O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares

O objetivo geral deste método de lesão de nervo periférico é examinar de forma confiável as junções neuromusculares em regeneração em camundongos. Este método nos ajudará a identificar as alterações moleculares, celulares e funcionais associadas à regeneração das junções neuromusculares. A principal vantagem deste procedimento é que a taxa de regeneração da junção neuromuscular pode ser comparada de forma confiável entre os grupos experimentais, em grande parte na ausência de alterações miogênicas.

Demonstrando o procedimento estará William Dalkin, um estudante de medicina em meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento, use etanol a 80% para limpar o local cirúrgico, a placa e os instrumentais, seguido de desinfecção com iodopovidona. Em seguida, coloque o mouse na placa cirúrgica e confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.

Alinhe os membros dentro das restrições com o membro posterior alvo em uma posição anatomicamente natural e as articulações do joelho ligeiramente estendidas sem rotação interna ou externa. Em seguida, transfira o animal para um microscópio cirúrgico e ajuste a prancha até que a articulação óssea do joelho e a crista entre os músculos tibial anterior e gastrocnêmio sejam visíveis através da objetiva. Usando um bisturi e uma pinça, faça uma incisão de aproximadamente três centímetros através da pele, perpendicular ao curso subjacente do nervo fibular comum.

Continue a incisão através da fáscia superficial expondo os músculos bíceps femoral e vasto lateral, seguida por uma incisão de um a dois centímetros através da fáscia profunda de conexão para separar os músculos. Em seguida, use afastadores mecânicos para recuar o músculo bíceps femoral caudalmente para revelar o nervo fibular comum. Trace o nervo proximalmente até que sua interseção com o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio seja encontrada.

Em seguida, use uma pinça fina para agarrar o nervo alinhando as pontas paralelas à borda lateral do tendão gastrocnêmio e aplique pressão constante e concentrada por cinco segundos para esmagar o nervo fibular comum. Segurando a pinça perpendicular à fibra, segure o tecido com a área logo atrás da ponta da pinça e aplique uma pressão firme, mas suave, para um esmagamento limpo e linear do nervo ao longo da borda do tendão. Inspecione visualmente o nervo através do microscópio cirúrgico para confirmar um esmagamento completo do tecido.

O nervo parecerá translúcido no local da lesão. Se camundongos que expressam proteínas de fluorescência nos axônios periféricos forem usados, a fluorescência desaparecerá do local da lesão. Se o nervo estiver suficientemente danificado, remova os afastadores e realinhe os músculos em suas posições anatômicas.

Em seguida, use suturas de seda 6-0 para fechar o local da incisão com uma a três suturas simples interrompidas e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. Comprimir o nervo por cinco segundos usando uma pinça fina resulta no desaparecimento do YFP do local da lesão. O epineuro permanece contíguo, servindo como um canal para a regeneração precisa dos axônios para seus alvos originais.

Em camundongos fêmeas de 70 dias de idade, a lesão nervosa é suficiente para causar degeneração de todos os segmentos axonais distais do soma neuronal, quatro dias após o esmagamento. Sete dias após o esmagamento, as terminações nervosas estão reocupando ativamente os locais pós-sinápticos desocupados. No dia 12, as terminações nervosas continuam a se diferenciar em locais pré-sinápticos e as junções neuromusculares são totalmente renervadas.

Há pouca variabilidade entre camundongos desnervados pelo mesmo período de tempo, demonstrando que o esmagamento do nervo fibular pode ser usado como um ensaio para comparar a reinervação dos músculos entre animais da mesma idade e sexo. Como esperado, uma série de mudanças ocorrem nos axônios motores alfa à medida que reinervam as fibras musculares. Os cones de crescimento axonal se expandem e se ramificam à medida que entram em contato com locais pós-sinápticos, crescendo em regiões específicas da pós-sinapse e culminando na justaposição quase completa das terminações axonais com os locais pós-sinápticos.

Conforme demonstrado por PCR quantitativo, os genes associados à junção neuromuscular aumentam após a desnervação e diminuem à medida que as junções neuromusculares são renervadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 15 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de levar o seu tempo, visualizar todas as estruturas e verificar novamente se uma queda completa foi obtida.

Após este procedimento, outros métodos como QPCR podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre quais genes estão sendo regulados para cima ou para baixo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia explorarem as regenerações sinápticas em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um esmagamento do nervo fibular para examinar as taxas de reinervação da junção neuromuscular em camundongos.