Protocolo experimental para Produção de Biodiesel com Isolamento de Alkenones como subprodutos da Commercial Isochrysis Algas Biomassa

Recentemente, tem havido um grande ressurgimento do interesse em biocombustíveis a partir de algas, especialmente para a produção de combustíveis líquidos como o biodiesel ¹ e outros óleos derivados da biomassa. ² benefícios propostas incluem a prevenção de certos alimentos versus combustíveis controvérsias ³ e produtividades supostamente mais elevados e capacidades de CO ₂ de mitigação do que as culturas agrícolas tradicionais. ⁴ Isto segue a quase 20 anos do Departamento de Espécies Programa Aquático de Energia (ASP) dos Estados Unidos começou em 1978 com a finalidade de investigar combustível de transporte a partir de algas. Conforme descrito no relatório do Sheehan, ⁵ o programa terminou em 1996, principalmente porque os custos projetados não eram competitivos com o petróleo bruto na época ($ 18,46 por barril (159 L)). Enquanto o custo do petróleo tem aumentado dramaticamente desde então ($ 87,39 por barril em 2014) ^6, que está ligado ao renascimento na pesquisa em biocombustíveis de algas, alguns hav argumentou que, no entanto, os biocombustíveis de algas irá revelar-se demasiado dispendiosa. ⁷ Como uma estratégia para compensar os custos de produção de biocombustíveis, a noção de co-produtos de valor agregado surgiu entre ambos os críticos e defensores ^{7,8 9,10} e características como uma das principais razões para perseguir os biocombustíveis de algas no Departamento de Energia dos EUA (DOE) "Technology Roadmap de algas biocombustíveis Nacional". ¹¹

Descrevemos aqui um método para a co-produção de duas correntes separadas de combustível a partir de microalgas Isochrysis comercial. Temos nos concentrado em Isochrysis em parte porque ele já é produzido industrialmente, colhido para fins de maricultura, e também porque Isochrysis é um dos apenas algumas espécies de algas que, além de lipídios tradicionais (ou seja, ácidos graxos) biossintetizam uma única classe de compostos conhecidos como alkenones de cadeia longa poli-insaturados. ¹² Alkenone estruturas são caracterizadas por muito L cadeias de hidrocarbonetos ong (36-40 átomos de carbono), de duas a quatro não de metileno interrompidas ligações duplas trans, e uma cetona ou metil etil (Figura 1). Alkenone insaturação é sensível à temperatura de cultivo de algas, ^13,14 de tal forma que a proporção do di-insaturado alkenone metil C37 (o chamado "índice de insaturação") pode ser usado como um substituto para as temperaturas da superfície do mar no ^{passado. 15 - 20} são Alkenones pensado para residir em corpos lipídicos citoplasmáticos e pode ser mais abundantes do que os triglicéridos (tags). ^21,22 Sob azoto ou limitação de fósforo, de até 10-20% de carbono de células em fase estacionária é acumulada como alkenones ^23,24. de uma ponto de vista evolutivo, alkenones pode ter sido favorecido em detrimento de TAGs porque a sua trans geometria vínculo -duplo fornece uma forma mais estável de armazenamento de energia. ²¹

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Figura 1. Estruturas de poli-insaturados de cadeia longa alkenones alkenone comum de metilo. 37: 3 isoladas a partir de Isochrysis exemplificando comprimentos de cadeia longa de hidrocarboneto (36 - 40 átomos de carbono), não de metileno interrompidas ligações duplas trans, e que termina num grupo metilo ou etil-cetona. Nomenclatura é similar aos ácidos graxos onde #: # se refere a número de carbonos:. Número de ligações duplas Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Argumentamos que alkenones representam uma matéria-prima renovável de carbono promissor de uma alga comum com a história do cultivo industrial. ²⁵ Biodiesel produzido directamente a partir do extrato de lipídeos totais de Isochrysis contém uma quantidade significativa (10-15% w / w) de alkenones e contaminação por estes compostos de alto ponto de fusão resulta em má propriedades do combustível de fluxo frio. No entanto, usando tele técnicas de saponificação / extracção descritos aqui, alkenones pode ser removido e recuperado melhorando assim a qualidade de biodiesel, produzindo uma corrente de produto secundário. Recentemente, demonstrou a conversão de alkenones para um combustível líquido por metátese cruzada com 2-buteno (butenolysis). ²⁶ A reacção butenolysis emprega um ruténio comercial metátese-iniciador, ocorre rapidamente a baixa temperatura, e de forma limpa proporciona uma mistura previsível de combustível de jacto hidrocarbonetos alcance. Esta reacção é realizada em paralelo com a síntese de biodiesel a partir de ácidos gordos, que representa os primeiros passos para uma abordagem "biorrefinaria" ²⁷ para a produção de biocombustíveis Isochrysis comercialmente viável.

1. As microalgas e Biomassa Preparação

Nota: O fuzileiro microalga Isochrysis sp. "T-iso" utilizado no presente estudo pode ser comprado (veja Lista de Materiais). Quantidades multi-quilograma de Isochrysis pode ser comprado como uma pasta molhada congelada (Iso -paste) contendo aproximadamente 80% de água e 20% de biomassa, e é verde escuro / perto de cor preta com um cheiro odor pungente do mar. Isochrysis também pode ser comprado como um seco (95% seco) de pó castanho-amarelado (Iso -Pó) com um odor semelhante.

1. A fim de secar a pasta Isochrysis, abrir um pacote de 1 kg por corte de 1 - buraco de 2 polegadas no canto da embalagem de plástico com uma tesoura.
2. Espremer aproximadamente 300 g destes Isochrysis colar através do buraco em um 150 milímetros x 75 milímetros cristalização prato para criar uma camada fina (cerca de 20 mm).
3. Deixe a pasta secar ao ar à temperatura ambiente até que se torne seca e escamosa (tipicamente, 48 -96 h).
   Nota: Os tempos de secagem podem variar e dependem da temperatura. No entanto, nenhuma diferença foi observada nos rendimentos ou qualidade do produto com o tempo de secagem ainda mais longos (até duas semanas). O processo de secagem pode também ser feita mais uniforme e / ou acelerada colocando o prato de cristalização em uma placa quente (30 - 40 ° C).
4. Raspe a biomassa seca do prato cristalizando utilizando uma espátula e recolher em uma extração de celulose dedal (Comprimento: 123 mm, de 43 mm de diâmetro). Registar o peso da biomassa Isochrysis seco.

2. Extracção Soxhlet de biomassa seca Isochrysis

1. Carregar um Isochrysis -Contendo cone de extracção de celulose (tipicamente 50 - 60 g de biomassa seca) em um aparelho de extracção Soxhlet.
2. Encher o balão de Soxhlet, com hexanos (400 mL), ligar a fonte de água do condensador e calor, e permitir que o Soxhlet com ciclo de 24 - 48 horas (até a cor do solvente passou de verde escuro para umadesmaio amarelo).
3. Desligue o fogo e deixe o aparelho arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida, retirar o balão do extractor Soxhlet.
4. Remover os hexanos utilizando um evaporador rotativo e registrar o peso do material de hexanos-extractáveis ​​( "óleo de algas hexano" (h-AO)).

3. A saponificação do óleo de algas e separação de ácidos graxos e lipídios neutros

1. Redissolve-se o h-AO no mesmo balão de fundo redondo a partir do Passo 2.4 acima, com metanol: diclorometano (2: 1, volume = 10 x massa de óleo de algas).
2. Adicionar uma barra de agitação e anexar um condensador de refluxo (bobina: 500 mm de comprimento).
3. Adicionar _H2O (volume = 2,67 x massa de óleo de algas) e KOH (50% w / w óleo de algas) e aquecer o conteúdo com agitação até 60 ° C durante 3 h.
4. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, remover os solventes orgânicos (metanol e diclorometano) num evaporador rotativo.
5. Transferir a mistura aquosa restante vertendo-a em um 1-L funil de separação. Adicionar hexanos (equivalentes em volume à solução aquosa), agitar a ampola de decantação, e permitir que as camadas se separem.
6. Escorra a camada aquosa inferior é colocada num Erlenmeyer e deitar fora a fase orgânica superior em um Erlenmeyer separado.
7. Repita os passos 3.5 e 3.6 até que a camada orgânica é incolores (tipicamente 1-2 vezes mais).
8. Concentra-se os extractos orgânicos reunidos num evaporador rotativo para isolar os lípidos neutros como um sólido esverdeado (p.f. ≈ 60 -. 70 ° C).
9. Acidifica-se a fase aquosa com HCl (6 M, atpH ~ 2 tal como indicado por papel de pH).
10. Extrai-se a ácidos gordos livres (AGL) a partir da fase aquosa acidificou-se com hexanos (Equivolume para a fase aquosa), utilizando um funil de separação de 1 L como descrito nos passos 3.5 e 3.6.
11. Remover os hexanos num evaporador rotativo para se obter os FFAs como um resíduo verde escuro quase preto oleoso (líquido a temperaturas> 30 ° C).

4.Catalisada por ácido de esterificação de ácidos graxos livres e Produção de Biodiesel Verde

1. Transferir os FFAs utilizando metanol: clorofórmio (1: 1, 6 x o volume de óleo de algas) para dissolver primeiro os FFAs e, em seguida, vertendo-a em um balão de reacção de alta pressão de paredes grossas equipado com uma barra de agitação.
2. Adicionar H ₂ SO ₄ concentrado (20% w / w óleo de algas), selar o frasco, e aquecer a mistura a 90 ° C enquanto se agitava durante 1 hora.
3. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, transferir a mistura vertendo-a em uma ampola de decantação.
4. Adicionar _H2O (2 x volume de óleo de algas), agitar a ampola de decantação, e permitir que as fases se separem.
5. Drenar a camada de fundo para um balão de fundo redondo pré-pesaram-se e concentra-se num evaporador rotativo. Registar a massa do biodiesel resultante.
6. Analisar o perfil de ácidos graxos por cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (GC-FID) ²⁸ (cromatógrafo a gás equipado com um DB-88 [(88% cyanopropyl) methylarylpolysiloxane] em coluna (30 mx 0,25 milímetros de espessura x 0,20 uM ID película).
   Nota: ésteres metílicos de ácidos gordos comuns são verificados por comparação do tempo de retenção com amostras autênticas obtidas comercialmente. Além disso, cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS; cromatógrafo de gás acoplado a um detector selectivo de massa) é realizada sob condições idênticas de programa de temperatura e coluna para analisar os componentes, tais como C18: 4 para os quais não há padrões autênticos estão disponíveis com os resultados aplicado para GC quantificação.

5. Biodiesel Descoloração

1. Aqueça o biodiesel de cor verde-escuro a 60 ° C num balão de fundo redondo equipado com uma barra de agitação.
2. Adicionar montmorilonite K 10 (MK10) em pó (10-20% w / w do biodiesel) e agita-se durante 1 h.
3. Remover o fundo redondo a partir do calor e deixar a solução arrefecer até à temperatura ambiente.
4. Prepara-se uma aparelho de filtração constituído por um balão de fundo redondo e divertido filtroNel contendo um papel de filtro de celulose (Ash 0,007%).
5. Verter o biodiesel descorada arrefecida através do funil de filtro, utilizando uma quantidade mínima de hexanos para enxaguar o balão de fundo redondo.
6. Desligue o funil de filtração do balão de fundo redondo (este agora contém uma solução de hexano do biodiesel descorada) e remover os hexanos com um evaporador rotativo para se obter um / biodiesel laranja vermelha.
7. Armazenar as amostras a 4 ° C tempo durante o qual (~ 10% w / w) irá ocorrer alguma deposição de material insolúvel.
8. Remover o material insolúvel por decantação ou filtração, tal como descrito no passo 5.4 e 5.5 para produzir um biodiesel homogénea clara para análise.

6. Isolamento e purificação de Alkenones dos lípidos neutros

1. Dissolve-se os lípidos neutros (do passo 3.8) em uma quantidade mínima de diclorometano (cerca de 50 ml para 10 gramas de lípidos neutros) e adicionar a solução com uma pipeta para o topo de uma coluna de cromatografia (O.D de 60 mm, ID de 55 mm, comprimento de 18 ") contendo gel de sílica (230-400 mesh, 100 g).
2. Elui-se a solução através de sílica com pressão (~ 5 psi) utilizando diclorometano (aproximadamente 150 ml) como solvente e recolher o eluente no balão de 250 ml de fundo redondo.
3. Remover o diclorometano com um evaporador rotativo para dar um sólido cor de laranja.
4. Recristaliza-se o sólido utilizando hexanos, adicionando cerca de 100 ml de hexanos em ebulição, seguido por incrementais de quantidades adicionais de hexanos em ebulição, até a solução ficar homogénea (volume total de ~ 150 mL). Em seguida, arrefecer lentamente a solução até à temperatura ambiente para promover a cristalização.
5. Recolher os alkenones cristalizados usando um aparelho de filtração, tal como descrito no passo 5.4 utilizando uma pequena quantidade de (0 ° C) de hexanos frios para enxaguar o balão.

Antes do processamento, a pasta Isochrysis (pasta Iso-) foi seco em primeiro lugar. Isto foi convenientemente realizado em maior escala por adição do -paste ISO para um grande prato de cristalização e permitindo que o material a secar ao ar à temperatura ambiente. Durante a secagem, algumas formas de água reunidas (geralmente de cor avermelhada) que pode ser removido por decantação ou pipetagem de acelerar o processo de secagem. Após cerca de 48-96 horas, a Isochrysis agora seca pode ser raspada para fora do prato de cristalização e obtido como um material floculento branco / verde com um cheiro algas semelhante (Figura 2). Os rendimentos de biomassa seca era geralmente de 20% w / w da pasta como anunciado. Em contraste, o produto em pó Isochrysis (pó Iso-) foi um amarelo-castanho, finamente moído, pó seco (95% seco) que foi utilizado directamente sem mais processamento (Figura 2).

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Figura 2. Comparação de pasta de Isochrysis. Isochrysis comercial (80% de humidade) é espalhado ao longo da parte inferior de um prato de cristalização e deixado a secar ao ar à temperatura ambiente durante 48-96 horas antes do processamento. O Isochrysis seca resultante é obtido como um material escamosa de cor escura (à direita), que é diferente na aparência do que o pó seco comercial Isochrysis (esquerda). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Extracção, quer do Iso pó -paste ou Iso- seco por Soxhlet com hexano deu origem, após a remoção dos hexanos, óleos de algas (H-ao) que eram semelhantes na aparência como / quase preto sólidos (p.f. verde-escuro. ~ 50 -60 ° C). Rendimentos de h-AO quando se inicia a partir da pasta ( "Iso- paste-Hao") Foram tipicamente de 20% w / w da biomassa seca Isochrysis, consistente com os nossos resultados anteriores, 26 ao passo que o rendimento de H-AO Soxhlet por extracção do Isochrysis em pó comercial (" Iso- pó-Hao ") foram de 15% w / W (Tabela 1).

Tabela 1. Rendimentos de produto a partir da biomassa Isochrysis comercial.

Acilgliceróis do h-AO foram convertidos nos sais de carboxilato solúveis em água correspondentes (isto é, sabões) após a adição de KOH aquoso em metanol / CH 2 Cl 2. lípidos neutros incluindo alkenones foram, em seguida, extraiu-se a partir desta mistura aquosa por partição selectiva com hexanos. Após a remoção dos lípidos neutros, reacidification dos sabões em seguida produziu os ácidos gordos livres correspondentes (FFAs) que podem ser extraídos de modo semelhante a partir do aqfase ueous com hexanos. As recuperações de massa globais para FFAs combinados e lipídios neutros a partir de qualquer Iso- paste-Hao ou Iso -Pó-Hao foram consistentemente perto quantitativa. No entanto, a proporção de produtos (isto é, lípidos neutros + FFAs) foi diferente. A partir da pasta Iso--Hao obteve-se 60% ​​(w / w) FFAs e 40% (w / w) lípidos neutros (Tabela 1). Por outro lado, iso- pó-Hao provou enriquecido em lipídios neutros (média = 54% de lipídios neutros + 46% FFAs), conforme descrito na Tabela 1.

A esterificação dos FFAs com H 2 SO 4 e, em seguida, o metanol produzido ésteres de ácido gordo de metilo (FAMEs, ou seja, biodiesel) como um verde escuro perto líquido oleoso preto com um rendimento de 90% maior que (Figura 3). Descoloração por aquecimento ao longo Montmorillonita K10 29 (MK10) argila, em seguida, deu um produto amarelo / laranja, similar na aparência ao outro bi comercialcombustíveis odiesel (veja Lista de Materiais) (Figura 3). Os resultados da análise FAME de combustíveis de biodiesel Isochrysis descorada estão apresentados na Tabela 2.

Figura 3. Comparação de Isochrysis e soja combustíveis biodiesel. Verde Isochrysis biodiesel (meio) é produzido por esterificação de ácidos gordos livres extraído e purificado. Descoloração produz um produto (à direita) com propriedades semelhantes ao biodiesel comercial (esquerda). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 2. Composição FAME de biodiesel produzido a partir de -past Iso comercial e Iso -Pó biomassa Isochrysis.

Lípidos neutros foram obtidos como uma mistura sólida esverdeada a 40% w / w da Iso--paste Hao e 54% (AVG.) A partir do pó-Hao Iso- (Tabela 1). Filtrar os lipídios neutros dissolvidos através de sílica, utilizandoDCM deu após a remoção do solvente, um avermelhado / sólido cor de laranja que pode ser recristalizado com hexano para se obter alkenones analiticamente puro como um sólido branco. Este procedimento resultou em 16% (w / w) rendimento isolado da alkenones de Iso- paste-Hao e rendimento de 25% a partir de Iso -Pó-Hao (Tabela 1).

A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente para fins de fornecimento de informações específicas e não implica recomendação ou endosso do Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um provedor e empregador de oportunidades iguais.