Method Article

Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência In Situ Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/54224

⸱

August 4th, 2016

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Relatamos um procedimento conciso de hibridização in situ fluorescente (FISH) na gônada e embriões de Caenorhabditis elegans para observação e quantificação de sequências repetitivas. Observamos e quantificamos com sucesso duas sequências repetitivas diferentes, repetições de telômeros e modelo de alongamento alternativo de telômeros (TALT).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telômero é uma estrutura ribonucleoproteica que protege as extremidades cromossômicas da fusão e degradação aberrantes. O comprimento dos telômeros é mantido pela telomerase ou por uma via alternativa, conhecida como alongamento alternativo dos telômeros (ALT)1. Recentemente, C. elegans emergiu como um organismo modelo multicelular para o estudo dos telômeros e ALT2. A visualização de sequências repetitivas no genoma é fundamental para entender a biologia dos telômeros. Embora o comprimento dos telômeros possa ser medido por ensaio de fragmento de restrição de telômeros ou PCR quantitativo, esses métodos fornecem apenas o comprimento médio dos telômeros. Pelo contrário, a hibridização in situ fluorescente (FISH) pode fornecer as informações dos telômeros individuais nas células. Aqui, fornecemos protocolos e resultados representativos do método para determinar o comprimento dos telômeros de C. elegans por hibridização in situ fluorescente. Este método fornece um procedimento in situ simples, mas poderoso, que não causa danos perceptíveis à morfologia. Usando ácido nucleico peptídico (PNA) marcado com fluorescência e sonda marcada com digoxigenina-dUTP, fomos capazes de visualizar duas sequências repetitivas diferentes: repetições de telômeros e molde de ALT (TALT) em embriões e gônadas de C. elegans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telômeros protege as extremidades cromossômicas de fusão e degradação aberrante. dos telómeros de mamífero é composto de repetições rico em G hexaméricas, TTAGGG, e complexos shelterin. A sequência do telómero repetição da nemátodo é semelhante aos dos mamíferos (TTAGGC). A maior parte dos eucariotas utilizam telomerase para adicionar repetições telómeros para as suas extremidades cromossómicas. No entanto, de 10 - 15% de células de cancro utilizam mecanismo independente da telomerase, conhecido como Alongamento Alternativa dos telómeros (ALT) 3. Anteriormente, relatou que repete a telómeros e suas sequências associados, nomeados como tAlt, foram amplificados nos telômeros de linhas mutantes de telomerase que sobreviveram a esterilidade crítica 2.

Comprimento dos telómeros foi medida por PCR quantitativo, ou por transferência de Southern, o que proporciona o comprimento médio do total de telómeros 4,5,6,7. Contagem lida da repetição dos telômeros em dados de sequenciamento do genoma inteiro é também um indicador do total conteúdo dos telômeros 8. embora Single telômero Comprimento Análise (STELA) poderia fornecer o comprimento de uma única telômeros, ele não pode fornecer informação espacial dos telômeros 9. Enquanto POT-1 :: proteína repórter mCherry fornece a informação espacial dos telômeros in vivo, não pode representar comprimentos de telômeros de cadeia dupla, como POT-1 é um single-filamento de proteína 10 de ligação dos telômeros.

Embora os métodos acima mencionados fornecer as informações média de seqüências repetitivas, hibridização fluorescente in situ (FISH) permite observar a quantidade e padrão espacial das seqüências individuais de interesse em uma escala cromossômica. Em vez da purificação do ADN, os tecidos ou as células são fixadas para preservar a informação espacial nativa em peixes. Assim, o peixe é uma ferramenta quantitativa e qualitativa para a observação de sequências de repetição individuais, como repete a telómeros.

Este protocolo fornece um método eficiente para a detecção simultânea de ambos telomeros e outras repete com base em melhorias de métodos anteriormente descritos 11,12. C. elegans larvas ou adultos são organismo multicelular com células altamente diferenciadas. A heterogeneidade das células impede-se na análise quantitativa de um grande número de pontos a telómeros. Para maximizar o número de células analisadas, os embriões são isolados e espalhe sobre as lâminas revestidas com polilisina para os peixes. Além disso, este protocolo pode também ser combinada com a imunofluorescência.

Como uma prova de que o protocolo funciona, mostram que é possível observar e quantificar duas sequências repetitivas diferentes. sonda de DNA contra TALT1 foi gerado com simples PCR incorporando digoxigenina-dUTP. Em seguida, esta sonda TALT1 e sonda PNA telômero marcados com fluorescência foram hibridizadas simultaneamente. Subsequentemente, digoxigenina foi detectada por métodos de imunofluorescência canónicas. Apresentamos aqui as imagens representativas onde TALT1 colocalized com o telômero no TRT-1 sobreviventes.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. As sondas de marcação com digoxigenina-dUTP por PCR

  1. Realizar etiquetagem 10x PCR com mistura de dNTP contendo digoxigenina-dUTP como previamente descrito 13.
  2. Purificar produto de PCR com a purificação spin-coluna de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Se a sonda é mais curto do que 200 pb, remover livre digoxigenina-dUTP por cromatografia em coluna de spin-a partir da mistura reaccional em vez de purificação de spin-coluna.

2. Preparar Slides polilisina revestido

Nota: O procedimento completo demora cerca de 2 horas. A maior parte dos passos são realizados à temperatura ambiente excepto para o passo de secagem.

  1. Limpeza das lâminas
    1. Colocar as lâminas em um recipiente plástico e enxaguar as lâminas brevemente com água destilada (DW). Remover a água e encher o recipiente com DW contendo 1% de limpa-vidros.
    2. Agita-se as lâminas durante 15 minutos a 50 rpm à temperatura ambiente (TA). Lavar as lâminas com DW 3vezes durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
    3. Lavam-se as lâminas com etanol a 70% durante 15 min com agitação. Descartar 70% de etanol e colocar as lâminas sobre um bloco seco de 65 ° C e secar ao ar durante 15 min.
  2. polilisina revestimento de lâminas de vidro multi-poços
    Nota: revestimento polilisina de vidro corrediça é um passo importante, uma vez que prevê a adesão da amostra durante todo o processo de coloração. Mal lâmina revestida irá resultar na perda de amostra.
    1. Dilui-se a solução stock de polilisina a 0,01% (w / v) em água destilada. Adicionar 20 ul da diluído a 0,01% (w / v) de polilisina para os poços de uma lâmina de vidro limpa.
    2. Incubar a lâmina de vidro durante 5 min à TA.
    3. Colocar as lâminas em um bloco seco a 65 ° C e ar seco durante 1 h.
    4. Armazenar os slides polilisina na caixa livre da poeira.

3. Fixação de Worms na lâmina de vidro (Figura 1)

  1. Preparando embriões para FISH
    Nota: vermes Colheita antes de tudo tele comida bacteriana é consumida por assistindo os meios de crescimento sob o microscópio. A fome reduz a produção de ovos de vermes adultos e aumenta a eclosão dos ovos. Métodos pormenorizados são descritos em 14,15.
    1. Cresça os vermes em 50 mM de placa de Petri de acordo com métodos padrão 14.
    2. Depois de toda a comida bacteriana é consumido, cortar o ágar no trimestre com uma espátula. Esterilizar a espátula antes de cortar para evitar a contaminação.
    3. Coloque todo o pedaço de agar na 100 milímetros meios de crescimento de nematóides (NGM) placa. Vire a peça agar de cabeça para baixo para os vermes para alcançar a comida bacteriana fresca.
    4. Após 48 a 72 horas, recolher os vermes com tampão M9. Adicionar 3 - 5 ml de tampão M9 na placa NGM. Pipeta tampão M9 na superfície de NGM para lavar os vermes.
    5. Recolhe-se o líquido com vermes e adicionar a um tubo de 15 ml.
      Nota: Se houver resíduos agar após a colheita, centrifugar os vermes em uma solução de sacarose 30%. Enquanto os detritos são sedimentadas, vermes flutuar sobrea superfície.
    6. Adicionar tampão M9 para tornar-se o volume para 15 ml. Agregar as minhocas por centrifugação a 300 xg durante 3 min e remover a maior parte do tampão M9. Repita este passo mais 2 vezes.
      Nota: Se os vermes ainda estão flutuando após a centrifugação, defina o nível de freio da centrífuga para o valor = 1.
    7. Aspirar tampão M9. Adicionar solução de branqueamento para os vermes. Por 0,5 ml de vermes, adicionar 6,5 ml de DW, 2 ml de hipoclorito, 1 mL de 5 M KOH.
    8. Incubar os vermes com agitação à TA durante 3 min a 50 rpm. vermes vortex durante 15 segundos para cortar mecanicamente os vermes e expor os ovos.
    9. Observe o tubo sob um microscópio de dissecção durante o clareamento. Certifique-se de que os vermes são cortadas ao meio e os ovos são liberados. Quando a maior parte do corpo adulto é dissolvido, adicione tampão M9 para tornar-se o volume para 15 ml.
    10. Centrifugar a 300 xg durante 3 min. Aspirar a maior parte da M9 e adicionar tampão M9 fresco para fazer aumentar o volume para 15 ml. etapa de lavagem Repita 3 vezes.
      Nota:Evitar o uso de quantidade excessiva de vermes, em que dificultam o processo de branqueamento. Manter o tempo de reacção total a menos de 8 minutos até a lavagem. Over-branqueada ovos produzem forte autofluorescência.
    11. Adicionar solução salina tamponada com fosfato de polissorbato-20 (PBST) até 200 uL e 200 uL de paraformaldeído a 4% (PFA) para tornar a 2% de PFA.
      Atenção: Desde PFA é cancerígeno, usar vestuário de protecção, luvas e proteção ocular antes de utilizar PFA.
    12. Adicionar 40 ul de os ovos em 2% de PFA para o poço de polilisina revestida slides.
    13. Colocar as lâminas numa câmara húmida e incubar durante 15 min à TA. Feche a câmara úmida logo após os slides são colocados dentro.
      Nota: Os ovos para liquidar o fundo de slides enquanto está a ser corrigido.
  2. Preparando gônadas dissecados para peixes
    1. Colheita vermes adultos crescidos em 50 mm placa NGM pipetando 1 ml de tampão M9. vermes colheita antes de alimentar bacteriana está esgotada.
    2. Lave os vermes a partir de qualquer wit bactériash tampão M9, 2 vezes.
      Nota: as bactérias residuais podem interferir com as gônadas dissecados de degola para lâminas de polilisina revestido.
    3. Agregar as minhocas por centrifugação a 300 x g. Remover M9 e transferir os vermes à placa NGM vazia por micropipeta.
    4. Adicionar 30 mL de tampão M9 contendo levamisole 2 mM em um poço de polilisina tratada slide.
    5. Adicionar 500 ul de tampão M9 para um tubo de 1 ml. Utilize este tampão para transferir os vermes com uma pipeta boca.
    6. Encher a ponta da pipeta de boca com tampão M9 pela colocação de um capilar no tubo 1 ml contendo o tampão M9.
    7. Sob microscópio de dissecação, coloque a ponta da pipeta na boca apenas na frente da cabeça do verme adulto e arraste pipeta de boca de modo que a cabeça de vermes entra na pipeta de boca. Uma vez que a cabeça de vermes entra a ponta, todo o corpo de verme serão atraídos para a ponta.
    8. Transfira os vermes para o slide polilisina revestido usando pipeta boca.
    9. Usando uma navalha, corte def a cabeça ou a ponta da cauda de vermes no slide. Quando o worm é cortado, as gônadas irá aparecer. Gônadas vai ficar com os slides.
      1. Preparar pelo menos 30 vermes em um poço. Mais poços pode ser usado por mais 30 vermes.
    10. Coloque a lâmina na câmara húmida e aspirar o tampão de M9 com pipeta de boca.
    11. Fixar a amostra por adição de 20 ul de 2% de PFA à TA durante 15 minutos em câmara húmida.

4. Fixação e permeabilização

  1. Coloque um bloco de alumínio em gelo seco e armazená-lo em um congelador (-80 ° C). metanol loja e acetona em -20 ° C.
  2. Após PFA passo de fixação 3.1.15 ou 3.2.11, remova o fixador usando micropipeta deixando ~ 5 mL do fixador.
  3. Coloque outro slide polilisina revestido na lâmina de amostra. Remover o fixador com toalha de papel, se a solução for excessiva. Não mova os slides uma vez que eles estão presos juntos.
  4. Congelar as lâminassobre o bloco de alumínio de pelo menos 15 min.
    Nota: As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 2 - 3 dias.
  5. Enquanto os slides estão sendo congelados, coloque os frascos contendo metanol frio e acetona em gelo.
  6. Tome os slides fora e torcê-los a congelar-rachar a amostra. Descartar a corrediça superior. mergulhar imediatamente o slide para o metanol gelado durante 5 min.
  7. Transferir as lâminas para acetona arrefecida em gelo durante 5 min.
  8. Lavar as lâminas 3 vezes com PBST, durante 5 min para remover fixador residual. Avance para o próximo passo ou armazenar as lâminas em etanol a 100% a 4 ° C.
    Nota: As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 2 - 3 dias.

5. Hibridação de células fixadas

  1. Adicionar 20 ul de solução de RNase (PBST contendo 10 ug / ml de RNase A). Incubar a lâmina na câmara húmida a 37 ° C durante 1 h.
  2. Lava-se a corrediça duas vezes em solução salina e 2x com citrato de sódio polissorbato-20 (2x SSCT) durante 15 min cada.
  3. Adicionar 20ul de solução de hibridação e o colocar em câmara húmida a 37 ° C incubadora. Depois de 1 h, remover a solução de hibridação por pipetagem.
  4. Antes de remover solução de hibridização, preparar a sonda. Se a sonda é DNA de cadeia dupla, desnaturar as sondas por aquecimento a 95 ° C durante 5 min num bloco seco. Após o aquecimento, esfriar a sonda brevemente gelo.
  5. Adicionar 10 ul de solução de hibridação contendo sonda com a amostra. Para sonda de PNA, a concentração de uso a uma razão de 1: 2000 e de uma sonda marcada com Dig, concentração de uso a uma razão de 1: 200. Cobrir a amostra com tampa de vidro.
  6. Coloque uma toalha de papel embebido com água sobre o bloco de aquecimento (80 ° C). Coloque uma tampa de caixa de plástico no bloco de aquecimento para preservar a umidade e temperatura.
  7. Depois de a temperatura do bloco de aquecimento se estabilizou (a 80 ° C), colocar a lâmina de amostra sobre a toalha de papel e aquecida cobrir as amostras com a tampa da caixa de plástico. Desnaturar a amostra durante 3 minutos.
  8. IncUbate as lâminas em câmara úmida durante a noite a 37 ° C.

6. lavagens e Imunofluorescência

  1. Aquecer a solução de lavagem de hibridação (SSC 2x, 50% de formamida) a 37 ° C.
  2. Lava-se a amostra em duas vezes o PBST à TA durante 5 min. Retire a tampa de vidro.
  3. Lava-se a amostra na solução de lavagem de hibridação a 37 ° C durante 30 min.
  4. Lave a lâmina de amostra em PBST 3 vezes à temperatura ambiente. Nota: Execute todos os passos subsequentes na câmara húmida à temperatura ambiente.
  5. Adicionar 20 ul de solução de bloqueio e incubar durante 1 h à TA na câmara húmida.
  6. Remoção da solução de bloqueio e adicionar solução de anticorpo conjugado com FITC anti-digoxigenina (1: 200) durante 3 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.

7. Montagem e Observação

  1. Lava-se a lâmina de amostra com PBST 2 vezes durante 15 minutos cada.
  2. Adicionar 10 ul de solução de montagem com DAPI. Coloque a tampa de vidro e pressione suavemente. Remova qualquer excesso de soluçãocom uma toalha de papel.
  3. Para evitar a evaporação da solução de montagem, selar as bordas da tampa de vidro com unha polonês.
  4. Observar ao microscópio confocal. Excluir embriões com elevado ruído de fundo. Concentre-se em um campo com 4 - 20 núcleos.
  5. Tome imagens de acordo com as instruções do fabricante com lente objetiva de 100X.
    Nota: Excite amostra com 405 a laser nm para DAPI, com 555 a laser nm para Cy3, com 488 a laser nm para FITC.

8. Quantificação dos Telómero sinal

Nota: A quantificação foi realizada tal como anteriormente descrito 16. Todas as imagens que estão a ser comparadas deve ser tomado com mesma configuração, incluindo o tempo de exposição e uma fonte de luz.

  1. Exportar a imagem em formato .tif.
  2. Baixar e instalar o software de análise de imagem.
  3. Executar o software de análise de imagem e clique no botão Concordo.
  4. Clique no botão aberto. Abra as imagens com os peixes dos telômeros, clicando duas vezes no arquivo de imagem.
  5. Clique[Editar] - [região de processamento seleção], seleccione uma região de interesse por clique com o botão esquerdo e arrastando. Excluir toda a coloração não específica.
  6. Clique [medida] - [manchar densidades ópticas], selecione o canal com o sinal dos telômeros e digite o nome do arquivo para salvar os resultados no arquivo .txt.
    Nota: A coluna de resultados estão na seguinte ordem: A fluorescência de ponto, a intensidade da mancha e a área da mancha de fundo.
  7. Copiar os valores e subtrair intensidade da mancha de fundo de fluorescência da mancha. Os valores podem agora ser analisados ​​estatisticamente.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foi relatado anteriormente que o sobrevivente ALT pode emergir de mutante telomerase deficiente, TRT-1 (ok410), em baixa frequência, replicando localizada internamente 'Template da ALT' (tAlt) sequências para manutenção dos telômeros 2. Usando sonda PNA, fomos capazes de visualizar os telômeros nas gônadas dissecados (Figura 2A). O sinal dos telômeros fraco foi detectado tanto no TRT-1 (ok410) e sobrevivente ALT. O sinal fuzzy foi sobreposto ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A principal vantagem do nosso protocolo é a simplicidade do processo sem danos visíveis para a morfologia da estrutura celular. Vários passos foram otimizados para C. elegans FISH neste protocolo. Os passos críticos para os peixes de sucesso incluem a rotulagem de sondas, a fixação de embriões e penetração. método de marcação com digoxigenina-dUTP fornece um método de rotulagem de fácil utilização por PCR ou por nick-translation. Para rotular sequência alvo por muito tempo, é o preferido nick-translation. Neste...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cepas de vermes mutantes foram gentilmente cedidas pelo Caenorhabditis Genetics Center. Esta pesquisa foi apoiada por uma doação do Projeto de P&D de Tecnologia de Saúde da Coreia por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria de Saúde da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar da República da Coreia (número de concessão: HI14C1277).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sonda PNAPANAGENEpedido
Anti-Digoxigenina-Fluoresceína, fragmentos de FabRoche11207741910uso 1:200 diluído em PBST
Digoxigenina-dUTPRoche11573152910
Albumina de soro bovinoSIGMA-ALDRICHA-7906
ParaformaldeídoSIGMA-ALDRICHP-6148preparar paraformaldeído a 4% aquecendo em DW com poucas gotas de NaOH. adicione 0,1 volume de 10x PBS.
VectashieldVector LaboratoriesH-1200
hibridização3x SSC, 50% formamida, 10% (p/v) sulfato de dextrano, 50 μ g/ml de heparina, 100 μ g/ml de tRNA de levedura, 100 μ g / ml de esperma de salmão sonicado DNA
Solução de lavagem2x SSC, 50% de formamida
FormamidaBIONEERC-9012metanol tóxico
Carlo Erba
AcetonaCarlo Erba
HeparinaSIGMA-ALDRICHH3393faça 10 mg / ml para solução estoque
Sulfatode dextranoSIGMA-ALDRICH67578
10x PBSPara 1 L DW: 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4• 7H2O, 2,4 g KH2PO
PBST1x PBS, 0,1% tween-20
Polissorbato 20SIGMA-ALDRICHP-2287O nome comercial é Tween-20
Solução de poli-L-lisina (0,1% p/v)SIGMA-ALDRICHP-8920prepare uma solução fresca a 0,01% p/v antes de usar
M93 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml de 1 M MgSO4, H2O a 1 L
Solução dehipoclorito de sódio a 20%, 0,5 M KOH
Tampão1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Azida de sódio (tóxico)
SoluçãoTampão de anticorpo com 5% de albumina de soro bovino (BSA)
illustra Microspin G-50GE healthcare27-53310-01
20x SSCPara fazer 1 L, 175,3 g de NaCl, 88,2 g de citrato de sódio, H2O a 1 L, ajustar o pH para 7,0
2x SSCT2x SSC, 0,1% tween-20
10x digoxigenina-dUTP misturar1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP
Colunas de purificação PCR CosmogenetechCMR0112
Limpador de vidros / ULTRA CLEANDukssan pure chemicals8AV721
Lâmina de vidro com vários poçosMP biomedicals
crescimento de nematóidesPara fazer 1 L, 3 g de NaCl, 17 g de ágar, 2,5 g de peptona, H2O a 974 ml. Autoclave e resfrie o frasco. Adicionar 1 ml de 1 M CaCl2, 1 ml de 4 mg/ml de colesterol em etanol, 1 ml de 1 M MgSO4, 25 ml de 1 M KPO4.
LevamisolSIGMA-ALDRICH196142
Lâmina de penas de navalhanº 11
Rnase AEnzynomics
BSASIGMA-ALDRICHA7906
Microsope confocalZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X foi usado como lente objetiva.
CâmaraCaixa de plástico cheia de papel toalha embebida em
DW Image Analysis SoftwareDr. Peter LandsdorpTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502
personalizadoSolução de de hibridização branqueamento de anticorpo de bloqueio 96041205Meios de úmida

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