Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência In Situ Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em Caenorhabditis elegans

Summary

Relatamos um procedimento conciso de hibridização in situ fluorescente (FISH) na gônada e embriões de Caenorhabditis elegans para observação e quantificação de sequências repetitivas. Observamos e quantificamos com sucesso duas sequências repetitivas diferentes, repetições de telômeros e modelo de alongamento alternativo de telômeros (TALT).

Abstract

Telômero é uma estrutura ribonucleoproteica que protege as extremidades cromossômicas da fusão e degradação aberrantes. O comprimento dos telômeros é mantido pela telomerase ou por uma via alternativa, conhecida como alongamento alternativo dos telômeros (ALT)¹. Recentemente, C. elegans emergiu como um organismo modelo multicelular para o estudo dos telômeros e ALT². A visualização de sequências repetitivas no genoma é fundamental para entender a biologia dos telômeros. Embora o comprimento dos telômeros possa ser medido por ensaio de fragmento de restrição de telômeros ou PCR quantitativo, esses métodos fornecem apenas o comprimento médio dos telômeros. Pelo contrário, a hibridização in situ fluorescente (FISH) pode fornecer as informações dos telômeros individuais nas células. Aqui, fornecemos protocolos e resultados representativos do método para determinar o comprimento dos telômeros de C. elegans por hibridização in situ fluorescente. Este método fornece um procedimento in situ simples, mas poderoso, que não causa danos perceptíveis à morfologia. Usando ácido nucleico peptídico (PNA) marcado com fluorescência e sonda marcada com digoxigenina-dUTP, fomos capazes de visualizar duas sequências repetitivas diferentes: repetições de telômeros e molde de ALT (TALT) em embriões e gônadas de C. elegans.

Introduction

Telômeros protege as extremidades cromossômicas de fusão e degradação aberrante. dos telómeros de mamífero é composto de repetições rico em G hexaméricas, TTAGGG, e complexos shelterin. A sequência do telómero repetição da nemátodo é semelhante aos dos mamíferos (TTAGGC). A maior parte dos eucariotas utilizam telomerase para adicionar repetições telómeros para as suas extremidades cromossómicas. No entanto, de 10 - 15% de células de cancro utilizam mecanismo independente da telomerase, conhecido como Alongamento Alternativa dos telómeros (ALT) ^3. Anteriormente, relatou que repete a telómeros e suas sequências associados, nomeados como tAlt, foram amplifica....

Protocol

1. As sondas de marcação com digoxigenina-dUTP por PCR

1. Realizar etiquetagem 10x PCR com mistura de dNTP contendo digoxigenina-dUTP como previamente descrito ^13.
2. Purificar produto de PCR com a purificação spin-coluna de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Se a sonda é mais curto do que 200 pb, remover livre digoxigenina-dUTP por cromatografia em coluna de spin-a partir da mistura reaccional em vez de purificação de spin-coluna.

2. Preparar Slides polilisina revestido

Nota: O procedimento completo demora cerca de 2 horas. A maior parte dos passos são realizados à temperatura....

Results

Foi relatado anteriormente que o sobrevivente ALT pode emergir de mutante telomerase deficiente, TRT-1 (ok410), em baixa frequência, replicando localizada internamente 'Template da ALT' (tAlt) sequências para manutenção dos telômeros ^2. Usando sonda PNA, fomos capazes de visualizar os telômeros nas gônadas dissecados (Figura 2A). O sinal dos telômeros fraco foi detectado tanto no TRT-1 (ok410) e sobrevivente ALT. O sinal fuzzy foi sobreposto .......

Discussion

A principal vantagem do nosso protocolo é a simplicidade do processo sem danos visíveis para a morfologia da estrutura celular. Vários passos foram otimizados para C. elegans FISH neste protocolo. Os passos críticos para os peixes de sucesso incluem a rotulagem de sondas, a fixação de embriões e penetração. método de marcação com digoxigenina-dUTP fornece um método de rotulagem de fácil utilização por PCR ou por nick-translation. Para rotular sequência alvo por muito tempo, é o preferido nick-translation. Neste.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonda PNA	PANAGENE	pedido
Anti-Digoxigenina-Fluoresceína, fragmentos de Fab	Roche	11207741910	uso 1:200 diluído em PBST
Digoxigenina-dUTP	Roche	11573152910
Albumina de soro bovino	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldeído	SIGMA-ALDRICH	P-6148	preparar paraformaldeído a 4% aquecendo em DW com poucas gotas de NaOH. adicione 0,1 volume de 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
		hibridização	3x SSC, 50% formamida, 10% (p/v) sulfato de dextrano, 50 μ g/ml de heparina, 100 μ g/ml de tRNA de levedura, 100 μ g / ml de esperma de salmão sonicado DNA
Solução de lavagem			2x SSC, 50% de formamida
Formamida	BIONEER	C-9012	metanol tóxico
	Carlo Erba
Acetona	Carlo Erba
Heparina	SIGMA-ALDRICH	H3393	faça 10 mg / ml para solução estoque
Sulfato	de dextranoSIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			Para 1 L DW: 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4• 7H2O, 2,4 g KH2PO
PBST			1x PBS, 0,1% tween-20
Polissorbato 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	O nome comercial é Tween-20
Solução de poli-L-lisina (0,1% p/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare uma solução fresca a 0,01% p/v antes de usar
M9			3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml de 1 M MgSO4, H2O a 1 L
Solução de			hipoclorito de sódio a 20%, 0,5 M KOH
Tampão			1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Azida de sódio (tóxico)
Solução			Tampão de anticorpo com 5% de albumina de soro bovino (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20x SSC			Para fazer 1 L, 175,3 g de NaCl, 88,2 g de citrato de sódio, H2O a 1 L, ajustar o pH para 7,0
2x SSCT			2x SSC, 0,1% tween-20
10x digoxigenina-dUTP misturar			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP
Colunas de purificação PCR Cosmo	genetech	CMR0112
Limpador de vidros / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Lâmina de vidro com vários poços	MP biomedicals
		crescimento de nematóides	Para fazer 1 L, 3 g de NaCl, 17 g de ágar, 2,5 g de peptona, H2O a 974 ml. Autoclave e resfrie o frasco. Adicionar 1 ml de 1 M CaCl2, 1 ml de 4 mg/ml de colesterol em etanol, 1 ml de 1 M MgSO4, 25 ml de 1 M KPO4.
Levamisol	SIGMA-ALDRICH	196142
Lâmina de penas de navalha		nº 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Microsope confocal	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100X foi usado como lente objetiva.
Câmara			Caixa de plástico cheia de papel toalha embebida em
DW Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502