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Summary

Investigar as interações entre patógenos bacterianos e seus hospedeiros é uma importante área de pesquisa biológica. Aqui, descrevemos as técnicas necessárias para medir efetoras translocação por Coxiella burnetii durante o silenciamento do gene siRNA usando substrato BlaM.

Abstract

Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q, é um patógeno intracelular que se baseia em um IV Dot / Icm Secreção Sistema Tipo de estabelecer um nicho replicativo. Uma coorte de efectores são translocados através deste sistema na célula hospedeira para manipular processos de acolhimento e permitir a criação de um único vacúolo derivadas de lisossoma para replicação. O método aqui apresentado envolve a combinação de duas técnicas bem estabelecidas: o silenciamento do gene específico utilizando siRNA e medição de translocação efectora utilizando um substrato baseado em TERF que se baseia na actividade β-lactamase. Aplicando estas duas abordagens, podemos começar a compreender o papel dos factores do hospedeiro em função do sistema de secreção bacteriana e translocação efetoras. Neste estudo nós examinamos o papel dos reguladores importantes da via de tráfico endocítica Rab5A e Rab7A, ambos. Nós demonstramos que silenciar a expressão de qualquer proteína resulta em uma diminuição no translocatio efectoraeficiência n. Estes métodos podem ser facilmente modificados para examinar outros agentes patogénicos intracelulares e extracelulares que também utilizam sistemas de secreção. Desta forma, uma imagem global dos factores do hospedeiro envolvidos na translocação bacteriana efetoras podem ser revelados.

Introduction

Coxiella burnetii é um patógeno intracelular único que faz com que a febre Q infecção humana zoonótica. Esta doença está associada a um largo espectro de apresentações clínicas que se prolongam a partir de seroconversão assintomática para infecção crónica com risco de vida que frequentemente se manifesta como endocardite anos após a exposição ^1. A infecção humana ocorre principalmente através da inalação de aerossóis contaminados com ruminantes o principal reservatório para infecção, em particular, vacas leiteiras, ovelhas e cabras. Embora a infecção por Coxiella nestes animais é normalmente subclínicas, a infecção pode desencadear o aborto e a carga bacteriana considerável dentro do fluido de parto e da placenta podem contaminar o ambiente local ^1. Um exemplo da enorme carga tal contaminação pode ter sobre a saúde pública e indústria da agricultura foi observada recentemente no surto de febre Q que ocorreu na Holanda ^2. Entre 2007 e2010, mais de 4.000 casos humanos de febre Q foram diagnosticados e este surto estava ligada à contaminação significativa de cabra cultiva ^3. Além disso, Coxiella é uma potencial arma biológica, como classificado pelos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças, devido à estabilidade ambiental das bactérias e de baixa dose infecciosa necessária para causar morbidade e mortalidade ⁴ grave.

Coxiella existe em duas fases: Fase I organismos, isoladas de fontes naturais, são extremamente virulenta e Fase II organismos são altamente atenuado in vivo. Por exemplo, depois de várias passagens in vitro em Coxiella burnetii de nove milhas Fase I organismos, bactérias em fase II foram produzidos que contêm uma deleção cromossómica irreversível resultando em lipopolissacárido truncada (LPS) ^5. Esta linhagem, C. burnetii NMII, é fenotipicamente semelhante à Fase I em modelos de cultura de tecidos e fornece um modo mais segurol para os investigadores a estudar patogênese Coxiella em laboratórios ^5. Nos últimos anos, vários avanços têm avançado rapidamente no campo da genética Coxiella. Mais notavelmente, o desenvolvimento de meios axénica (acidificada forma cisteína citrato – ACCM-2) permitiu o crescimento isento de células de Coxiella em líquidos e sólidos em meios de ^6,7. Isto resultou na melhoria directa de ferramentas genéticas disponíveis para Coxiella, incluindo um sistema de expressão indutível de genes, vectores de transporte e sistemas de transposões aleatórios ^8-11. Mais recentemente, dois métodos para a inativação do gene alvo também foram desenvolvidos, abrindo o caminho para examinar os candidatos de genes de virulência específicos ^12.

Após internalização por macrófagos alveolares, Coxiella replica para números elevados dentro de um compartimento ligado à membrana denominado o Coxiella- contendo vacúolo (CCV). O CCV requer tráfico endocítica hospedeiro thásperas precoces e tardias endossomas até que amadurece em uma organela derivados do lisossoma ^13. Ao longo deste processo, o CCV adquire factores do hospedeiro que quer aparecer transitoriamente ou permanecer associado com o vacúolo, incluindo, mas não limitado a, Rab5, RAB7 proporcionou, CD63 e ^LAMP-13-15 janeiro. A replicação de Coxiella dentro das células hospedeiras é inteiramente dependente de um Dot / Icm Tipo IVB Secreção sistema totalmente funcional (T4SS) ^8,16,17. Este sistema de secreção seja uma estrutura multi-proteína ancestral relacionada com sistemas de conjugação e abrange ambas as membranas bacterianas e vacuolares para administrar proteínas bacterianas, denominado efectores, para o citoplasma de acolhimento ^18. O Coxiella T4SS é funcionalmente muito semelhante ao tipo IVB Dot / Icm sistema de secreção bem caracterizado de Legionella pneumophila ^19,20. Curiosamente, a activação do T4SS e subsequente translocação efector não ocorre até que atinge o lisossoma Coxiella derivada ácidaorganela, aproximadamente 8 horas pós-infecção ^17,21. Até à data, mais de 130 effectors Dot / ICM foram identificados ^9,17,22-24. Muitos destes efectores provavelmente desempenham um papel importante durante a replicação de Coxiella dentro das células hospedeiras; no entanto, apenas alguns efetores foram caracterizados funcionalmente ^25-29.

Neste estudo nós utilizamos um ensaio de fluorescência com base translocação que se baseia na clivagem do substrato CCF2-AM FRET (daqui em diante referido como o substrato BlaM) através da actividade β-lactamase dentro do citoplasma da célula hospedeira (Figura 1). O gene de interesse é fundida com a TEM-1 β-lactamase (BlaM) em um plasmídeo repórter que proporciona a expressão constitutiva. O substrato BlaM é composto por dois fluoróforos (cumarina e fluoresceina) que formam um par de FRET. Excitação da cumarina resultados em FRET da fluoresceína e emissão de fluorescência verde na ausência de translocação efectora; No entanto, se o Blaproteína de fusão M-efectora é translocado para dentro do citoplasma de acolhimento, a resultante β-lactamase cliva o anel de actividade β-lactama do substrato BlaM, separando o par de FRET produzindo emissão de fluorescência azul seguinte de excitação. Este ensaio de translocação foi bem comprovada como uma abordagem para identificar proteínas efectoras a partir de uma gama de diferentes bactérias intracelulares e extracelulares, incluindo C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, E. enteropatogênica coli, Salmonella e Brucella ^17,30-35.

Para determinar o papel dos factores do hospedeiro específicas sobre Coxiella efetoras translocação nós utilizamos um método bem estabelecido para o silenciamento do gene conhecido como interferência de RNA, em particular as pequenas interferência RNA (siRNA). Originalmente identificado em Caenorhabditis elegans, a interferência RNA é um processo celular endógena conservada usado para defe inataNSE contra vírus, bem como do gene regulação ^36,37. Após a ligação do siRNA específica da sequência, a degradação de ARNm ocorre através RISC (induzida por complexo de ARN de silenciamento) resultando no silenciamento de genes específicos ou knockdown ^38. Neste estudo, siARN foi usada para alvejar duas proteínas do hospedeiro, e Rab5A Rab7A, que são reguladores importantes da via endocítica. O impacto de silenciar Rab5A e Rab7A na translocação efetoras foi determinada segundo C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 foi selecionado como foi mostrado anteriormente para ser translocado pelo sistema de secreção de Dot / Icm de Coxiella ^17.

Utilizando tanto o silenciamento do gene siRNA e no ensaio de translocação fluorescencebased descrito aqui, estamos começando a estabelecer um papel para fatores do hospedeiro na translocação de proteínas efetoras por Coxiella. Esta abordagem pode ser aplicada a uma vasta gama de bactérias tanto intracelulares e extracelulares que possuem secretio semelhantesistemas n responsáveis ​​pela translocação de proteínas efectoras.

Protocol

Nota: Todos os procedimentos que envolvem o crescimento ou a manipulação de Coxiella burnetii RSA439 NMII deve ser realizada em um Contenção Nível Físico 2 Laboratório e dentro de uma cabine de segurança biológica em conformidade com as directrizes locais. Um diagrama esquemático do fluxo de trabalho de transfecção e ensaio de translocação inversa descrito abaixo é mostrado na Figura 2.

1. Preparação de C. burnetii Cultura Expressando CBU0077 fundido com p-lactamase (pBlaM-CBU0077) (dia 1)

1. Prepare 1X ACCM-2 ^6:
   1. Combinam-se as componentes listadas na Tabela 1. Ajustar o pH a 4,75 com NaOH 6 M e esterilizar filtro (não autoclave). ACCM-2 é estável durante cerca de três semanas armazenados a 4 ° C.
2. Gerar C. stocks burnetii pBlaM-CBU0077.
   1. Infect HeLa 229 células com o C. estirpe burnetii transportando pBlaM-CBU0077 e passagem até grande vacuolES são observados na maioria das células.
      1. Cresça o C. burnetii estirpe transportando pBlaM-CBU0077 em 20 ml ACCM-2 que contém 3 ug / ml de cloranfenicol em um balão de cultura de 75 centímetros ^dois tecidos com tampa ventilada durante 7 dias a 37 ° C em 5% de _CO2, 2,5% de _O2.
      2. Centrifugar a C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15000 × g durante 15 min à temperatura ambiente.
      3. Re-suspender o sedimento em 20 mL de DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 3 ug / ml de cloranfenicol (meio de manutenção). Remova a mídia a partir de um 50% confluentes 75 ^cm2 frasco de células HeLa 229. C. Adicionar re-suspenso burnetii a células HeLa 229. Incubar durante 2 dias a 37 ° C em 5% de _CO2 para permitir que a infecção das células de HeLa de 229 a estabelecer.
      4. Células dividido em 175 ^cm2 frasco de cultura de tecidos.
         1. Remover o meio do frasco de 75 ^cm2 e lava-se a monocamada com duas vezes 10 ml de PBS pré-aquecido.
         2. Adicionar 1 ml de oF 0,05% de tripsina-EDTA células solução e local em CO ₂ temperatura de 37 ° C + 5% durante 3 – 5 minutos para separar as células.
         3. células re-suspensão em 10 ml de meio de manutenção. Adicionar 2 ml de células ressuspensas em um ² frasco de 175 cm, que inclua 38 ml de meio de manutenção.
         4. Incubar a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante mais 3 – 5 dias até 100% de confluência é atingido e são observadas grandes vacúolos.
   2. Recolher o sobrenadante do frasco de 175 cm ^2, adicionam-se 10 mL _{de dH2O} para cobrir as células HeLa infectadas 229 e incubar durante 15 min para lisar as células infectadas.
   3. Combinar o sobrenadante e as células lisadas e a pelete a 15000 × g durante 15 min à temperatura ambiente.
   4. Re-suspender pellet em 10 ml de dH ₂ O. Lisar as células por mais passando repetidamente a re-suspensão através de uma agulha 23G ligada a uma seringa de 10 ml, pelo menos, 20 vezes. Pelete a 500 x g durante 5 min para remover os detritos celulares.
   <li> Retirar sedimento e sobrenadante a 15000 × g durante 15 min à temperatura ambiente para recolher C. burnetii.
   5. Re-suspender C. burnetii em DMEM + FCS a 10% e a quantificação do número de bactérias como por 4. Diluir com 1 x 10 genomas ⁹ / ml, utilizando meio DMEM + FCS a 10% + 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), alíquota de 50 ul das existências em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C.
3. Inocular 10 ml de pré-aquecido ACCM-2 que contém 3 ug / ml de cloranfenicol com 20 ul de C. burnetii pBlaM-CBU0077 estirpe ¹⁷ (de stocks gerados em 1,2 armazenadas a -80 ° C) em um 25 centímetros garrafa de cultura de tecidos ² com tampa ventilada. Crescer a cultura bacteriana de 7 dias a 37 ° C em 5% de _CO2, 2,5% de _O2.

2. transfecção Reverso de siRNA e semeadura de HeLa 229 Cells (DIA 4)

1. Quando se utiliza o siRNA experimental para a primeira vez prepararo siARN da seguinte forma:
   1. Resumidamente centrifugar o siRNA liofilizou-se para garantir que o grânulo siRNA é recolhido no fundo do tubo.
   2. Re-suspender o siRNA sedimentadas a uma concentração final de 20 estoque uM pipetando o volume adequado de tampão 1x siRNA (Tabela 2).
   3. Pipetar a solução cima e para baixo 3 – 5 vezes para misturar e colocar num misturador orbital durante 30 min à TA, invertendo o tubo a cada 5-10 min.
   4. Resumidamente Centrifugar o tubo para garantir o siRNA é recolhido na parte inferior do tubo.
   5. Alíquota o siRNA em 50 mL alíquotas em tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C até ser necessário.
   6. Para gerar 1 fiM de concentração de ARNsi de trabalho, pipeta de 950 uL de tampão 1X siARN em uma aliquota de 50 ul de estoque (20 mM) quando necessário. Nota: Esta concentração de trabalho 1? M pode ser congelar-descongelado várias vezes para transfecções repetidas.
2. Coloque DMEM + FCS a 10%,; 0,05% de tripsina-EDTA e PBS num banho de água a 37 ° C (ou equivalente) durante 30 minutos para aquecer antes da utilização.
3. Preparação de componentes de transfecção:
   Nota: O protocolo seguinte foi optimizado para as células de HeLa 229 numa microplaca de 96 poços, com paredes pretas e fundo transparente plana. A optimização da quantidade de reagente de transfecção, a concentração de siRNA e semeadura densidade das células pode ser necessário para diferentes linhas de células.
   1. Para cada poço, usar 0,1 mL de reagente de transfecção, 15,9 ul de meio de soro reduzido (meio essencial mínimo utilizado para transfecções, referem-se a tabela de materiais) e 4 ul de 1 uM de siRNA (resultando numa concentração final de 40 siARN nM). Utilize tubos de microcentrífuga separados para OTP, PLK1, Rab5A e Rab7A. Meça cada condição de ensaio em triplicado. Um exemplo de uma disposição da placa de 96 poços é mostrado na Figura 3.
      Nota: Este protocolo inclui a utilização de dois controlos: OTP e PLK1. OTP écomposto por quatro siARN reunidas que foram optimizados para reduzir os efeitos fora do alvo e, assim, OTP é usado como um controlo negativo, não segmentação. Mexidos siRNA também poderia ser utilizada como um controlo negativo. A perda de resultados de expressão PLK1 na morte celular extensiva em um número de linhas de células através da indução de vias pró-apoptóticos e, por conseguinte, PLK1 siRNA é utilizado como controlo positivo para a transfecção em que a morte celular correlaciona-se a eficácia de transfecção.
      1. Para cada transfecção siRNA experimental, combine médio reduzido de soro de 0,4 mL de reagente de transfecção e 63,6 ul em um tubo de microcentrífuga individual. Vortex todos os tubos de microcentrífuga e permitir que os componentes de complexo durante 5 min à TA.
      2. Adicionar 16μl de cada siRNA experimental para os correspondentes tubos de microcentrífuga contendo o complexo de transfecção. Vortex e incubar durante 20 min à TA. Nota: É importante que não se exceda 30 minutos, como a eficiência de transfecção irá diminuir.
4. Durante o 20 min incubation (2.3.1.2) adicionar 20 ul do reagente de transfecção + médio reduzido de soro + siRNA misturar nos poços apropriados de uma bandeja estéril preto, plana clara bottom 96 poços.
5. Assim que o período de incubação de 20 min é completa, semente de HeLa de 229 células a uma densidade de 3,92 x 10 ³ células / poço.
   1. Colheita de HeLa de 229 células confluente ou 75 cm balão de cultura de ² tecidos sub-confluente em meio DMEM pré-aquecido + 10% de FCS e as células re-suspensão para uma densidade final de 4,9 x 10 ⁴ culas / ml, tal como por métodos padrão. Para assegurar a eficiência de transfecção não é comprometida, preparar células durante o período de incubação de 20 min (2.3.1.2).
      1. Lavar a monocamada de células HeLa 229 duas vezes com 10 ml de PBS pré-aquecido.
      2. Adicionar 1 ml de 229 células 0,05% solução de tripsina-EDTA e local HeLa em CO ₂ 37 ° C + 5% para o 3 – 5 min para separar células.
      3. Recolher as células em 9 ml de pré-aquecida DMEM + 10% FCS. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e preparar as células para uma densidade final de 4,9 x 10 ⁴ culas / ml, utilizando meio DMEM + FCS a 10%.
   2. Pipetar 80 ul de células HeLa 229 com uma densidade de 4,9 x 10 ⁴ culas / ml em cada poço que contém o reagente de transfecção + reduzido de soro siARN meio + mistura. Isto corresponde a uma densidade celular de 3,92 x 10 ³ células / poço.
      Nota: A subtração é necessário para o substrato BlaM.
      1. Não adicionar células ou siRNA para "em branco" poços (Figura 3). Em vez disso, adicionar 80 mL de DMEM + 10% FCS a estes poços criados em triplicado.
   3. Incubar durante 24 horas a 37 ° C + 5% de CO _2.

3. Mudar mídia (DIA 5)

1. Depois de 24 horas, remover a mídia usando um adaptador multicanal ligado a uma fonte de vácuo ou manualmente com uma pipeta multi-canal, e substituir com 100 l de Pré-aquecer frescoEd DMEM + 10% FCS.
2. Incuba-se durante mais 48 h a 37 ° C + 5% de CO _2.
3. Neste ponto, verifique a viabilidade das células visualmente utilizando um microscópio de luz padrão. Se a transfecção inversa tem sido bem sucedida, a morte celular significativa será observada nos poços contendo siARN PLK1 em comparação com OTP siARN.

4. Quantificação de Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 estirpe utilizando qPCR (dia 7)

1. Após 7 dias de crescimento em ACCM-2 a 37 ° C em 5% de _CO2, 2,5% de O ₂ (1,3), centrifugar a 10 ml C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15000 × g durante 15 min à temperatura ambiente.
2. Re-suspender o sedimento bacteriano em 10 ml de pré-aquecida DMEM + 10% FCS. Prepare a 1:10 e 1: 100 diluições da cultura (amostra), utilizando _dH2O
3. Defina-se os componentes necessários para a qPCR.
   Nota: ADNg extracção pode ser realizada com antecedência e guardadas a -20 ° C untIL necessária.
   1. Preparação de padrões:
      1. Extrair a partir de ADNg Coxiella burnetii RSA439 NMII estirpe de tipo selvagem cultivadas em ACCM-2 a 37 ° C em 5% de _CO2, 2,5% de O ₂ durante 7 dias, usando um kit de extracção de ADNg, de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Medir a concentração ADNg (g / mL) utilizando uma Nanodrop (ou equivalente) a uma absorvância de 260 nm.
      3. Calcular o número de cópias do genoma por ul usando a seguinte fórmula abaixo, e converter-se ao número de genomas / ml.
         
      4. Ajustar o número de genomas / ml a 10 / ml ^(9, num volume final de 100 ul) num tubo de microcentrífuga novo usando _dH2O Isto pode ser fervido durante 10 min e armazenadas a -20 ° C até ser necessário.
      5. No dia da infecção, gerar 10 diluições em série de 10 ⁸ genomas / ml a 10 / ml ⁵ genomas do genoma ⁹ 10s / ml.
         1. Pipetar 10 ul de 10 ⁹ genomas / mL em 90 mL de _dH2O para gerar 10 ⁸ genomas / ml. Vortex para misturar. Pipetar 10 ul de 10 ⁸ genomas / mL em 90 mL de _dH2O para gerar 10 ⁷ genomas / ml. Vortex e repita até 10 ⁵ genomas / ml.
   2. Configurar reação qPCR. Criar uma mistura mestre para 25 poços para compensar eventuais erros de pipetagem. Para cada cavidade, 10 ul usar qPCR Master Mix; 2 ul de mistura de iniciadores (ompA 4.3.2.2) e 3 uL de _dH2O
      Nota: OmpA é uma proteína da membrana externa da C. burnetii ^'39 e uma secção de 82 pares de bases dentro de uma região altamente conservada foi seleccionado para ser utilizado como uma sonda como anteriormente descrito ^40.
      1. Configurar cada padrão (dH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ genomas / ml) e amostras (1:10 e 1: 100 de diluição) em uma de 96 cavidades de PCR arrancar a placa (não-contornado) em duplicado ou triplicado, respectivamente. Adicionar 5 mL de amostra ou padrão nos poços apropriados.
      2. Usando _dH2O, diluir tanto o iniciador directo ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') e o iniciador inverso OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') para uma concentração final de 4 | iM e combinam no mesmo tubo de microcentrífuga.
         Nota: A mistura de iniciadores de ompA pode ser preparado antecipadamente e guardado a -20 ° C até ser necessário.
      3. Combinar 250 mL de qPCR Master Mix, 50 ul de mistura de iniciadores de ompA, 75 uL _{de dH2O} e agitar com vortex para misturar. Adicionar 15 ul desta mistura principal para poços contendo os padrões ou de amostras.
      4. Colocar 8-tampa tampas tira de PCR para os poços apropriados e centrifugar de pulso dos tubos PCR para garantir que tudo está recolhidos no fundo dos tubos.
      5. Configure o seguinte programa em uma ma PCR quantitativolombo: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 1 segundo e 60 ° C durante 20 segundos (Figura 4A).
   3. Analisar o Ct (limiar de ciclo) valores do qPCR:
      1. Transferir os valores de Ct para uma planilha usando a função de exportação do programa.
      2. Criar um gráfico de dispersão das normas 10 ⁵ genomas / ml até 10 ⁹ genomas / ml (expressas como valores de log). Descarte os valores atípicos óbvios entre as amostras em triplicado. Gerar uma linha de tendência logarítmica e determinar a equação do gráfico.
      3. Calcular o número total de genomas / mL na amostra usando a equação gerada em 4.3.3.2. Não se esqueça de ter em conta a diluição inicial (1:10 e 1: 100) das amostras.

5. Infecção de reverso células transfectadas (dia 7)

1. Depois de calcular o total de genomas / ml no C. carrapichocultura netii pBlaM-CBU0077 para ser utilizada para a infecção, ajustar cultura bacteriano ressuspenso para infectar células a um MOI de 300 num volume final de 50 ul / poço, utilizando pré-aquecido DMEM + 10% FCS.
   Nota: A densidade esperada de células HeLa semeadas 229 com um tempo de replicação normal após 72 horas é 3.136 x 10 ⁴ células / poço. A quantidade de bactérias necessárias para infectar a uma MOI de 300 é 9,408 x 10 ⁶ em 50 mL, o que equivale a 1,88 x 10 ⁸ bactérias / ml.
   1. Utilizando o valor calculado a partir dos genomas de qPCR (/ ml) (4.3.3.3), diluir as bactérias re-suspensas usando pré-aquecido DMEM + FCS a 10% num volume final de 2 ml para infectar as células transfectadas reversa.
2. Remova a mídia existente a partir do branco e células transfectadas reversa.
3. Adicionar 50 ul de bactéria diluída (1,88 x 10 ⁸ bactérias / ml) aos poços apropriados. Adicionar 50 ul de DMEM + FCS a 10% para ambos o branco e upoços ninfected.
4. Incubar durante 24 horas a 37 ° C + 5% de CO _2.

6. A adição de BlaM Substrato para determinar o nível de translocação (DIA 8)

1. Prepare as soluções para a solução 6x carregamento de substrato BlaM.
   Nota: Solução A, B e C são fornecidas no kit substrato BlaM (Consulte a Tabela de Materiais). Solução B podem formar um precipitado à temperatura ambiente. Aquecer esta solução a 37 ° C antes de usar e o precipitado deve dissolver.
   1. Quando se utiliza o kit para o primeiro tempo, adicionar 185 ul de DMSO (fornecido com o kit de substrato BlaM) à solução dessecada A. Subsequentemente, armazenar o ressuspenso Uma solução a -20 ° C.
   2. Preparar solução 0,1 M probenicide antecipadamente e armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 ° C até ser necessário.
      1. Prepare de NaOH 0,4 M (1,6 g em 100 ml _{de dH2O).}
      2. Prepare Na 100 mM de tampão fosfato de pH 8 (1,56 g de NaH ₂ PO ₄ .2H <sUB> 2 O e 1,41 g de Na ₂ HPO ₄ em 100 ml _{de dH2O).}
      3. Dissolve-se 1,25 g de probenecid em 22 ml de NaOH 0,4 M, por agitação vigorosa.
      4. Adicionar 22 ml de Na 100 mM de tampão de fosfato a pH 8 (solução torna-se turva) e agitar para dissolver o precipitado que se forma.
      5. Ajustar o pH a 8 (se necessário) usando M NaOH / HCl 1.
      6. Mexa vigorosamente e aquecer ligeiramente (<50 ° C) até que a solução é mais clara.
      7. Filtro (0,2 um de tamanho de poro) e alíquota em volumes de 1 mL. alíquotas armazenar a -20 ° C.
2. Para cada poço, usar 0,06 ul de solução A, 0,54 mL Solução B, 7,9 ul de solução C e 1,5 ul de 0,1 M de probenicida. Criar uma mistura principal para os 30 poços por primeiro combinando 1,8 mL de solução A e 16,2 ml de solução B em conjunto num tubo de microcentrífuga. Misturar bem utilizando um vortex. Adicionar 237 ul de solução C e 45 ul de 0,1 M de probenicida. Vortex de combinar todas components.
   Nota: A solução 6x carregamento é estável durante até 4 horas (no escuro), mas deve ser preparado tão próximo quanto possível antes da utilização.
3. Adicionar 10 ul da solução 6x carregamento directamente em todos os poços em branco e inverter transfectadas sem retirar os meios de comunicação existentes.
4. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 2 horas no escuro.
5. Para determinar o nível de translocação, quantificar a quantidade de fluorescência utilizando um leitor de microplacas.
   Nota: O procedimento seguinte é específico para o leitor de microplacas ClarioSTAR. leitores de microplacas equivalentes podem também ser utilizados.
   1. Criar um novo protocolo de intensidade de fluorescência usando endpoint como o modo de leitura.
   2. Ajustar os parâmetros básicos da seguinte forma:
      1. Escolha de microplacas de 96 poços.
      2. Em Configurações de óptica, selecione 2 multichromatics com as seguintes configurações definidas pelo utilizador: (1) Entrada 410-10 nm de excitação e de emissão 520-10 nm. (2) entrada de excitação 410-10 nm e emissão 450-10 nm. Assegurar o bem multichromatics é selecionado.
      3. Escolha média orbital com um diâmetro de 3 mm.
      4. Sob óptica, selecione óptica inferior.
      5. Sob velocidade e precisão, selecione preciso. Isto corresponde a oito regiões por poço.
   3. Ajustar o layout da placa escolhendo os poços apropriados como amostras.
   4. Seleccione a medição inicial.
   5. Retire a tampa e coloque a bandeja no leitor de placas. Para evitar atingir valores máximos de fluorescência, garantir o valor de ganho é ajustado. Para fazer isso, realizar um ajuste de ganho de um dos poços infectados que foi transfectada com o OTP inversa siARN. Isto corresponde à maior translocação esperado.
   6. Seleccione a medição início para medir todos os poços apropriados usando fluorescência de fundo em uma excitação de 410 nm e emissão de ambos os 450 nm e 520 nm para a fluorescência azul e verde, respectivamente.

7. Análise dos Resultados:

1. Calcular a proporçãode 450 nm a 520 nm (azul para verde) para todas as amostras após redução em branco e expressa em relação à amostra não infectado OTP.
   Nota: as seguintes etapas de análise são fornecidas para um programa de planilha simples.
   1. Usando a função de exportação no leitor de microplacas, transferir os valores de fluorescência brutos obtidos tanto para 520 nm e 450 comprimentos de onda de emissão nm (6.5) em uma planilha.
   2. Calcula-se a média do "branco" leituras (meios apenas, sem células) para o comprimento de onda de 520 nm por adição de 520 nm, valores de fluorescência matérias e dividindo-se pelo número de poços (3). Repita usando os valores de 450 nm de comprimento de onda em branco. Estes valores representam a fluorescência de fundo, devido à placa de 96 poços e meios de comunicação.
   3. Subtrair a fluorescência de fundo. Utilizando os valores obtidos em 7.1.2 subtrair a média do comprimento de onda de 520 nm em branco a partir de todos os valores de fluorescência da amostra 520 nm. Repita o procedimento para os valores de 450 nm de comprimento de onda.
   4. Para obter o 450: a relação nm 520 utiliza os valores corrigidos em branco (7.1.3). Dividir cada valor de fluorescência da amostra a 450 nm, por seu valor de 520 nm correspondente.
   5. Calcula-se a média dos valores da relação de OTP não infectadas através da adição de 450: valores de relação 520 nm (a partir de 7.1.4) e dividindo-se pelo número de poços (3).
   6. Calcula-se a razão entre as amostras em relação a OTP não infectado dividindo a 450: 520 nm, relação em 7.1.4 calculada pela média do valor não infectado OTP proporção calculada em 7.1.5.

8. Adição de Núcleos Stain para determinar o número de células após a translocação Assay (DIA 8)

1. Após quantificação de fluorescência, remover meios que contêm solução de carregamento 6x de todos os poços usando um adaptador de multi-canal ligado a uma fonte de vácuo ou manualmente com uma pipeta multi-canal.
2. Adicionar 50 ul de solução a 4% de PFA (paraformaldeído)em PBS a todos os poços adequados para fixar as células. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
3. Remover 4% PFA solução PBS (como por 8.1) e lavar as células duas vezes com 75 ul de PBS.
4. Adicionar 50 ul de um corante nuclear permeável de células, por exemplo, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole), a cada poço. Aquisição de imagens com um microscópio de fluorescência e quantificar o número de núcleos presentes em cada poço após o tratamento siRNA usando o software de análise de imagem apropriado, tal como ImageJ ^41.

Representative Results

Discussion

sistemas de secreção, e as proteínas efectoras bacterianas estes sistemas de transporte para o citoplasma das células hospedeiras, são um componente importante de virulência que muitas bactérias patogénicas utilizar para estabelecer uma infecção em nichos replicativas exclusivos. O foco de muitos grupos de pesquisa foi investigar a interação entre efetores bacterianas e proteínas do hospedeiro e a influência destes efectores têm sobre as vias celulares do hospedeiro. pesquisa muito limitada, se alguma, examinou o potencial de proteínas do hospedeiro a ser necessário para o êxito da translocação bacteriana efectora.

Neste estudo utilizou-se o obrigatório, patógeno intracelular Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q zoonótica. Após a entrada em células hospedeiras, o vacúolo molecular contendo Coxiella passivamente trafica através da via endocítica canônica até chegar a um vacúolo derivados do lisossoma ácida, onde se replica para números muito altos. Além de tomar Advantage da via normal de tráfico de acolhimento, a capacidade de Coxiella para estabelecer um nicho replicativo sucesso também depende de um sistema de tipo funcional secreção IVB (T4SS) e subsequente efetoras translocação ^8,17. Este sistema de secreção é funcionalmente análogo ao do bem caracterizado Dot / Icm T4SS de Legionella. Isto foi amplamente demonstrado, complementando mutantes dot / ICM específicas de Legionella com os seus respectivos genes Coxiella ^19,20. Embora o T4SSs de ambos Legionella e Coxiella são essenciais para a replicação, o tempo de quando estes sistemas são activados é bastante diferente e reflecte a natureza divergente dos respectivos nichos replicativas. A Legionella T4SS é acionado imediatamente após o contato com células hospedeiras e a rápida translocação de efetores permite que as bactérias para evitar o caminho endossomal-lisossômico padrão e, em vez criar um vácuo de replicação derivada de ER únicale ^42. Em contraste, o T4SS de Coxiella não é activado até aproximadamente 8 horas pós-infecção, as bactérias após atingir o vacúolo derivadas de lisossoma ácida ^21.

Dado que transita Coxiella passivamente através da via endocítica e o sistema de translocação não é activado até que ele atinja o lisossoma, uma oportunidade única apresenta-se usar Coxiella como ferramenta para estudar a maturação endocítica. A exigência para a CCV a tornar-se acidificada antes efectores são translocados indica que um número de proteínas do hospedeiro são importantes para a translocação de proteínas efectoras para o citoplasma hospedeiro, em particular, mas não se limitando a, proteínas envolvidas na via endocítica tráfico. Utilizando siRNA de uma forma direccionada específica, podemos começar a elucidar o papel das proteínas hospedeiras particulares na translocação efetoras. Neste estudo incidiu sobre duas proteínas que regulam a trafficki endocítica eucarióticang via, e, portanto, foram previstos para efectuar a translocação do Coxiella CBU0077 efectora. Rab5A e controle Rab7A fusão da membrana com endossomas precoces e tardias, respectivamente. Silenciando qualquer uma destas proteínas, utilizando siARN resultou numa diminuição significativa na eficiência de translocação de CBU0077 quando comparado com o controlo OTP siRNA (Figura 5B). Os resultados representativos aqui mostrados refletem nossos resultados publicados anteriores ²¹ e fornecer uma validação adicional para a importância destas proteínas Rab humanos para Coxiella efetoras translocação. Esta técnica também tem sido empregada para caracterizar o impacto de outros processos de acolhimento no Coxiella Dot / Icm efetoras translocação. O complexo retromer verificou-se ser importante para a replicação intracelular de Coxiella. Ao silenciar componentes retromer, utilizando siARN, e, em seguida, a realização de um ensaio de translocação que poderia mostrar que retromer é necessário para criar o ambiente que induzCoxiella efetoras translocação ^43.

Embora os resultados representativos mostrados aqui é uma comparação entre o controle OTP infectado e siRNA Rab5A segmentação e Rab7A, o protocolo pode ser modificado de acordo com as necessidades experimentais. Por exemplo, o nível de translocação efectora pode também ser comparada com as células transfectadas com ARNsi mexidos ou células não transfectadas.

O foco deste estudo particular foi o obrigatório, intracelular patógeno C. burnetii e proteínas envolvidas no tráfico endocítica, no entanto, os métodos descritos no interior pode ser facilmente adaptada a outros organismos patogénicos intracelulares e extracelulares que utilizam sistemas de secreção para a virulência. De facto, o teste de translocação fluorescente à base que se baseia na actividade β-lactamase no citoplasma hospedeira utilizada aqui, foi já amplamente utilizado em toda uma gama de agentes patogénicos ^30-32,35,44. Naturalmente, as condições de infecção dolinhas de células específicas usadas devem ser adaptadas para refletir as exigências de infecção de bactérias específicas. Além disso, um efector endógeno conhecido fundido com p-lactamase é essencial para o sucesso dos métodos descritos no interior. Uma consideração importante para a implementação bem-sucedida do protocolo explicado aqui é o impacto silenciar um alvo determinado host pode ter sobre a entrada de bactérias e replicação subsequente. Aqui, efetoras translocação por Coxiella é medida 24 horas infecção post. Neste caso, e para outras bactérias intracelulares, a capacidade do organismo para ganhar a entrada nas células hospedeiras é vital. Além disso, o silenciamento do gene específico pode também influenciar a replicação bacteriana, por conseguinte, alterando o nível de translocação observada. Confirmação de que siRNA silenciamento não afecta significativamente a entrada de bactérias e / ou replicação, e consequentemente a eficiência de translocação, pode ser conseguido usando quer microscopia ou numeração das bactérias. a translocaçãoos dados podem então ser normalizada para o número de células infectadas por tratamento de siARN. Replicação bacteriana não tem confundido os dados aqui apresentados como Coxiella sofre pouca ou nenhuma replicação durante o período de incubação de 24 h.

Este método requer a transfecção eficiente de siRNA em células hospedeiras para assegurar suficiente silenciamento do gene de interesse. Com isto em mente, a escolha do reagente de transfecção correta é extremamente importante. Para além do reagente e as condições utilizadas neste estudo em particular, que foi optimizada para 229 células HeLa, existem numerosos outros reagentes a partir de escolha. A eficiência de knockdown utilizando diferentes reagentes de transfecção pode ser quantificado utilizando RT-qPCR para garantir que tanto o reagente mais apropriado é seleccionado e que o siRNA escolhidos especificamente como alvo o transcrito de interesse. Apesar de não ser apresentada neste estudo, já anteriormente demonstrado a eficiência do knockdown de ambos Rab5A e Rab7A utilizando RT-qPCR ^21. Além disso, a utilização de anticorpos contra o alvo de interesse e confirmação por Western blot também pode confirmar siRNA silenciamento de alvos específicos.

Duas outras considerações importantes a tomar nota de quando usando siRNA incluem a possibilidade de efeitos off-alvo e a viabilidade celular das células transfectadas. Off-alvo efeitos ocorrem quando os alvos não intencionais também são destruídos. Isto pode conduzir a alterações fenotípicas e pode resultar em falsos positivos. Neste estudo, utilizou-se um conjunto de quatro ARNic em cadeia dupla para silenciar um único alvo do hospedeiro. Se silenciar um alvo particular provoca uma redução na eficiência de translocação, a validação de que este resultado não é devido aos efeitos fora do alvo pode ser conseguida através da separação dos quatro ARNic em cadeia dupla e repetindo o teste de translocação. Pelo menos dois dos quatro ARNic em cadeia dupla deve demonstrar um fenótipo similar à piscina siARN originais. Com este resultado, pode-se ser altamente confiante de que o TR observadaanslocation eficiência não é devido aos efeitos fora do alvo. A validade dos resultados produzidos de translocação é também dependente na viabilidade celular. A aplicação de uma mancha núcleos após o ensaio de translocação permite a enumeração de viabilidade celular seguindo siRNA silenciamento. No caso de PLK1, morte celular significativa pode ser facilmente observada sem coloração; No entanto, utilizando a microscopia de epifluorescência, uma representação mais precisa pode ser alcançado. Se ao silenciar uma morte celular significativa em particular alvo do hospedeiro é observado, por exemplo, 50% em comparação com o controlo, é improvável que uma imagem precisa pode ser inferido como para a importância do que a proteína hospedeira particular para a translocação de efectores. Como se mostra neste estudo, embora o silenciamento quer Rab5A ou Rab7A tem um pequeno impacto sobre a viabilidade celular (Figura 5C), esta redução não é pronunciada suficiente para negar a validade dos dados observados de translocação. Outra consideração com relação ao exer viabilidade celulardevido siRNA silenciamento é a observação de que a morte celular significativa, muitas vezes leva a um aumento do rácio de translocação. Isto é amplamente demonstrado pelos dados relatados para a translocação PLK1 (Figura 5A). O número de células reduzido resulta num aumento proporcional na multiplicidade de infecção. Isto irá aumentar a taxa de infecção e, portanto, a relação de translocação.

Apesar de não ser apresentada neste estudo, a visualização de translocação efectora também podem produzir um resultado quantitativo de cortesia. Usando um microscópio de epifluorescência equipado com um espelho dicróico de passagem longa de excitação e de emissão de luz separada pode fornecer uma observação visual da fluorescência intracelular BlaM substrato. Uma alternativa possível para o sistema repórter β-lactamase é utilizar o sistema repórter de adenilato-ciclase. Semelhante ao sistema repórter aqui descrito, o gene de interesse é fundido com um gene de adenilato-ciclase dependente de calmodulina (cyaA </em>) Derivada a partir de Bordetella pertussis. translocação efectora pode ser medido por quantificação do intracelular de AMP cíclico (cAMP) utilizando um kit de imunoensaio ELISA. Dado que a actividade de CyaA é totalmente dependente da calmodulina célula hospedeira, que só está presente no citosol de acolhimento, translocação efectora é confirmada por um aumento nos níveis de AMPc. Embora este método também tem sido utilizado com sucesso para medir efectora translocação para uma variedade de bactérias ^45-47, quantificação de cAMP intracelular baseia-se na lise de células hospedeiras para extrair o AMPc, um processo que é mais demorada em comparação com o método descrito no interior. Medição de translocação efectora utilizando o sistema repórter β-lactamase à base de FRET é mais eficiente uma vez que o substrato BlaM pode ser adicionado directamente às células e a fluorescência pode ser medida dentro de horas. Além disso, o método aqui descrito pode ser mais facilmente adaptada para gerar resultados de alto rendimento, especialmente numa forma de 96 poçosa.

Muitos agentes patogénicos bacterianos dependem de sistemas de translocação de proteína para introduzir proteínas efectoras para células hospedeiras que permitem a modulação das funções da célula hospedeira para beneficiar o agente patogénico. Sistemas de secreção de tipo IV são utilizados por bactérias intracelulares, tais como Legionella, Coxiella e Brucella e Tipo III sistemas de secreção são utilizados por uma gama de agentes patogénicos incluindo Chlamydia, anexar e apagando E. coli e Salmonella. Ao comparar o efeito de silenciamento de expressão de proteínas hospedeiras específicas sobre a translocação efectora por uma variedade de agentes patogénicos, uma compreensão dos factores do hospedeiro necessários para a translocação efectora por determinados tipos de sistemas de secreção ou específicas a um patógeno indivíduo pode ser elucidado. Isso fornece uma abordagem única para estudar as complexidades de interação patógeno-hospedeiro.

Materials

<strong>Reagents</strong>
Citric acid	Sigma	C0759	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Calbiochem	442611	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Fisher	S93248	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852	ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone	BD	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	Fisher	BP1424	ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin	Sigma	C4555	ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax	ThermoFisher Scientific	61870-036	ACCM-2 medium component
Chloramphenicol	Sigma	C0378	For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)	Dharmacon	D-001810-10-05	Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-003290-01-005	Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-010388-00-0005
5x siRNA buffer	Dharmacon	B-002000-UB-100	Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent	Dharmacon	T-2001-01	For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	51985-034	Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10567-014	For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)	Thermo Scientific	SH30071.03	Can use alternate equivalent product
DMSO	Sigma	D8418	For storage of Coxiella strain
PBS			For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA	ThermoFisher Scientific	25300-054	For cell culture
dH<sub>2</sub>O			For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep	ZYMO Research	D3007	Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Bioline	BIO-98020	Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM	Invitrogen	K1032	For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide	Merck	106469	Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic	Sigma	71505	Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate	Merck	106586	Probenicid solution component
Probenicid	Sigma	P8761	Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62251	Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&nbsp;
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS	Sigma	P6148	Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	430639	For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile	Corning	3603
75 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	430641	For growth of HeLa 229 cells
175 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	431080	For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer			For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates	4titude	4ti-0750/TA	For qPCR reaction
8-Lid chain, flat	Sarstedt	65.989.002	For qPCR reaction
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
<strong>Equipment</strong>
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge	Eppendorf	5810 R	For pelleting bacterial culture
Nanodrop			For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine	Aligent Technologies	401456	For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader	BMG LabTech		For measurement of fluorescence