer efeito. NOTA: Se a dose de carga não proporcionar anestesia suficientes para a duração do processo, um adicional de 25% da dose de carga pode ser injectado. </li><li> animais do monitor após a injecção para verificar se há taxas respiratórias estáveis ​​e depressão adequada dos níveis de excitação. Verifique o nível de excitação com uma pitada pata traseira, o que deve provocar nenhuma resposta quando suficientemente anestesiados. NOTA: Isso normalmente leva 3-5min para um rato adulto jovem, com média de 25 a 30 g. Se o animal ainda é responsivo após a injecção de pós de 10 min, um adicional de 25% da dose de carga de anestésico pode ser injectado. </li><li> Aplicar vaselina e pomada oftálmica óleo mineral leve para os olhos do animal para evitar a secura. Remover animais de gaiola e coloque sobre uma superfície plana e limpa. Raspar o membro posterior desejado de pé para pelve, por um aparador de cabelo elétrico, expondo apenas o aspecto lateral do membro. </li><li> Aplicar um removedor de cabelo química para o local raspada durante 1 min. remover manualmente o cabelo usando lenços de laboratório. Limpe a área depilada com o laboratório toalhete embebido em álcool. </li></ol> 2. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos através de autoclave ou outro método adequado. Limpar o local da cirurgia e tábua cirúrgico com 80% de etanol / H 2 0. Desinfectar o local cirúrgico com proviodine. Coloque o mouse na placa cirúrgica e alinhar-se com as restrições dos membros. Guardao membro alvo traseira em uma posição anatomicamente natural com a articulação do joelho ligeiramente estendido sem rotação interna ou externa. </li><li> Coloque o animal e tábua sob o microscópio cirúrgico. Orientar para o local da incisão adequada através da palpação dos marcos superficiais, especificamente a articulação do joelho ossudo eo cume entre o tibial anterior e gastrocnêmio. </li><li> Fazer uma cerca de 3 cm da incisão através da pele utilizando um bisturi ou uma tesoura de mola enquanto estiver usando uma pinça gerais para emocionante. Fazer a incisão perpendicular ao curso subjacente do nervo fibular comum. </li><li> Continue a incisão através da fáscia superficial, expondo o bíceps femoral e vasto lateral. Separar estes músculos cortando a fáscia profunda ligação. A 1-2 cm corte deve ser suficiente. </li><li> Retrair o músculo bíceps femoral caudal com afastadores mecânicas, revelando o nervo fibular comum. </li><li> Trace o nervo proximal até suas interseção com o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio é encontrado. Nota: A exposição pode requerer manipulação adicional da pele retraída e músculo. Esta intersecção é utilizado como o ponto de referência estável para a lesão do nervo. </li><li> Segure o nervo com uma pinça fina, alinhando as pontas de uma forma paralela à borda lateral do tendão gastrocnêmio. Esmagar o nervo fibular comum, aplicando pressão constante, dura por 5 s. </li><li> Corroboram queda completa do nervo por inspeção visual com o espaço cirúrgico. Ele aparece translúcido no local da lesão. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, a fluorescência irá desaparecer do local da lesão. </li><li> Remover afastadores e realinhar os músculos em suas posições anatômicas. Feche o local da incisão com 6-0 seda. 1-3 suturas interrompidas simples é suficiente. Coloque recuperando do mouse sobre uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa. </li><li> Monitorar todos os animais para 2 horas pós-óperação para verificar se há respiração e quaisquer reacções adversas à anestesia. Administrar uma dose inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg por via de injecção subcutânea inguinal imediatamente a seguir à recuperação da cirurgia. Dê 3 doses adicionais a cada 12 horas durante o próximo 48 horas. Após a recuperação completa, voltar ratos para a instalação de cuidados com os animais. </li></ol> 3. Isolamento e Coloração de extensor longo dos dedos músculos (EDL) <ol><li> Sacrificar animais com isoflurano. Pipetar 0,5 ml de isoflurano líquido para um tubo de 50 mL embalada com labwipes absorventes. Colocar o tubo destapado com o animal numa câmara selada 2,500 centímetros 3. Pelo menos 4 min de exposição é suficiente. Teste para perda de palpebral bilateral, toe-beliscão, e reflexos rabo-de aperto para garantir que cada animal está inconsciente antes de prosseguir com a perfusão. </li><li> Transcardialmente perfundir 16 animais em primeiro lugar com 10 ml de 0,1 M de PBS, em seguida, 25 ml de 4% de paraformaldeído em 0,1 M de PBS (pH 7,4). Heparina (30 unidades / 20g de peso do animal), pode ser adicionado com o PBS (10 unidades / ml) para evitar a coagulação do sangue em pequenos capilares, melhorando os resultados de perfusão. </li><li> Remover a pele que cobre os membros posteriores, utilizando uma tesoura para cortar transversalmente através da pele em torno da circunferência do abdómen. Descascar para baixo a pele após os membros e patas traseiras com a pinça. </li><li> Remover fáscia superficial de membros posteriores, segurando e peeling com fórceps. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, pós-fix ratos toda a noite em 4% PFA em tubos de 50 ml. Lavar três vezes com PBS. NOTA: Fixa ratinhos podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C. Se não, pule esta etapa e vá para a etapa 3.6, sem animais pós-fixação. </li><li> Dissecar músculos EDL 18 de rato membros traseiros, tendo a certeza de manter proximal e distal tendões tão intacto quanto possível. </li><li> Incubar músculos EDL em tampão de bloqueio (PBS 1x contendo 0,5% de Triton X-100, BSA a 3% e soro de cabra a 5%) durante pelo menos 1 h. </li><li&gt; Para visualizar os axônios a motor e seus terminais nervosas, músculos lugar em tubos contendo neurofilamentos (1: 1000) e sinaptotagmina-2 (1: 250) anticorpos diluídos em tampão de bloqueio durante 3 dias. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. Nota: Ignore esta etapa se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes (XFP) em axônios periféricos. </li><li> Manchar o contralateral ileso EDL como um controlo positivo para a inervação completa MNJ. Os controlos negativos devem incluir uma EDL obtido em 4 dias pós-ferimento, um ponto de tempo onde o JNM é completamente desnervado, bem como uma EDL coradas com anticorpo secundário única. </li><li> Incubar músculos com anticorpos secundários marcados fluorescentemente apropriadas para detectar neurofilamento e sinaptotagmina-2 durante 1 dia. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. Nota: Este passo pode ser realizado juntamente com o passo 3.10. Pule esta etapa se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos. </li><li> Para visualizar a postsynaptic região do MNJ, músculos incubar com 5 ug / mL de Alexa-555 conjugado alfa-bungarotoxina diluído em tampão de bloqueio durante, pelo menos, 2 h. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. </li><li> Para montar músculos inteiros em lâminas de vidro com carga positiva, coloque o músculo diretamente sobre o slide, adicionar algumas gotas de glicerol com base médio no slide de montagem e cobrir com uma lamela. Pressione a lamela contra o slide para achatar o músculo. Mergulhe off meios de montagem a partir do perímetro da lâmina e lamela usando lenços de laboratório. Aplique unha polonês para selar as arestas entre as lamelas e slide. </li></ol> 4. Imagem e Análise de Dados <ol><li> Para analisar a estrutura da NMJs, imagem do músculo EDL usando um microscópio confocal de varrimento laser equipado para excitar 488, 555 e 633 nm de luz e capturar a luz emitida com 20X e 40X objectivos. </li><li> Para visualizar toda NMJs, criar imagens projeção de intensidade máxima de sec ópticações espaçadas de 1 a 2 mm que se estende para além do menor para o maior regiões visíveis do MNJ. Crie projeções de intensidade máxima, utilizando software de imagens disponível no mercado. </li><li> Para determinar as taxas de reinervação, categorizar NMJs como: 1) completamente desnervado = sítio pós-sináptico é completamente desprovida de contacto com axônio, menos de 5% co-localização entre o axônio e AChRs. 2) parcialmente inervado = o axónio sobrepõe parcialmente o postsynapse, 5-95% de co-localização entre o axónio e AChRs. 3) inervação completa = cerca de aposição perfeita entre o pré e pós-sinapse, superior a 95% co-localização entre o axônio e AChRs. Excluir NMJs que se encontram perpendiculares ao plano de imagem, ou não são totalmente visualizadas na imagem. Nota: Em todas estas experiências, pelo menos, 3 animais e 50 NMJs por animal foram examinados. Os resultados foram considerados significativos usando um teste t de Student, com um valor P inferior a 0,05. </li><li> Para cegar o operador, indivíduos separados pode executara análise de cirurgia e imagem. Sem o conhecimento dos grupos de tratamento, o analisador pode ser objectivo com JNM de pontuação. Alternativamente, as imagens podem ser aleatorizados e apresentados ao operador para análise sem o conhecimento do animal de origem. </li></ol> 5. Quantitative PCR <ol><li> Sacrificar animais utilizando isoflurano e deslocamento cervical. Retire a pele e fáscia superficial que cobre os músculos da perna de acordo com o passo 3.3. Dissecar tibial anterior e músculos EDL acordo com o passo 3.4. </li><li> Flash congelar todo o tibial anterior e músculos EDL em um tubo de 1,5 ml sobre azoto líquido. Remover o tecido do tubo e colocar num almofariz pré-arrefecido parcialmente submerso em azoto líquido. Moer músculo congelado em um pó fino usando um almofariz e pilão. </li><li> Dissolve-se pó de músculo congelado em um reagente de extracção de ARN comercialmente disponível e efectuar a extracção de ARN e a remoção de DNA genómico com um kit disponível comercialmente de acordo com I do fabricantenstructions. </li><li> Realizar a transcrição reversa com uma transcriptase reversa mistura disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Execute qPCR utilizando um kit disponível comercialmente usando genes de limpeza adequados (ver tabela de materiais). Use um quantitativo termociclador PCR comercialmente disponível para realizar PCR (ver tabela de materiais). </li><li> Ajuste temperatura de recozimento de 58 ° C. Ajustar os parâmetros de ciclismo adicionais às especificações do fabricante de Taq polimerase / SYBR mix verde. Incluir um passo final da curva de fusão do programa de termociclador consistindo de 0,5 ° C aumentos incrementais de 65 ° C a 95 ° C para testar a especificidade do iniciador e o iniciador a formação de dímeros. </li><li> Determinar os níveis de expressão de ARNm relativa pelos 2 - Método ΔΔCT 21 utilizando 18S ARN como o gene de controlo. </li></ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction%2C+assembly%2C+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).</li>
<li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+as+a+distal+axonopathy%3A+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Front. Neurosci. 8, 252(2014).</li>
<li>Apel, P. J., Alton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+age+impairs+the+response+of+the+neuromuscular+junction+to+nerve+transection+and+repair%3A+An+experimental+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats.</a> J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+neuromuscular+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve+Suppl%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in neuromuscular innervation.</a> Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PloS one. 7 (4), e34640(2012).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+pathways+promote+precise+projection+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pre-existing pathways promote precise projection patterns.</a> Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).</li>
<li>Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cellular+interactions+in+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration.</a> Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).</li>
<li>Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration%3A+gaining+perspective+on+inflammatory+events+after+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury.</a> J Neuroinflammation. 8, 110(2011).</li>
<li>Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+Wallerian+degeneration+and+axonal+regeneration+after+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).</li>
<li>Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sciatic+nerve+injury+model+in+pre-clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The sciatic nerve injury model in pre-clinical research.</a> J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).</li>
<li>Batt, J. A. E., Bain, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tibial+nerve+transection+-+a+standardized+model+for+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice.</a> J. Vis. Exp. (81), e50657(2013).</li>
<li>Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+nerve+injury%3A+a+simple+and+subtle+model+for+investigating+many+aspects+of+nervous+system+damage+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery.</a> J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).</li>
<li>Kang, H., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+regeneration+and+muscle+reinnervation+in+young+adult+and+aged+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals.</a> J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Feng, G., Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Bowen, D. C., Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+regulation+of+MuSK+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction.</a> Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).</li>
<li>Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myostatin+deficiency+is+associated+with+an+increase+in+number+of+total+axons+and+motor+axons+innervating+mouse+tibialis+anterior+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle.</a> Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método apresentado neste manuscrito oferece oportunidades únicas para identificar mecanismos envolvidos na reparação de junções neuromusculares (JNM). Este método envolve o esmagamento do nervo fibular comum que passa sobre o tendão gastrocnêmio, perto do joelho. Mostramos que após apenas 5 segundos de compressão do nervo com um fórceps, degeneração completa é conhecida por 4 dias após a lesão. Em ratos adultos jovens, os axônios alfa-motoras começam a reinnervate sítios sinápticos anteriores no músculo extensor longo...

Em animais adultos jovens e saudáveis, a junção neuromuscular (NMJ) é uma conexão altamente estável entre a pré-sinapse, a terminação nervosa de um axônio α-motor, e a pós-sinapse, a região especializada de uma fibra muscular extrafusa, onde os receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRs) agregam seletivamente1. A aposição quase perfeita dos aparelhos pré e pós-sinápticos é necessária para a neurotransmissão adequada, sobrevivência dos neurônios α-motores e fibras musculares e função motora. Infelizmente, a função da JNM é afetada negativamente pelo envelhecimento, doenças como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doenças autoimunes e lesão dos músculos e nervos periféricos2-5. Esses insultos geralmente resultam na degeneração das terminações nervosas pré-sinápticas, deixando os músculos desnervados e alterando significativamente as habilidades motoras. Por esse motivo, a identificação de moléculas que funcionam para manter e reparar a JNM tornou-se uma prioridade. Como os nervos periféricos se regeneram e reinervam os alvos, os modelos de lesão de nervos periféricos têm sido usados para identificar alterações moleculares associadas à regeneração de NMJs. 
Os modelos de lesão de nervos periféricos geralmente envolvem o corte ou esmagamento completo de ramos nervosos específicos6. Após um corte, o tubo endoneural deve ser reformado, atrasando a regeneração axonal e a reinervação das células-alvo e tecidos. A gravidade desse tipo de lesão também faz com que os axônios se afastem de seu caminho original, resultando em sua falha em atingir os alvos originais. Isso contrasta com os nervos lesionados por esmagamento, onde o endoneuro permanece contíguo, fornecendo um caminho para o crescimento eficiente e adequado dos axônios em regeneração. Também permite que os axônios encontrem e reinervam seus parceiros originais de fibras musculares. Independentemente do modelo de lesão, há uma série de alterações celulares e moleculares que devem ocorrer para que os axônios se regenerem e reinervam os alvos. Após uma lesão, o segmento nervoso proximal ao alvo é quebrado e removido por meio de um processo denominado Degeneração Walleriana7. Esse processo envolve a reprogramação e desdiferenciação das células de Schwann em células não mielinizantes que secretam fatores regenerativos, limpam a mielina e recrutam macrófagos para o local da lesão8. Os macrófagos, por sua vez, completam a depuração da mielina e dos detritos axonais, o que, de outra forma, impediria o crescimento do axônio9 em regeneração. Paralelamente, os neurônios motores e sensoriais ativam os mecanismos necessários para promover a regeneração de seus axônios cortados. Uma vez que o axônio regenerador atinge o alvo, ele deve se transformar de um cone de crescimento em uma terminação nervosa capaz de transmitir adequadamente (para axônios motores) ou receber (para axônios sensoriais) informações10. Nesse sentido, os axônios motores alfa sofrem uma série de mudanças bem orquestradas que culminam em seu cone de crescimento diferenciando-se em uma terminação nervosa pré-sináptica totalmente funcional que se opõe quase perfeitamente ao local pós-sináptico na fibra muscular alvo11. 
Os nervos ciático, tibial e acessório têm sido as principais escolhas para o estudo da regeneração axonal e daJNM12-14. No entanto, há uma série de desvantagens ao usar esses modelos para examinar as alterações celulares e moleculares associadas à regeneração de NMJs entre animais e sob diferentes condições. Em primeiro lugar, o nervo ciático supre a maioria dos músculos do membro posterior, com lesões limitando significativamente o movimento e a sensação. Portanto, não é possível usar esse método para estudar o impacto do exercício sozinho ou em combinação com outros fatores. Além disso, o nervo ciático é uma estrutura bastante espessa e, portanto, requer uma grande quantidade de força compressiva para ferir totalmente todos os axônios. Isso, por sua vez, pode resultar na transecção completa dos axônios mais superficiais, deixando intacto o tubo endoneural dos axônios mais profundos, introduzindo variabilidade significativa na taxa e fidelidade de regeneração entre esses axônios. A transecção completa desse nervo é ainda menos desejável, pois muitos axônios não conseguirão se reconectar com as mesmas fibras musculares. Para complicar as coisas, o nervo ciático possui variabilidade anatômica intrínseca, tanto no número quanto no local de origem de seus ramos nervosos terminais. Portanto, é muito difícil lesionar o mesmo local. Embora o nervo tibial seja menor e mais passível de lesões por esmagamento, também não há um ponto de referência prontamente disponível para servir como local de lesão para esse ramo nervoso. 
O ramo do nervo acessório (parte do nervo craniano XI) que supre o músculo esternocleidomastóideo também tem sido usado para estudar a regeneração dasJNMs15. Este nervo é particularmente atraente porque as JNMs no músculo esternocleidomastóideo podem ser mais facilmente visualizadas em animais vivos em comparação com as JNMs em outros músculos. Mas, semelhante aos nervos ciático e tibial, não há um ponto de referência específico que possa ser usado para lesar esse nervo no mesmo local, limitando-o como um modelo para comparar a regeneração de NMJs entre animais individuais de uma coorte experimental. Um local de lesão inconsistente introduz variabilidade nas taxas de reinervação da JNM. Devido a essas deficiências, o procedimento apresentado aqui utiliza a lesão de um ramo nervoso periférico diferente para examinar as JNMs em regeneração. 
O nervo fibular comum, também chamado de nervo fibular comum, contém muitas características que o tornam um nervo confiável para examinar a regeneração de NMJs entre animais e em diferentes tratamentos. O nervo fibular comum tem um curso anatômico previsível à medida que passa sobre o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio no joelho, a intersecção servindo como um ponto de referência estável para lesões. O nervo é acessado através de uma incisão pequena e minimamente invasiva próxima, mas anatomicamente segregada dos músculos de interesse. Os resultados apresentados aqui demonstram que os axônios motores em regeneração começam a reformar as JNMs no músculo extensor longo dos dedos (EDL) 8 dias após o esmagamento do nervo fibular em camundongos fêmeas adultas jovens de 70 dias de idade. É importante ressaltar que o padrão e a taxa de reinervação são consistentes entre animais da mesma idade e sexo e, portanto, fornecem um modelo de lesão confiável que acelerará significativamente nossa compreensão das mudanças celulares e moleculares necessárias para manter e reparar as JNMs.

<table><tbody><tr><td>Cetamina</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc.&nbsp;</td><td>003437&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>&nbsp; Zoopharm</td><td>1Z-73000-150910&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kim-wipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador Elétrico</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-64800</td><td></td></tr><tr><td>80% EtOH / H 20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Proviodo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringa</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Insulina Tesoura de Mola</td><td>Bisturi Vannas</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>No. 15</td><td>Braintree Scientific</td><td>SSS 15</td><td></td></tr><tr><td>#5 Fórceps</td><td>Dumont</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>6-0 sutura de seda em agulha de corte reverso</td><td>&nbsp; Sutura Express</td><td>752B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Aquecimento para Roedores</td><td>Braintree Scientific</td><td>AP-R-18.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 Sondas Moleculares Alfa-BTX Conjugadas</td><td></td><td>B35451</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo Zoom Olympus</td><td>562037192</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Zeiss 700 Zeiss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusão peristáltica de fluxo variável</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-3</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad iScript RT Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725200</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Pomada</td> <td>VetPuralube</td><td>1621</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin-2 anticorpo</td><td>Anticorpos-Online</td><td>ABIN401605</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anticorpo de neurofilamento-ABIN2475842</td><td></td><td></td> <td>online</td></tr></tbody></table>

o nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo junções neuromusculares

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

A junção neuromuscular (MNJ) sofre alterações estruturais e funcionais deletérios, como resultado do envelhecimento, ferimentos e doenças. Assim, é imperativo compreender as alterações celulares e moleculares envolvidos na manutenção e reparação NMJs. Para esta finalidade, desenvolvemos um método fiável e consistente para examinar regenerar NMJs em ratinhos. Este método envolve a lesão do nervo esmagamento do nervo fibular comum, uma vez que passa por cima da cabeça lateral do tendão do músculo gastrocnêmio, perto do joelho. Usando ratos fêmeas mais velhas 70 dias, demonstramos que axônios motores começam a reinnervate metas pós-sinápticos anteriores no prazo de 7 dias após o esmagamento. Eles reocupar completamente suas áreas sinápticas anteriores por 12 dias. Para determinar a confiabilidade desse método de lesão, foram comparadas as taxas de reinervação entre camundongos fêmeas velhas 70 dias individuais. Verificou-se que o número de sítios pós-sinápticos reinervados foi semelhante entre os ratinhos em 7, 9, e 12 dias pós-esmagamento. Para determinar seeste ensaio de lesão também pode ser utilizado para comparar as alterações moleculares em músculos, que examinaram os níveis de gama-a subunidade do receptor nicotínico muscular (gama-AChR) e a quinase específica do músculo (almíscares). A subunidade gama-AChR e almíscar que são altamente regulada seguinte desnervação e retornar aos níveis normais após a reinervação dos NMJs. Encontramos uma relação estreita entre os níveis de transcrição para estes genes e status inervação dos músculos. Acreditamos que este método irá acelerar nossa compreensão das mudanças celulares e moleculares envolvidos na reparação do MNJ e outras sinapses.

O nervo fibular comum, também chamado o nervo fibular comum, surge a partir do nervo ciático acima da fossa poplítea, onde ele oscila ao redor da cabeça da fíbula ao aspecto anterior da perna (Figura 1A). Lá ramificações nos nervos fibulares superficial e profunda, em conjunto fornecendo os dorsiflexores do pé e dos dedos (tibial anterior, extensor longo dos dedos e brevis, e hálux músculos extensores longus), e os everters do pé (músculos fibulares). Este nervo também t...

Desenvolvemos um método de lesão nervosa para examinar de forma confiável a reinervação muscular e, portanto, a regeneração das junções neuromusculares em camundongos. Esta técnica envolve a lesão do nervo fibular comum por meio de uma cirurgia simples e altamente reprodutível. A reinervação muscular é então avaliada pela montagem completa do músculo extensor longo dos dedos.

O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

O objetivo geral deste método de lesão do nervo periférico é examinar de forma confiável as junções neuromusculares em regeneração em camundongos. Este método nos ajudará a identificar as alterações moleculares, celulares e funcionais associadas às junções neuromusculares em regeneração. A principal vantagem deste procedimento é que a taxa de regeneração da junção neuromuscular pode ser comparada de maneira confiável entre grupos experimentais, em grande parte na ausência de alterações miogênicas.William Dalkin, um estudante de medicina do meu laboratório, demonstrará o procedimento. Antes de iniciar o procedimento, use etanol a 80% para limpar o local cirúrgico, a placa e os instrumentos, seguido por desinfecção com poviodine-iodo. Em seguida, posicione o camundongo sobre a placa cirúrgica e confirme a ausência de resposta ao aperto dos dedos dos pés.Alinhe os membros dentro dos suportes com o membro traseiro alvo em uma posição anatomicamente natural e com as articulações do joelho levemente estendidas, sem rotação interna ou externa. Em seguida, transfira o animal para sob um microscópio cirúrgico e ajuste a placa até que a articulação óssea do joelho e a crista entre os músculos tibial anterior e gastrocnêmio sejam visíveis através da objetiva. Usando um bisturi e uma pinça, faça uma incisão de aproximadamente três centímetros através da pele, perpendicular ao trajeto subjacente do nervo fibular comum.Continue a incisão pela fáscia superficial, expondo os músculos bíceps femoral e vasto lateral, seguido por uma incisão de um a dois centímetros através da fáscia profunda conectiva para separar os músculos. Em seguida, utilize retratores mecânicos para afastar caudalmente o músculo bíceps femoral e revelar o nervo fibular comum. Siga o nervo proximalmente até encontrar sua interseção com o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio.Em seguida, utilize uma pin&ccedil;a fina para segurar o nervo, alinhando as pontas paralelamente &agrave; borda lateral do tend&atilde;o do gastrocn&ecirc;mio, e aplique press&atilde;o constante e concentrada durante cinco segundos para esmagar o nervo fibular comum. Mantendo a pin&ccedil;a perpendicular &agrave;s fibras, segure o tecido na &aacute;rea logo atr&aacute;s da ponta da pin&ccedil;a e aplique press&atilde;o firme, por&eacute;m suave, para obter um esmagamento limpo e linear do nervo ao longo da borda do tend&atilde;o. Inspeccione visualmente o nervo atrav&eacute;s do microsc&oacute;pio cir&uacute;rgico para confirmar o esmagamento completo do tecido.O nervo apresentará uma aparência translúcida no local da lesão. Se forem utilizados camundongos que expressam proteínas fluorescentes nos axônios periféricos, a fluorescência desaparecerá do local da lesão. Se o nervo tiver sido suficientemente danificado, remova os retratores e realinhe os músculos em suas posições anatômicas.Em seguida, utilize suturas de seda 6-0 para fechar o local da incisão com um a três pontos simples interrompidos e coloque o camundongo sobre uma placa aquecida em uma gaiola limpa, com monitoramento até sua completa recuperação. A compressão do nervo por cinco segundos usando uma pinça fina resulta no desaparecimento da YFP do local da lesão. O epineúrio permanece contínuo, servindo como um conduto para a regeneração precisa dos axônios até seus alvos originais.Em camundongos fêmeas com 70 dias de idade, a lesão nervosa é suficiente para causar a degeneração de todos os segmentos axonais distais em relação ao corpo celular neuronal, quatro dias após a esmagamento. Após sete dias do esmagamento, as terminações nervosas estão ativamente reocupando os sítios pós-sinápticos desocupados. No dia 12, as terminações nervosas continuam a se diferenciar em sítios pré-sinápticos e as junções neuromusculares estão completamente reinervadas.Existe pouca variabilidade entre camundongos desnervados pelo mesmo período de tempo, demonstrando que a compressão do nervo fibular pode ser utilizada como um ensaio para comparar a reinervação de músculos entre animais da mesma idade e sexo. Como esperado, diversas alterações ocorrem nos axônios motores alfa à medida que eles reinervam as fibras musculares. Os cones de crescimento axonais se expandem e ramificam ao entrarem em contato com os sítios pós-sinápticos, crescendo sobre regiões específicas da pós-sinapse, culminando na quase completa justaposição das terminações axonais com os sítios pós-sinápticos.Como demonstrado pela PCR quantitativa, os genes associados à junção neuromuscular aumentam após a desnervação e diminuem à medida que as junções neuromusculares são reinervadas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 15 minutos, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de tomar o tempo necessário, visualizar todas as estruturas e verificar cuidadosamente se foi obtida uma esmagamento completo.Após este procedimento, outros métodos como a PCR em tempo real podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre quais genes estão sendo regulados para cima ou para baixo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurobiologia explorarem regenerações sinápticas em camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma compressão do nervo fibular para examinar as taxas de reinervação da junção neuromuscular em camundongos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste relatório nós descrevemos um método para esmagamento do nervo ciático do rato. Este método usa prontamente disponíveis pinça hemostática e facilmente reproduzível e produz esmagamento do nervo ciático completa. Além disso, nós descrevemos um método para preparar montagens de músculos inteiros adequados para análise da regeneração do nervo após esmagamento do nervo ciático.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Este vídeo demonstra um método para avaliar as junções neuromusculares funcionais. Usando um biorreator contendo tecido muscular e neurônios motores, juntamente com microscopia fluorescente, os canais sensíveis à luz nos neurônios são estimulados a gerar sinais elétricos, causando contrações nas fibras musculares.

Avaliação de uma junção neuromuscular funcional por meio de estimulação óptica simultânea e gravação de vídeo

Fonte: Dalkin, W., et al. O método de lesão do nervo fibular: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que reparam as junções neuromusculares. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um procedimento cirúrgico para induzir lesão do nervo fibular em um camundongo para estudar a regeneração da junção neuromuscular (JNM). O procedimento envolve expor o nervo fibular, aplicar pressão controlada para induzir lesão e garantir que o epineuro permaneça intacto para apoiar a regeneração...

Induzindo lesão do nervo fibular em um camundongo para estudar a regeneração da junção neuromuscular

A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Técnicas de excitabilidade axonal fornecem uma poderosa ferramenta para examinar a fisiopatologia e alterações biofísicas que precedem eventos degenerativas irreversíveis. Este manuscrito demonstra a utilização destas técnicas no nervo ulnar de ratos anestesiados.

Na Vivo Medida eletrofisiológica do nervo Ulnar rato com teste de excitabilidade Axonal

Apresenta-se um protocolo para produzir diferentes tipos de lesões nervosas medianas (MN) e reparar no rato. Além disso, o protocolo mostra como avaliar a recuperação funcional do nervo utilizando vários testes comportamentais não invasivos e medidas fisiológicas.

Métodos funcionais e fisiológicos de avaliação da regeneração do nervo mediano no rato

A análise automatizada da marcha é uma ferramenta viável para avaliar a recuperação funcional em modelos de roedores de lesão nervosa periférica e lesão de contusão medular. Embora exija apenas uma configuração para avaliar a função locomotor em vários modelos experimentais, o ajuste meticuloso e macio e o treinamento dos animais é altamente importante.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

A avaliação da recuperação motora continua sendo a medida de desfecho de referência em estudos experimentais de nervos periféricos. A medição da força tetanica isométrica do músculo tibialis anterior no rato é uma ferramenta inestimável para avaliar os resultados funcionais após a reconstrução de defeitos do nervo ciático. Os métodos e nuances estão detalhados neste artigo.

Medição máxima da Força Tetanica Isométrica do Músculo Tibialis Anterior no Rato

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Aprenda o método de lesão do nervo fibular em camundongos para avaliar a reinervação muscular e a regeneração de junções neuromusculares. Esta técnica cirúrgica permite comparar taxas de regeneração entre grupos experimentais com alta confiabilidade.

O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares

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