Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela Burnetii Coxiella Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii é um patógeno intracelular único que faz com que a febre Q infecção humana zoonótica. Esta doença está associada a um largo espectro de apresentações clínicas que se prolongam a partir de seroconversão assintomática para infecção crónica com risco de vida que frequentemente se manifesta como endocardite anos após a exposição ^1. A infecção humana ocorre principalmente através da inalação de aerossóis contaminados com ruminantes o principal reservatório para infecção, em particular, vacas leiteiras, ovelhas e cabras. Embora a infecção por Coxiella nestes animais é normalmente subclínicas, a infecção pode desencadear o aborto e a carga bacteriana considerável dentro do fluido de parto e da placenta podem contaminar o ambiente local ^1. Um exemplo da enorme carga tal contaminação pode ter sobre a saúde pública e indústria da agricultura foi observada recentemente no surto de febre Q que ocorreu na Holanda ^2. Entre 2007 e2010, mais de 4.000 casos humanos de febre Q foram diagnosticados e este surto estava ligada à contaminação significativa de cabra cultiva ^3. Além disso, Coxiella é uma potencial arma biológica, como classificado pelos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças, devido à estabilidade ambiental das bactérias e de baixa dose infecciosa necessária para causar morbidade e mortalidade ⁴ grave.

Coxiella existe em duas fases: Fase I organismos, isoladas de fontes naturais, são extremamente virulenta e Fase II organismos são altamente atenuado in vivo. Por exemplo, depois de várias passagens in vitro em Coxiella burnetii de nove milhas Fase I organismos, bactérias em fase II foram produzidos que contêm uma deleção cromossómica irreversível resultando em lipopolissacárido truncada (LPS) ^5. Esta linhagem, C. burnetii NMII, é fenotipicamente semelhante à Fase I em modelos de cultura de tecidos e fornece um modo mais segurol para os investigadores a estudar patogênese Coxiella em laboratórios ^5. Nos últimos anos, vários avanços têm avançado rapidamente no campo da genética Coxiella. Mais notavelmente, o desenvolvimento de meios axénica (acidificada forma cisteína citrato - ACCM-2) permitiu o crescimento isento de células de Coxiella em líquidos e sólidos em meios de ^6,7. Isto resultou na melhoria directa de ferramentas genéticas disponíveis para Coxiella, incluindo um sistema de expressão indutível de genes, vectores de transporte e sistemas de transposões aleatórios ^8-11. Mais recentemente, dois métodos para a inativação do gene alvo também foram desenvolvidos, abrindo o caminho para examinar os candidatos de genes de virulência específicos ^12.

Após internalização por macrófagos alveolares, Coxiella replica para números elevados dentro de um compartimento ligado à membrana denominado o Coxiella- contendo vacúolo (CCV). O CCV requer tráfico endocítica hospedeiro thásperas precoces e tardias endossomas até que amadurece em uma organela derivados do lisossoma ^13. Ao longo deste processo, o CCV adquire factores do hospedeiro que quer aparecer transitoriamente ou permanecer associado com o vacúolo, incluindo, mas não limitado a, Rab5, RAB7 proporcionou, CD63 e ^LAMP-13-15 janeiro. A replicação de Coxiella dentro das células hospedeiras é inteiramente dependente de um Dot / Icm Tipo IVB Secreção sistema totalmente funcional (T4SS) ^8,16,17. Este sistema de secreção seja uma estrutura multi-proteína ancestral relacionada com sistemas de conjugação e abrange ambas as membranas bacterianas e vacuolares para administrar proteínas bacterianas, denominado efectores, para o citoplasma de acolhimento ^18. O Coxiella T4SS é funcionalmente muito semelhante ao tipo IVB Dot / Icm sistema de secreção bem caracterizado de Legionella pneumophila ^19,20. Curiosamente, a activação do T4SS e subsequente translocação efector não ocorre até que atinge o lisossoma Coxiella derivada ácidaorganela, aproximadamente 8 horas pós-infecção ^17,21. Até à data, mais de 130 effectors Dot / ICM foram identificados ^9,17,22-24. Muitos destes efectores provavelmente desempenham um papel importante durante a replicação de Coxiella dentro das células hospedeiras; no entanto, apenas alguns efetores foram caracterizados funcionalmente ^25-29.

Neste estudo nós utilizamos um ensaio de fluorescência com base translocação que se baseia na clivagem do substrato CCF2-AM FRET (daqui em diante referido como o substrato BlaM) através da actividade β-lactamase dentro do citoplasma da célula hospedeira (Figura 1). O gene de interesse é fundida com a TEM-1 β-lactamase (BlaM) em um plasmídeo repórter que proporciona a expressão constitutiva. O substrato BlaM é composto por dois fluoróforos (cumarina e fluoresceina) que formam um par de FRET. Excitação da cumarina resultados em FRET da fluoresceína e emissão de fluorescência verde na ausência de translocação efectora; No entanto, se o Blaproteína de fusão M-efectora é translocado para dentro do citoplasma de acolhimento, a resultante β-lactamase cliva o anel de actividade β-lactama do substrato BlaM, separando o par de FRET produzindo emissão de fluorescência azul seguinte de excitação. Este ensaio de translocação foi bem comprovada como uma abordagem para identificar proteínas efectoras a partir de uma gama de diferentes bactérias intracelulares e extracelulares, incluindo C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, E. enteropatogênica coli, Salmonella e Brucella ^17,30-35.

Para determinar o papel dos factores do hospedeiro específicas sobre Coxiella efetoras translocação nós utilizamos um método bem estabelecido para o silenciamento do gene conhecido como interferência de RNA, em particular as pequenas interferência RNA (siRNA). Originalmente identificado em Caenorhabditis elegans, a interferência RNA é um processo celular endógena conservada usado para defe inataNSE contra vírus, bem como do gene regulação ^36,37. Após a ligação do siRNA específica da sequência, a degradação de ARNm ocorre através RISC (induzida por complexo de ARN de silenciamento) resultando no silenciamento de genes específicos ou knockdown ^38. Neste estudo, siARN foi usada para alvejar duas proteínas do hospedeiro, e Rab5A Rab7A, que são reguladores importantes da via endocítica. O impacto de silenciar Rab5A e Rab7A na translocação efetoras foi determinada segundo C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 foi selecionado como foi mostrado anteriormente para ser translocado pelo sistema de secreção de Dot / Icm de Coxiella ^17.

Utilizando tanto o silenciamento do gene siRNA e no ensaio de translocação fluorescencebased descrito aqui, estamos começando a estabelecer um papel para fatores do hospedeiro na translocação de proteínas efetoras por Coxiella. Esta abordagem pode ser aplicada a uma vasta gama de bactérias tanto intracelulares e extracelulares que possuem secretio semelhantesistemas n responsáveis ​​pela translocação de proteínas efectoras.

Nota: Todos os procedimentos que envolvem o crescimento ou a manipulação de Coxiella burnetii RSA439 NMII deve ser realizada em um Contenção Nível Físico 2 Laboratório e dentro de uma cabine de segurança biológica em conformidade com as directrizes locais. Um diagrama esquemático do fluxo de trabalho de transfecção e ensaio de translocação inversa descrito abaixo é mostrado na Figura 2.

1. Preparação de C. burnetii Cultura Expressando CBU0077 fundido com p-lactamase (pBlaM-CBU0077) (dia 1)

1. Prepare 1X ACCM-2 ^6:
   1. Combinam-se as componentes listadas na Tabela 1. Ajustar o pH a 4,75 com NaOH 6 M e esterilizar filtro (não autoclave). ACCM-2 é estável durante cerca de três semanas armazenados a 4 ° C.
2. Gerar C. stocks burnetii pBlaM-CBU0077.
   1. Infect HeLa 229 células com o C. estirpe burnetii transportando pBlaM-CBU0077 e passagem até grande vacuolES são observados na maioria das células.
      1. Cresça o C. burnetii estirpe transportando pBlaM-CBU0077 em 20 ml ACCM-2 que contém 3 ug / ml de cloranfenicol em um balão de cultura de 75 centímetros ^dois tecidos com tampa ventilada durante 7 dias a 37 ° C em 5% de _CO2, 2,5% de _O2.
      2. Centrifugar a C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15000 × g durante 15 min à temperatura ambiente.
      3. Re-suspender o sedimento em 20 mL de DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 3 ug / ml de cloranfenicol (meio de manutenção). Remova a mídia a partir de um 50% confluentes 75 ^cm2 frasco de células HeLa 229. C. Adicionar re-suspenso burnetii a células HeLa 229. Incubar durante 2 dias a 37 ° C em 5% de _CO2 para permitir que a infecção das células de HeLa de 229 a estabelecer.
      4. Células dividido em 175 ^cm2 frasco de cultura de tecidos.
         1. Remover o meio do frasco de 75 ^cm2 e lava-se a monocamada com duas vezes 10 ml de PBS pré-aquecido.
         2. Adicionar 1 ml de oF 0,05% de tripsina-EDTA células solução e local em CO ₂ temperatura de 37 ° C + 5% durante 3 - 5 minutos para separar as células.
         3. células re-suspensão em 10 ml de meio de manutenção. Adicionar 2 ml de células ressuspensas em um ² frasco de 175 cm, que inclua 38 ml de meio de manutenção.
         4. Incubar a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante mais 3 - 5 dias até 100% de confluência é atingido e são observadas grandes vacúolos.
   2. Recolher o sobrenadante do frasco de 175 cm ^2, adicionam-se 10 mL _{de dH2O} para cobrir as células HeLa infectadas 229 e incubar durante 15 min para lisar as células infectadas.
   3. Combinar o sobrenadante e as células lisadas e a pelete a 15000 × g durante 15 min à temperatura ambiente.
   4. Re-suspender pellet em 10 ml de dH ₂ O. Lisar as células por mais passando repetidamente a re-suspensão através de uma agulha 23G ligada a uma seringa de 10 ml, pelo menos, 20 vezes. Pelete a 500 x g durante 5 min para remover os detritos celulares.
   <li> Retirar sedimento e sobrenadante a 15000 × g durante 15 min à temperatura ambiente para recolher C. burnetii.
3. Re-suspender C. burnetii em DMEM + FCS a 10% e a quantificação do número de bactérias como por 4. Diluir com 1 x 10 genomas ⁹ / ml, utilizando meio DMEM + FCS a 10% + 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), alíquota de 50 ul das existências em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C.

2. transfecção Reverso de siRNA e semeadura de HeLa 229 Cells (DIA 4)

1. Quando se utiliza o siRNA experimental para a primeira vez prepararo siARN da seguinte forma:
   1. Resumidamente centrifugar o siRNA liofilizou-se para garantir que o grânulo siRNA é recolhido no fundo do tubo.
   2. Re-suspender o siRNA sedimentadas a uma concentração final de 20 estoque uM pipetando o volume adequado de tampão 1x siRNA (Tabela 2).
   3. Pipetar a solução cima e para baixo 3 - 5 vezes para misturar e colocar num misturador orbital durante 30 min à TA, invertendo o tubo a cada 5-10 min.
   4. Resumidamente Centrifugar o tubo para garantir o siRNA é recolhido na parte inferior do tubo.
   5. Alíquota o siRNA em 50 mL alíquotas em tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C até ser necessário.
   6. Para gerar 1 fiM de concentração de ARNsi de trabalho, pipeta de 950 uL de tampão 1X siARN em uma aliquota de 50 ul de estoque (20 mM) quando necessário. Nota: Esta concentração de trabalho 1? M pode ser congelar-descongelado várias vezes para transfecções repetidas.
2. Coloque DMEM + FCS a 10%,; 0,05% de tripsina-EDTA e PBS num banho de água a 37 ° C (ou equivalente) durante 30 minutos para aquecer antes da utilização.
3. Preparação de componentes de transfecção:
   Nota: O protocolo seguinte foi optimizado para as células de HeLa 229 numa microplaca de 96 poços, com paredes pretas e fundo transparente plana. A optimização da quantidade de reagente de transfecção, a concentração de siRNA e semeadura densidade das células pode ser necessário para diferentes linhas de células.
   1. Para cada poço, usar 0,1 mL de reagente de transfecção, 15,9 ul de meio de soro reduzido (meio essencial mínimo utilizado para transfecções, referem-se a tabela de materiais) e 4 ul de 1 uM de siRNA (resultando numa concentração final de 40 siARN nM). Utilize tubos de microcentrífuga separados para OTP, PLK1, Rab5A e Rab7A. Meça cada condição de ensaio em triplicado. Um exemplo de uma disposição da placa de 96 poços é mostrado na Figura 3.
      Nota: Este protocolo inclui a utilização de dois controlos: OTP e PLK1. OTP écomposto por quatro siARN reunidas que foram optimizados para reduzir os efeitos fora do alvo e, assim, OTP é usado como um controlo negativo, não segmentação. Mexidos siRNA também poderia ser utilizada como um controlo negativo. A perda de resultados de expressão PLK1 na morte celular extensiva em um número de linhas de células através da indução de vias pró-apoptóticos e, por conseguinte, PLK1 siRNA é utilizado como controlo positivo para a transfecção em que a morte celular correlaciona-se a eficácia de transfecção.
      1. Para cada transfecção siRNA experimental, combine médio reduzido de soro de 0,4 mL de reagente de transfecção e 63,6 ul em um tubo de microcentrífuga individual. Vortex todos os tubos de microcentrífuga e permitir que os componentes de complexo durante 5 min à TA.
      2. Adicionar 16μl de cada siRNA experimental para os correspondentes tubos de microcentrífuga contendo o complexo de transfecção. Vortex e incubar durante 20 min à TA. Nota: É importante que não se exceda 30 minutos, como a eficiência de transfecção irá diminuir.
4. Durante o 20 min incubation (2.3.1.2) adicionar 20 ul do reagente de transfecção + médio reduzido de soro + siRNA misturar nos poços apropriados de uma bandeja estéril preto, plana clara bottom 96 poços.
5. Assim que o período de incubação de 20 min é completa, semente de HeLa de 229 células a uma densidade de 3,92 x 10 ³ células / poço.
   1. Colheita de HeLa de 229 células confluente ou 75 cm balão de cultura de ² tecidos sub-confluente em meio DMEM pré-aquecido + 10% de FCS e as células re-suspensão para uma densidade final de 4,9 x 10 ⁴ culas / ml, tal como por métodos padrão. Para assegurar a eficiência de transfecção não é comprometida, preparar células durante o período de incubação de 20 min (2.3.1.2).
      1. Lavar a monocamada de células HeLa 229 duas vezes com 10 ml de PBS pré-aquecido.
      2. Adicionar 1 ml de 229 células 0,05% solução de tripsina-EDTA e local HeLa em CO ₂ 37 ° C + 5% para o 3 - 5 min para separar células.
      3. Recolher as células em 9 ml de pré-aquecida DMEM + 10% FCS. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e preparar as células para uma densidade final de 4,9 x 10 ⁴ culas / ml, utilizando meio DMEM + FCS a 10%.
   2. Pipetar 80 ul de células HeLa 229 com uma densidade de 4,9 x 10 ⁴ culas / ml em cada poço que contém o reagente de transfecção + reduzido de soro siARN meio + mistura. Isto corresponde a uma densidade celular de 3,92 x 10 ³ células / poço.
      Nota: A subtração é necessário para o substrato BlaM.
      1. Não adicionar células ou siRNA para "em branco" poços (Figura 3). Em vez disso, adicionar 80 mL de DMEM + 10% FCS a estes poços criados em triplicado.
   3. Incubar durante 24 horas a 37 ° C + 5% de CO _2.

3. Mudar mídia (DIA 5)

1. Depois de 24 horas, remover a mídia usando um adaptador multicanal ligado a uma fonte de vácuo ou manualmente com uma pipeta multi-canal, e substituir com 100 l de Pré-aquecer frescoEd DMEM + 10% FCS.
2. Incuba-se durante mais 48 h a 37 ° C + 5% de CO _2.
3. Neste ponto, verifique a viabilidade das células visualmente utilizando um microscópio de luz padrão. Se a transfecção inversa tem sido bem sucedida, a morte celular significativa será observada nos poços contendo siARN PLK1 em comparação com OTP siARN.

4. Quantificação de Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 estirpe utilizando qPCR (dia 7)

1. Após 7 dias de crescimento em ACCM-2 a 37 ° C em 5% de _CO2, 2,5% de O ₂ (1,3), centrifugar a 10 ml C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15000 × g durante 15 min à temperatura ambiente.
2. Re-suspender o sedimento bacteriano em 10 ml de pré-aquecida DMEM + 10% FCS. Prepare a 1:10 e 1: 100 diluições da cultura (amostra), utilizando _dH2O
3. Defina-se os componentes necessários para a qPCR.
   Nota: ADNg extracção pode ser realizada com antecedência e guardadas a -20 ° C untIL necessária.
   1. Preparação de padrões:
      1. Extrair a partir de ADNg Coxiella burnetii RSA439 NMII estirpe de tipo selvagem cultivadas em ACCM-2 a 37 ° C em 5% de _CO2, 2,5% de O ₂ durante 7 dias, usando um kit de extracção de ADNg, de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Medir a concentração ADNg (g / mL) utilizando uma Nanodrop (ou equivalente) a uma absorvância de 260 nm.
      3. Calcular o número de cópias do genoma por ul usando a seguinte fórmula abaixo, e converter-se ao número de genomas / ml.
         
      4. Ajustar o número de genomas / ml a 10 / ml ^(9, num volume final de 100 ul) num tubo de microcentrífuga novo usando _dH2O Isto pode ser fervido durante 10 min e armazenadas a -20 ° C até ser necessário.
      5. No dia da infecção, gerar 10 diluições em série de 10 ⁸ genomas / ml a 10 / ml ⁵ genomas do genoma ⁹ 10s / ml.
         1. Pipetar 10 ul de 10 ⁹ genomas / mL em 90 mL de _dH2O para gerar 10 ⁸ genomas / ml. Vortex para misturar. Pipetar 10 ul de 10 ⁸ genomas / mL em 90 mL de _dH2O para gerar 10 ⁷ genomas / ml. Vortex e repita até 10 ⁵ genomas / ml.
   2. Configurar reação qPCR. Criar uma mistura mestre para 25 poços para compensar eventuais erros de pipetagem. Para cada cavidade, 10 ul usar qPCR Master Mix; 2 ul de mistura de iniciadores (ompA 4.3.2.2) e 3 uL de _dH2O
      Nota: OmpA é uma proteína da membrana externa da C. burnetii ^'39 e uma secção de 82 pares de bases dentro de uma região altamente conservada foi seleccionado para ser utilizado como uma sonda como anteriormente descrito ^40.
      1. Configurar cada padrão (dH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ genomas / ml) e amostras (1:10 e 1: 100 de diluição) em uma de 96 cavidades de PCR arrancar a placa (não-contornado) em duplicado ou triplicado, respectivamente. Adicionar 5 mL de amostra ou padrão nos poços apropriados.
      2. Usando _dH2O, diluir tanto o iniciador directo ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') e o iniciador inverso OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') para uma concentração final de 4 | iM e combinam no mesmo tubo de microcentrífuga.
         Nota: A mistura de iniciadores de ompA pode ser preparado antecipadamente e guardado a -20 ° C até ser necessário.
      3. Combinar 250 mL de qPCR Master Mix, 50 ul de mistura de iniciadores de ompA, 75 uL _{de dH2O} e agitar com vortex para misturar. Adicionar 15 ul desta mistura principal para poços contendo os padrões ou de amostras.
      4. Colocar 8-tampa tampas tira de PCR para os poços apropriados e centrifugar de pulso dos tubos PCR para garantir que tudo está recolhidos no fundo dos tubos.
      5. Configure o seguinte programa em uma ma PCR quantitativolombo: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 1 segundo e 60 ° C durante 20 segundos (Figura 4A).
   3. Analisar o Ct (limiar de ciclo) valores do qPCR:
      1. Transferir os valores de Ct para uma planilha usando a função de exportação do programa.
      2. Criar um gráfico de dispersão das normas 10 ⁵ genomas / ml até 10 ⁹ genomas / ml (expressas como valores de log). Descarte os valores atípicos óbvios entre as amostras em triplicado. Gerar uma linha de tendência logarítmica e determinar a equação do gráfico.
      3. Calcular o número total de genomas / mL na amostra usando a equação gerada em 4.3.3.2. Não se esqueça de ter em conta a diluição inicial (1:10 e 1: 100) das amostras.

5. Infecção de reverso células transfectadas (dia 7)

1. Depois de calcular o total de genomas / ml no C. carrapichocultura netii pBlaM-CBU0077 para ser utilizada para a infecção, ajustar cultura bacteriano ressuspenso para infectar células a um MOI de 300 num volume final de 50 ul / poço, utilizando pré-aquecido DMEM + 10% FCS.
   Nota: A densidade esperada de células HeLa semeadas 229 com um tempo de replicação normal após 72 horas é 3.136 x 10 ⁴ células / poço. A quantidade de bactérias necessárias para infectar a uma MOI de 300 é 9,408 x 10 ⁶ em 50 mL, o que equivale a 1,88 x 10 ⁸ bactérias / ml.
   1. Utilizando o valor calculado a partir dos genomas de qPCR (/ ml) (4.3.3.3), diluir as bactérias re-suspensas usando pré-aquecido DMEM + FCS a 10% num volume final de 2 ml para infectar as células transfectadas reversa.
2. Remova a mídia existente a partir do branco e células transfectadas reversa.
3. Adicionar 50 ul de bactéria diluída (1,88 x 10 ⁸ bactérias / ml) aos poços apropriados. Adicionar 50 ul de DMEM + FCS a 10% para ambos o branco e upoços ninfected.
4. Incubar durante 24 horas a 37 ° C + 5% de CO _2.

6. A adição de BlaM Substrato para determinar o nível de translocação (DIA 8)

1. Prepare as soluções para a solução 6x carregamento de substrato BlaM.
   Nota: Solução A, B e C são fornecidas no kit substrato BlaM (Consulte a Tabela de Materiais). Solução B podem formar um precipitado à temperatura ambiente. Aquecer esta solução a 37 ° C antes de usar e o precipitado deve dissolver.
   1. Quando se utiliza o kit para o primeiro tempo, adicionar 185 ul de DMSO (fornecido com o kit de substrato BlaM) à solução dessecada A. Subsequentemente, armazenar o ressuspenso Uma solução a -20 ° C.
   2. Preparar solução 0,1 M probenicide antecipadamente e armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 ° C até ser necessário.
      1. Prepare de NaOH 0,4 M (1,6 g em 100 ml _{de dH2O).}
      2. Prepare Na 100 mM de tampão fosfato de pH 8 (1,56 g de NaH ₂ PO ₄ .2H ₂ HPO ₄ em 100 ml _{de dH2O).}
      3. Dissolve-se 1,25 g de probenecid em 22 ml de NaOH 0,4 M, por agitação vigorosa.
      4. Adicionar 22 ml de Na 100 mM de tampão de fosfato a pH 8 (solução torna-se turva) e agitar para dissolver o precipitado que se forma.
      5. Ajustar o pH a 8 (se necessário) usando M NaOH / HCl 1.
      6. Mexa vigorosamente e aquecer ligeiramente (<50 ° C) até que a solução é mais clara.
      7. Filtro (0,2 um de tamanho de poro) e alíquota em volumes de 1 mL. alíquotas armazenar a -20 ° C.
2. Para cada poço, usar 0,06 ul de solução A, 0,54 mL Solução B, 7,9 ul de solução C e 1,5 ul de 0,1 M de probenicida. Criar uma mistura principal para os 30 poços por primeiro combinando 1,8 mL de solução A e 16,2 ml de solução B em conjunto num tubo de microcentrífuga. Misturar bem utilizando um vortex. Adicionar 237 ul de solução C e 45 ul de 0,1 M de probenicida. Vortex de combinar todas components.
   Nota: A solução 6x carregamento é estável durante até 4 horas (no escuro), mas deve ser preparado tão próximo quanto possível antes da utilização.
3. Adicionar 10 ul da solução 6x carregamento directamente em todos os poços em branco e inverter transfectadas sem retirar os meios de comunicação existentes.
4. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 2 horas no escuro.
5. Para determinar o nível de translocação, quantificar a quantidade de fluorescência utilizando um leitor de microplacas.
   Nota: O procedimento seguinte é específico para o leitor de microplacas ClarioSTAR. leitores de microplacas equivalentes podem também ser utilizados.
   1. Criar um novo protocolo de intensidade de fluorescência usando endpoint como o modo de leitura.
   2. Ajustar os parâmetros básicos da seguinte forma:
      1. Escolha de microplacas de 96 poços.
      2. Em Configurações de óptica, selecione 2 multichromatics com as seguintes configurações definidas pelo utilizador: (1) Entrada 410-10 nm de excitação e de emissão 520-10 nm. (2) entrada de excitação 410-10 nm e emissão 450-10 nm. Assegurar o bem multichromatics é selecionado.
      3. Escolha média orbital com um diâmetro de 3 mm.
      4. Sob óptica, selecione óptica inferior.
      5. Sob velocidade e precisão, selecione preciso. Isto corresponde a oito regiões por poço.
   3. Ajustar o layout da placa escolhendo os poços apropriados como amostras.
   4. Seleccione a medição inicial.
   5. Retire a tampa e coloque a bandeja no leitor de placas. Para evitar atingir valores máximos de fluorescência, garantir o valor de ganho é ajustado. Para fazer isso, realizar um ajuste de ganho de um dos poços infectados que foi transfectada com o OTP inversa siARN. Isto corresponde à maior translocação esperado.
   6. Seleccione a medição início para medir todos os poços apropriados usando fluorescência de fundo em uma excitação de 410 nm e emissão de ambos os 450 nm e 520 nm para a fluorescência azul e verde, respectivamente.

7. Análise dos Resultados:

1. Calcular a proporçãode 450 nm a 520 nm (azul para verde) para todas as amostras após redução em branco e expressa em relação à amostra não infectado OTP.
   Nota: as seguintes etapas de análise são fornecidas para um programa de planilha simples.
   1. Usando a função de exportação no leitor de microplacas, transferir os valores de fluorescência brutos obtidos tanto para 520 nm e 450 comprimentos de onda de emissão nm (6.5) em uma planilha.
   2. Calcula-se a média do "branco" leituras (meios apenas, sem células) para o comprimento de onda de 520 nm por adição de 520 nm, valores de fluorescência matérias e dividindo-se pelo número de poços (3). Repita usando os valores de 450 nm de comprimento de onda em branco. Estes valores representam a fluorescência de fundo, devido à placa de 96 poços e meios de comunicação.
   3. Subtrair a fluorescência de fundo. Utilizando os valores obtidos em 7.1.2 subtrair a média do comprimento de onda de 520 nm em branco a partir de todos os valores de fluorescência da amostra 520 nm. Repita o procedimento para os valores de 450 nm de comprimento de onda.
   4. Para obter o 450: a relação nm 520 utiliza os valores corrigidos em branco (7.1.3). Dividir cada valor de fluorescência da amostra a 450 nm, por seu valor de 520 nm correspondente.
   5. Calcula-se a média dos valores da relação de OTP não infectadas através da adição de 450: valores de relação 520 nm (a partir de 7.1.4) e dividindo-se pelo número de poços (3).
   6. Calcula-se a razão entre as amostras em relação a OTP não infectado dividindo a 450: 520 nm, relação em 7.1.4 calculada pela média do valor não infectado OTP proporção calculada em 7.1.5.

8. Adição de Núcleos Stain para determinar o número de células após a translocação Assay (DIA 8)

1. Após quantificação de fluorescência, remover meios que contêm solução de carregamento 6x de todos os poços usando um adaptador de multi-canal ligado a uma fonte de vácuo ou manualmente com uma pipeta multi-canal.
2. Adicionar 50 ul de solução a 4% de PFA (paraformaldeído)em PBS a todos os poços adequados para fixar as células. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
3. Remover 4% PFA solução PBS (como por 8.1) e lavar as células duas vezes com 75 ul de PBS.
4. Adicionar 50 ul de um corante nuclear permeável de células, por exemplo, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole), a cada poço. Aquisição de imagens com um microscópio de fluorescência e quantificar o número de núcleos presentes em cada poço após o tratamento siRNA usando o software de análise de imagem apropriado, tal como ImageJ ^41.

Para este estudo, a C. burnetii pBlaM-CBU0077 estirpe foi seleccionada como CBU0077 tem sido mostrado previamente para ser um efector translocado do sistema de secreção de Coxiella Dot / Icm 17. Antes da infecção, o número total de genomas / ml no sete dias C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 foi enumerada utilizando qPCR. A Figura 4 demonstra um exemplo do ciclo limiar (Ct) valores esperados a partir de ambos os padrões e as amostras seguintes qPCR. Os valores Ct (representados graficamente na amplificação Lote (Figura 4B) e numericamente (Figura 4C)) foram exportados e analisados ​​como descrito em 4.3.3. Com base nos dados representativos mostrados, foram 2,31 x 10 8 genomas / ml em 10 ml de cultura bacteriana re-suspenso (Figura 4D). Para gerar a diluição bacteriana apropriada (1,88 x 10 8 genomas / ml iN 2 ml), 1,63 ml de bactérias ressuspensas foram adicionados a 370 ul de fresco, DMEM + FCS a 10% pré-aquecido. As células transfectadas com ARNsi reversa foram subsequentemente infectadas com C. burnetii pBlaM-CBU0077 a uma MOI de 300 durante 24 h.

Após incubação do reverso células infectadas transfectadas com substrato BlaM quantificação de translocação efectora pode ser determinada utilizando um leitor de placas de fluorescência. Após a análise, tal como descrito em 7, todos os valores de razão que têm sido normalizados para OTP não infectado também pode ser normalizada para OTP infectado. O nível de translocação efetoras após o silenciamento de genes do hospedeiro podem ser agrupadas em três resultados após comparação com infectada controle OTP: (1) Nenhuma alteração; (2) Aumento efetoras translocação; (3) A diminuição da efetoras translocação. Análise estatística subsequente, por exemplo, um teste t de Student, pode ser usado para determinar o significado de qualquer diferença observada to infectado controle OTP. O resultado do silenciamento quer Rab5A ou Rab7A na translocação efector a partir de três experiências independentes são apresentados na Figura 5A. A diminuição significativa no nível de BlaM-CBU0077 translocação ocorreu durante o silenciamento de ambos Rab5A e Rab7A relação ao controle OTP (valor p = 0,0088 (Rab5A) eo valor p = 0,0059 (Rab7A), emparelhado, teste t de Student). O impacto do tratamento siRNA na viabilidade celular também foi estabelecida. Seguindo o ensaio de translocação, as células foram fixadas, coradas com um corante núcleos e subsequentemente quantificados. Como mostrado na Figura 5C, embora o tratamento com quer Rab5A ou Rab7A resulta numa redução da viabilidade celular em comparação com o controlo OTP (12% e 31%, respectivamente), esta redução não é tão grave como PLK1 (97%), um gene conhecido para provocar a morte celular (p-valor = 0,0102 (Rab5A); valor de p = 0,0081 (Rab7A); valor de p <0,0001 (PLK1), emparelhado, teste t de Student). Estes resultados demonstram como o silenciamento de acolhimento genes utilizando siARN podem alterar negativamente os níveis de translocação bacteriana efectora.

Figura 1. O mecanismo de ação da BlaM substrato durante a infecção. C. burnetii é internalizada pelas células hospedeiras e forma um vacúolo derivadas de lisossoma denominado o vacúolo molecular contendo Coxiella. 24 h pós-infecção, as células são carregadas com a membrana de substrato BlaM permeável que possui dois fluoróforos que formam um par de FRET (A). Na ausência de β-lactamase ou seja, sem a translocação do efector BlaM-CBU0077, excitação da cumarina em 410 nm resulta em FRET para f luoresceina, observados como um sinal de fluorescência verde (520 nm) (B). no caso de um sistema de secreção de Dot / Icm funcional, a proteína de fusão BlaM-CBU0077 vai ser translocado para a célula hospedeira e serão clbeiral do substrato BlaM, através da actividade β-lactamase, causando a separação dos dois corantes e resultando em FRET perturbação e um sinal azul de fluorescência (450 nm) depois da excitação a 410 nm (C). Ambos os sinais de fluorescência verde e azul podem ser detectados utilizando um leitor de placas de fluorescência. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

. Figura 2. Esquema Visão geral do reverso transfecção e translocação Ensaio de Fluxo de Trabalho Dia 1: Preparar o C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultura Dia 4:. transfectar reversa utilizando 40 nM de ARNsi e sementes HeLa células 229 a uma densidade final de 3,92 x 10 3 células / cavidade em uma placa de 96 poços Dia 5: Ch.meios ange Dia 7:. Quantificação dos genomas totais / ml de o C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultura utilizando qPCR e, posteriormente infectar as células transfectadas reversa com um MOI de 300. Dia 8:. Adicionar corante de carregamento 6x, medir a fluorescência e quantificar o número de células por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. O layout da placa de 96 poços usado para configurar a transfecção reversa e semeadura de HeLa 229 Cells. As "em branco" poços (mostrados em vermelho) contêm exclusivamente meios de comunicação e não é necessário a adição de qualquer siRNA ou HeLa 229 células. O siARN OTP (mostrado em azul claro para poços não infectados e azul escuro para poços infectados) é utilizado como um controlo não-direccionamento, uma vez que foi optimizado paratêm menos efeitos fora do alvo. O marrom e poços verdes representam a Rab5A e Rab7A siRNA, respectivamente. PLK1 siRNA (mostrada em amarelo) é usado como uma medida da eficiência de transfecção como a perda de expressão PLK1 pode induzir vias pró-apoptóticos e morte celular extensa em uma grande maioria das linhas celulares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Os valores representativos qPCR Ct utilizado para quantificar o número total de genomas / ml em C. burnetii Cultura pBlaM-CBU0077. (A) As condições de ciclo utilizados na qPCR para enumerar o número de genomas / mL em culturas Coxiella. Os valores de Ct para ambos os padrões e as amostras são representados em gráfico (B) e numérica (C)formatos. (D) Os valores Ct padrão foram em média, representados graficamente e foi calculada uma linha de tendência logarítmica. Usando a equação e as médias dos valores Ct da amostra o número total de genomas / ml no C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 foi determinado ser 2,31 × 10 8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. A translocação do Dot / Icm Effector BlaM-CBU0077 durante siRNA silenciamento de Rab5A e Rab7A. HeLa 229 células foram transfectadas reverso com siRNA específico para Rab5A (barras marrom), Rab7A (barras verdes), OTP (barras azuis) ou PLK1 (barras amarelas) e incubou-se durante 72 h antes da infecção com o C. estirpe burnetii pBlaM-CBU0077 a uma MOI de 300 durante 24 h. Depois do Tele adição do substrato BlaM, a fluorescência foi medida utilizando um leitor de microplacas (A) O quadro mostra os valores de fluorescência em bruto obtidos a partir de uma única experiência ao lado do 450:. 520 nm, relação em relação ao controlo OTP não infectado após a subtracção dos valores em branco (meios apenas, sem células). O nível da translocação de (B) e a viabilidade celular (C) são apresentados como a percentagem média ± desvio padrão em relação a células infectadas transfectadas OTP reversa a partir de três experiências independentes. * P <0,05; ** P <0,01; **** P <0,0001 (emparelhado, t de Student -teste). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Os componentes necessários para fazer 1x ACCM-2.

Tabela 2. Volume de 1x tampão de siRNA Necessário para Hidratante liofilizado siRNA para a concentração adequada.

Os autores não têm nada a divulgar.