Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Resumo

A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

Resumo

A mitose é essencial para o crescimento do organismo e diferenciação. O processo é muito dinâmico e requer ordenou eventos para realizar a condensação adequada cromatina, o apego microtúbulos-kinetochore, segregação cromossômica, e citocinese em um pequeno período de tempo. Erros no delicado processo pode resultar em doenças humanas, incluindo defeitos de nascença e câncer. As abordagens tradicionais investigam estados de doença mitótico humanos muitas vezes dependem de sistemas de cultura celular, que não têm a fisiologia natural e contexto de desenvolvimento / específicas do tecido vantajoso quando estudar doenças humanas. Este protocolo supera muitos obstáculos, fornecendo uma forma de visualizar, com alta resolução, a dinâmica de cromossomos em um sistema de vertebrados, o peixe-zebra. Este protocolo irá detalhar uma abordagem que pode ser usada para obter imagens dinâmicas de células em divisão, que incluem: a transcrição in vitro, produção de peixe-zebra / registo, a incorporação de embrião e de imagem time-lapse. Otimização e modifications deste protocolo também são explorados. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas cromatina) e mCherry-CAAX (membrana celular etiquetas) embriões com injecção de mRNA, mitose em AB-tipo selvagem, auroraB ^{hi1045 e hi2865} ESCO2 peixe-zebra mutante é visualizado. Alta resolução de imagem ao vivo no peixe-zebra permite observar várias mitoses quantificar estatisticamente defeitos mitóticas e tempo de progressão da mitose. Além disso, a observação de aspectos qualitativos que definem processos inadequados de mitose (ou seja, defeitos congression, segregação errada dos cromossomas, etc.) e os resultados cromossômicas imprópria (isto é, a aneuploidia, poliploidia, micronúcleos, etc.) são observados. Este ensaio pode ser aplicado para a observação de tecido diferenciação / desenvolvimento e é receptivo à utilização de peixe-zebra mutante e agentes farmacológicos. Visualização de como defeitos na mitose levar a distúrbios de câncer e de desenvolvimento será muitomelhorar o entendimento da patogênese da doença.

Introdução

A mitose é essencial um processo celular fundamental para o crescimento, a diferenciação e regeneração de um organismo vivo. Após a preparação exacta e a replicação de ADN na interfase, a célula é preparado para dividir. A primeira fase da mitose, profase, é iniciada por activação de ciclina B / Cdk1. Prophase é caracterizada por condensação de material cromatina em cromossomas. repartição envelope nuclear ocorre na zona de transição entre a profase e prometáfase. Em prometáfase, centrossomas, o centro de nucleação para a formação do fuso, começam a migrar para os pólos opostos enquanto estende microtúbulos em busca de apego kinetochore. Após a fixação, as conversões....

Protocolo

1. transcrição in vitro

1. Linearizar pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / ou vetores pCS2-mCherry-CAAX por restrição NotI enzima digerir ^31. Utilizando um kit de ARN in vitro a transcrição, gerar produtos 5 'de ARNm tapados de cada molde, de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Purifica-se o ARNm utilizando um kit tapados purificação. Siga as instruções do fabricante. Eluir com livre de RNase H ₂ O.
3. Determinar a concentração de ARN por absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. (OD ₂₆₀ x diluição x 40 ug / ml).
4. Diluir o RNA a 100 ng / mL para cada H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-C....

Resultados

A Figura 2 demonstra a capacidade de observar muitas divisões celulares utilizando uma ampla visão de campo de um tipo selvagem de cauda de peixe-zebra AB. Mais de sete células mitóticas são gravadas em um prazo de 14 min (Filme 1). Dentro de duas horas tempo de curso, mais de 40 eventos de mitose foram capturados. Em média, 50 células em divisão foram observados no AB e 30 células que se dividem em AUR B ^{M / m} embriões

Discussão

A utilização deste método permite inferir colapso nuclear de envelope, a formação de uma placa de metafase por anexos microtubule-cinetocoro, e a segregação de cromatídeos irmãos para formar duas novas células in vivo e de um modo dependente do tempo. A capacidade de observar a mitose no peixe-zebra é vantajosa em relação a amostras fixadas e sistemas de cultura de células porque as células estão a ser trabalhada na fisiologia natural, o tecido é transparente, o que permite que as proteínas fluorescentes a sere.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vetores pCS2	Presente de K. Kwan		Para plasmídeo de interesse
NotI-HF enzima de restrição	New England BioLabs	R3189S	Para digestão de restrição de plasmídeo
mMessage SP6 kit	Life Technologies	AM1340	Para transcrição in vitro
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104	Para purificação de mRNA
100 x 15 mm Placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875712	Para abrigar embriões molde
de microinjeção	caseiro		Para segurar embriões durante a microinjeção
Agarose II	Amresco	0815-25G	Para embriões de embutir
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521-10G	Para anestesiar embriões
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S9888	Para água embrionária (E3 Blue), dissolvida em UltraPure H2O
Cloreto de Potássio	Sigma-Aldrich	P3911	Para água embrionária (E3 Blue), dissolvido em UltraPure H2O
Cloreto de Cálcio Dihidratado	Sigma-Aldrich	C8106	Para água embrionária (E3 Blue), dissolvido em UltraPure H2O
Sulfato de Magnésio	Fisher Scientific	M7506	Para água embrionária (E3 Blue), dissolvida em UltraPure H2O
Methylene Blue Hydrate	Sigma-Aldrich	MB1	Para água embrionária (E3 Blue), dissolvida em tubo de cultura UltraPure H2O
100 mm	Fisher Scientific	50-819-812	ágar derretido
35 mm	MatTek Corp	P35G-0-20-C	Nº 0, vidro de 20 mm, Para embriões embutidos
#5 pinças	Dumont	72701-D	Para descorionar embriões
21 G Agulha de calibre 1 1/2	Becton Dickinson	305167	Para posicionar embriões em ágar
Microscópio de dissecação	Nikon AZ100		Para triagem e incorporação de embriões, qualquer escopo de dissecação servirá
Microscópio confocal	Nikon A1+		Para imagens de lapso de tempo
Software confocal	NIS Elements AR 4.13.00		Para aquisição e processamento de imagens

Para prato de cultura de fundo de lamínula de