Isolamento de células progenitoras Mesangiogenic (PPM) de humano Medula Óssea

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo otimizado e altamente reprodutível para isolar células progenitoras mesodérmicas (MPCs) da medula óssea humana (hBM). As MPCs foram caracterizadas por citometria de fluxo e expressão de nestina. Eles mostraram a capacidade de dar origem a culturas de células semelhantes a MSC de crescimento exponencial, mantendo seu potencial angiogênico.

Resumo

Em um estudo de pesquisa com o objetivo de isolar células estromais mesenquimais (MSCs) derivadas da medula óssea humana (hBM) para aplicações clínicas, identificamos uma nova população de células especificamente selecionada para crescimento em meio suplementado com soro humano. Essas células são caracterizadas por características morfológicas, fenotípicas e moleculares distintas das MSCs e as chamamos de Células Progenitoras Mesodérmicas (MPCs). Os MPCs são redondos, com uma região central espessa e altamente refringente; eles mostram forte adesão resistente à tripsina ao plástico. A falha em expandir os MPCs revelou diretamente que eles são lentos no ciclismo. Isso também é sugerido pela negatividade do Ki-67. Por outro lado, a cultura de MPCs em meio padrão projetado para expansão de MSC deu origem a uma população de células semelhantes a MSC em crescimento exponencial. Além de apresentarem capacidade de diferenciação mesenquimal, os MPCs mantiveram o potencial angiogênico, confirmando sua natureza progenitora de múltiplas linhagens. Aqui descrevemos um protocolo otimizado altamente reprodutível para isolar e caracterizar hBM-MPCs por citometria de fluxo (CD73, CD90, CD31 e CD45), expressão de nestina e organização de F-actina. Protocolos para diferenciação mesengênica e angiogênica de MPCs também são fornecidos. Aqui também sugerimos uma nomenclatura mais apropriada para essas células, que foi renomeada como "Células Progenitoras Mesangiogênicas".

Introdução

Células estromais mesenquimais (MSCs) são de valor clínicas relevantes para a sua capacidade de diferenciação multi-linhagem e sua capacidade para suportar hematopoiese, para secretar factores de crescimento / citocinas, bem como para desempenhar um papel na imunorregulação ^1. Na definição de produção de células de terapias à base de MSC e aplicação têm sido objeto de extensa pesquisa clínica e pré-clínica ^2, com particular atenção à regulamentação internacional específica para a segurança e eficácia do medicamento celular (CBMP) tratamentos ³ base. MSCs humanas são extensivamente cultivadas em meios contendo suplementos e reagentes de origem animal, tais como soro fetal bovino (FBS) e tripsina bovina. Portanto, ao lado com os riscos infecciosos associados à manipulação de células, os pacientes também enfrentam prion exposição, bem como os riscos imunológicos ligados a proteínas, peptídeos ou outras biomoléculas de origem animal que podem persistir após a colheita de células e transplantaçãotação ^4.

Para contornar o problema, foi realizada cultura de medula óssea humana (HBM) MSCs -derived em meio livre de animal, substituindo FBS com pool humano do tipo AB de soro (PhABS). Sob estas condições, juntamente com as MSCs que crescem identificamos uma população de células novo. Estas células eram morfologicamente e fenotipicamente diferente do MSC e mostrou um perfil de expressão do gene distinto, bem como propriedades de crescimento / aderência característicos. Eles mantiveram ambos os mesengenic e angiogénicos potencial e, portanto, foram nomeados células progenitoras Mesodérmico (PPM) ^5. Posteriormente, fomos capazes de definir as condições de cultura seletivos e reprodutíveis para gerar PPM com alto grau de pureza ^6.

Investigamos ainda mais as propriedades morfológicas e biológicas dos PPM. Os PPM mostrou ser nestina-positivas, lento no ciclismo, Ki-67 negativo e com cromossomos caracterizadas por longos telômeros ^5. Eles expressaram plurtranscrição ipotency-fatores associados master reguladores MSC Runx2 e Sox9 ⁷ Oct-4 e Nanog, em vez de. Fenotipicamente, PPM expressa endoglin (CD105) no nível mais baixo do que MSCs ao faltar marcadores mesenquimais CD73, CD90, CD166. PPM também mostrou um padrão distinto de moléculas de adesão, caracterizado por expressão consistente de PECAM (CD31), as integrinas aL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c), bem como integrina β2 (CD18) que sustenta especificamente estruturas podosome semelhante ⁸ . Nos meios de comunicação de expansão MSC standard, PPM prontamente diferenciado em MSCs por um estágio intermediário com a ativação de células Wnt5 / calmodulina sinalização ^9. PPM também manteve propriedades angiogênicos, como demonstrado pela sua capacidade de brotar esferóides em murino matriz extracelular (ECM) culturas proteína 3D. O potencial angiogênico foi rapidamente perdido após MPC diferenciação ao longo da linhagem mesengenic.

Aqui nós apresentamos proprotocolos otimizados para isolar e caracterizar PPM altamente purificados a partir de amostras de sangue HBM. protocolos reprodutível para MPC mesengenic e diferenciação angiogénica também são descritos.

Protocolo

NOTA: Após consentimento por escrito, as amostras HBM foram obtidos durante a cirurgia ortopédica para substituição da anca. Imediatamente após a osteotomia do colo do fémur e antes femoral mandrilagem uma seringa de 20 ml que contém 500 UI de heparina, foi utilizada para aspirar BM fresco. O protocolo é para ser considerada amplamente aplicáveis ​​a qualquer fonte de BM.

1. Isolamento de osso humano células da medula mononucleares (HBM-PTM)

1. Diluir 5 - 10 ml de BM fresco a 50 ml, aplicar solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) e misturar por inversão. Igualmente distribuir 25 ml em dois novos tubos de 50 mL cónico, juntar 25 ml de D-PBS a cada tubo e misturar por inversão.
2. Permitir que os tubos repousar durante 10 min à temperatura ambiente, para a separação de fragmentos de osso minerais e gordura a partir da solução.
3. Cuidadosamente remover a gordura flutuante com uma suspensão de células pipeta e filtro de Pasteur estéril através de 70 mm filtros sem perturbar o fragmento pellet óssea mineral.
4. Ajuste quatro tubos de 50 ml com 15 ml de meio por centrifugação descontínua de gradiente de densidade (1,077 g / ml). Certifique-se de que este meio é a temperatura ambiente.
5. Cuidadosamente, coloque 20 - 25 ml da BM diluída em cima do meio de gradiente de densidade. Executar esta operação com cuidado, deixando trickle suspensão de células nas paredes do tubo para evitar camadas de mistura.
6. Realizar centrifugação em gradiente de densidade a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente com freio desativados.
7. Recolhe-se o anel esbranquiçado de células localizadas entre as duas fases utilizando uma pipeta de Pasteur estéril e transferi-lo para um tubo fresco de 50 mL.
8. as células com meio de cultura fresco Lavar: fenol livre de vermelho, baixo teor de glucose (1000 mg / L) de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% (v / v) reunidas tipo AB de soro humano (PhABS), 2 mM de L-glutamina e antibióticos (DMEM / 10% PhABS). Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
9. Aspirar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em 5 - 10 ml de DMEM fresco / 10% PhABS.
10. Prossiga para a contagem de células.Determinar o número de glóbulos brancos por diluição 1: 1 de tripano. Aplicar isso ao hemocitômetro, e observar em um microscópio de contraste de fase. Excluir pequenas e perfeitamente arredondados eritrócitos e células mortas coradas de azul a partir da contagem de células.
    NOTA: É altamente recomendável para PhABS tela lotes por seu desempenho na recuperação MPC. PhABS de fontes EUA têm dado melhores resultados, enquanto a maioria dos soros de origem diferente resultou em culturas MPC com percentagens mais elevadas de células MSC-like.

2. Isolamento de PPM da HBM-PTM

1. Definir hidrofóbicos frascos T-75 com 15 ml de DMEM / 10% PhABS frescos e deixar equilibrar o pH e temperatura por pré-incubação a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 30 min.
2. Semente 4-6 x 10 ⁷ HBM-MNCs por frasco e incubar a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 48 horas.
3. Aspirar e descartar células médio e não aderentes a partir de frascos. Adicionar 15 ml de DMEM / 10% de PhABS fresco e incuba-se a 37 ° Cem 5% de CO _2. Manter culturas durante 6 - 8 dias, a mudança média a cada 48 horas.
   Opcional: Para aumentar o rendimento da MPC, as células não aderentes de 2,3 poderia ser re-plaqueadas em um novo frasco de cultura e mantidas como descrito para as culturas primárias.
4. Aspirar e descarte médio de frascos, lavar com DMEM fresco e adicionar 2 ml de protease livre animais solução destacando. Incubar a 37 ° C durante 5-15 min (evitar incubação prolongada).
5. Adicionar 10 ml de DMEM fresco PhABS / 10%, aspirar a suspensão celular e centrifugue a 400 xg durante 5 min
6. Aspirar e elimine o sobrenadante e re-suspensão sedimento em 1 - 2 ml de DMEM fresco / 10% PhABS. Avance para contagem de células, tal como descrito no passo 1.10.
   NOTA: Não use tripsina / EDTA como separar reagente. PPM tripsina são resistentes. rastreio morfológica das culturas, antes da colheita das células, é altamente recomendada a fim de avaliar a presença de células-MSC como fusiformes. No caso de quantidade considerável de células MSC-like são detected, aumentar a pureza do produto por remoção selectiva de células as células contaminadas. Para fazê-lo, a digestão com tripsina pode ser levada a cabo antes da colheita MPC, por adição de 2 ml de tripsina / EDTA a 0,05%, durante 2 min. culturas de lavagem duas vezes com 5 ml de DMEM / 10% PhABS, em seguida, proceder à protease tratamento como acima.

Caracterização 3. celular

1. Citometria de fluxo
   1. Defina-se amostras duplicadas de 10 ⁵ células recentemente isoladas em solução de lavagem: D-PBS suplementado com 0,5% (v / v) de albumina de soro bovino (BSA) e 0,02% (w / v) de azida de sódio. Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
      CUIDADO: A azida sódica é tóxica.
   2. Re-suspender pelotas em 200 ul de solução de lavagem e adicionar anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 e anticorpos anti-CD31 conjugados com corantes fluorescentes ( "test"); em paralelo configurar os controles isotípicos ( "Ctrl").
      NOTA: Os valores de coloração de anticorpos deve ser determinada por titulação ou According as instruções do fabricante.
   3. Incubar as amostras a 4 ° C durante 30 min.
   4. Centrifugar a 400 xg durante 5 min. Células em 500 mL de solução de lavagem Re-suspender e adquirir pelo menos 5 x 10 ⁴ eventos fluxo multicolor citômetro ^{7 9 10.}
   5. Analisar os resultados por dot-plots e usar "Ctrl" eventos registrados para definir quadrantes.
      NOTA: De modo a definir a cultura como cultura MPC a percentagem de CD73 CD90 ^{NEG NEG} CD45 ⁺ CD31 ⁺ células deve ser superior a 95%. Para algumas aplicações específicas, isto é, a análise da expressão de genes, a recuperação de corte tem de ser aumentada para 97-98%.
2. detecção e análise nestina organização F-actina
   1. Placa PPM recentemente isoladas em lâminas de câmara de cultura (20.000 / cm ^2). Permitir que as células aderir por incubação durante a noite a 37 ° C em 5% de CO _2.
   2. Lave as células na solução de lavagem e fiX em 4% (w / v) de para-formaldeído à temperatura ambiente durante 15 min. Para remover fixador adicionar solução de lavagem, incubar por 2 min e despeje.
   3. Repetir a lavagem duas vezes.
   4. Permeabilizar as células em D-PBS suplementado com 0,05% (v / v) de Triton X-100 durante 15 min à TA.
   5. Pare reacção por potenciador de proteína livre de sinal (30 min à temperatura ambiente) ou solução padrão de bloqueio (D-PBS suplementado com 3% (w / v) de BSA).
   6. Remover intensificador de sinal / solução de bloqueio.
   7. Adicionar 7 ug / ml (w / v) de anticorpo primário anti-humano nestina e incubar a 4 ° C durante a noite numa câmara humidificada. Em paralelo, utilizar anticorpos de controlo isotípicos para avaliar sinais de fluorescência não específicas.
   8. Lavagem das lâminas através da adição de D-PBS, deixe por 2 minutos e despeje. Repita duas vezes.
   9. Adicionar 2 ug / ml (w / v) de anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente e incubar a 4 ° C durante 1 h no escuro.
   10. Lavagem das lâminas como acima.
   11. Adicionar faloidina fluorescente (5 UI / ml), deixar à temperatura ambiente durante 30 mem no escuro e lava-se 3 vezes em D-PBS.
   12. Remover as paredes da câmara e montar as lâminas em meio de montagem aquoso suplementado com antifade reagente e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para a detecção de núcleos. Avance para imagiologia ^{7 9 10.}

4. Mesengenic Diferenciação de PPM

1. Placa de 2 x 10 ⁴ / cm ² PPM isolados de fresco em frascos de cultura T75-tratados TC e deixar as células aderir durante a noite em DMEM / 10% PhABS a 37 ° C em 5% de CO _2.
2. Substituir DMEM / 10% PhABS com meio padrão de soro reduzida, cerca de 200 ul / cm ^2, concebido para a expansão das células do mesênquima do estroma (meio de MSC-RS). Crescer as células até à confluência (P1-MSC), tipicamente de 7 a 10 dias após a indução. Atualizar média a cada 2 dias.
3. Aspirar e descarte médio a partir de frascos, lave com meio MSC-RS fresco e adicionar 2 ml de protease livre animais solução destacando. Incubar a 3776; C por 5-15 min (evitar a incubação prolongada).
4. Adicionam-se 10 ml de meio fresco MSC-RS, aspirar a suspensão celular e centrifugue a 400 xg durante 5 min
5. Aspirar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em 1-2 ml de meio fresco MSC-RS. Avance para contagem de células, tal como descrito no passo 1.10
6. Avance para o sub-cultura los por sementeira 3-5 x 10 ³ células / ^cm2. Crescer as células até à confluência (P2-MSC).
7. Células colheita por digestão protease como descrito a partir do passo 4.3 para a etapa 4.5 e proceder à caracterização como descrito na seção 3.
   NOTA: A percentagem de células CD31 ^{neg neg} CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD45 inferior a 95% indicaria única diferenciação parcial e requer uma nova passagem de cultura.
8. Placa P2-MSCs a 2 x 10 ⁴ / cm ² em placas de seis poços TC-tratada e crescer até à confluência em meio de MSC-RS.
9. Mark dois poços como "Não Diff" e atualizar meio MSC-RS.
10. Mark duas bems como "Osteo" e substituir médio com 200 ul / cm ² de meio osteogénico padrão, projetado especificamente para a diferenciação MSC.
11. Mark dois poços como "Adipo" e substituir o meio com 200 ul / cm ² de meio adipogênica padrão, projetado especificamente para a diferenciação MSC.
12. Manter as culturas a 37 ° C em 5% de CO _2, mudando inteiros os meios de comunicação a cada 48 h.
    NOTA: É altamente recomendável usar a mídia de diferenciação disponíveis comercialmente padrão para a reprodutibilidade teste. Depois de 2/3 semanas sob condições de diferenciação, depósitos de cálcio aparecem em culturas osteogênicas induzido, enquanto a acumulação de gotículas lipídicas intracelulares é evidente em células adipog�icas induzido.
13. Aspirar e descartar meios de cultura, em seguida, lavar com D-PBS.
14. Fixar as culturas por adição de 1 ml de 4% (w / v) de paraf ormaldeido durante 15 minutos à temperatura ambiente.
15. Para remover fixador adicionar D-PBS, incubar durante 2 min e verter. lavagem Repetirduas vezes.
16. Manchar uma "No Diff", juntamente com os dois "Osteo" marcou poços na solução fluorescente específica hidroxiapatita e um "Não Diff", juntamente com os dois "Adipo" marcou poços em 200 solução nM Vermelho do Nilo. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente ^11,12.
17. Remover manchas soluções e lave em D-PBS duas vezes.
18. Remover D-PBS, adicionar D-PBS suplementado com 50% (v / v) de glicerina e continuar a imagiologia ^{7 9 10.}

5. MPC Spheroid Sprouting Assay

1. Para produzir esferóides 3D, colocar 20 gotas ul de suspensão MPC isolada de fresco (1,5 x 10 ⁴ células / gota) na superfície interior de uma tampa de placa de Petri.
   NOTA: Como gotas de manipulação poderia levar à sua ruptura, é altamente recomendável para colocá-los em excesso.
2. usar cuidadosamente a tampa para recapitular uma placa de Petri contendo D-PBS para evitar gotas de suspensão de evaporação. Incubar a 37 ° C em 5% de CO ₂durante a noite para permitir que as células se agregar em esferóides 3D.
3. Definir um gel espesso de proteínas murinas matriz extracelular (ECM) por adição de alíquotas de 300 ul de proteínas de ECM padrão em uma placa de cultura de pré-refrigerado de 24 poços, e incuba-se a 37 ° C durante 30 min.
4. Cuidadosamente tombar a tampa placa de Petri e gentilmente pegar os esferóides utilizando uma pipeta Pasteur estéril.
5. Lay esferóides sobre o gel proteína da MEC, adicionar 700 mL alíquotas de meio de crescimento de células endoteliais ricas de VEGF-padrão e incubar a 37 ° C em 5% de CO _2.
6. Depois de 24 horas e aos 7 dias de cultura, tirar fotos das culturas 3D em 4X poder de ampliação. Avaliar brotando esferóides imagem Aplicando o software de análise medindo a distância radial entre a última célula invasora ea borda esferóide. medidas repetidas ao longo de pelo menos 20 direções diferentes. Distância média é considerado como positivo quando 50 mm ou mais.

Resultados

As condições de cultura seletivos aqui descritas permitiram o isolamento de um romance população de células aderentes e quase monomorphic como 1,0% do HBM-PTM (0,5 - 2,0 x 10 ⁶ HBM-as multinacionais a partir de 5 - 10 ml de amostras BM frescos) ^5,6 . Foram identificados estes grande (40 - 60 um de diâmetro), arredondado, as células quiescentes, Ki-67-negativas como PPM ^5. Morfologicamente, eles são caracterizados por um ovo frito-forma característica, com uma região central rodeada por uma espessura fina periferia plana mostrando lotes de filopios em maior poder de ampliação (setas brancas na Figura 1 A.1). Alongamento Polar do limite da célula externa é muitas vezes observado (setas pretas na Figura 1 A.1). Tal morfologia é claramente diferente da aparência típica em forma de fuso celular de estroma mesenquimal relatado em culturas de MSC padrão. Fluxo mostrou citometria de mais de 95% dos PPM recentemente isolados para expressar CD31 e CD45, enquanto mesenchymal marcadores associados CD90 e CD73 foram indetectáveis ^​​13 (Figura 1 A.2). Consideramos esse conjunto restrito de quatro antígenos como indicativo para PPM. Outras características distintivas de PPM são pontilhada distribuição F-actina revelando um número de estruturas podosome-like (vermelho na Figura 1 A.3) e a expressão intensa de nestina (verde na Figura 1 A.3), o que não é detectada nas células coradas com anticorpo de controlo isotípico (dados não mostrados).

PPM cultura in RS padrão médio projetado para o MSC expansão resulta em rápida diferenciação em crescimento exponencial células MSC-like (Figura 1 b.1). Após duas passagens células finalmente mudar seu fenótipo de CD73 CD90 ^{neg neg} CD45 ⁺ CD31 ⁺ para CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD45 CD31 ^{neg neg} (Figura 1 B.2). No processo, PPM re-Organize F-actina em fibras de stress, enquanto expressão nestin torna-se confinado a poucas células raras (Figura 1 b.3). MPC diferenciação mesengenic num fenótipo MSC como definido ocorre por meio de dois passos distintos reveladas por diferentes morfologias celulares. Após uma semana em meio de MSC RS uma população residual de células MPC-como ainda é detectável dentro de uma camada confluente de apartamento, as células multi-ramificados poligonais (P1-MSCs na Figura 2 A). Uma outra passagem é necessária para obter uma cultura quase monomorphic de fusiformes células MSC-like (P2-MSCs na Figura 2 A). Estas células em crescimento exponencial pode facilmente diferenciar-se em osteoblastos ou adipócitos quando transferido para o meio selectivo para, pelo menos, 2 semanas, confirmando assim a sua natureza MSC. Osteogénicos em culturas induzidas, depósitos de cálcio pode ser detectado por qualquer mancha de Alizarina S-colorimétrico ou corantes fluorescentes específicos (verdes na Figura 2 B). Após as células de indução adipog�icasmostram um acúmulo de gotículas de gordura, como revelado por qualquer colorimétrico Red Oil ou fluorescente mancha Nile Red (vermelho na Figura 2 B).

MPC digitação foi confirmada por brotando ensaio de angiogénese. PPM mostraram a sua capacidade para invadir (mais de 50 mm) de gel de proteínas de ECM de murino a partir de esferóides 3D após 24 h de VEGF-estímulo (Figura 2 C). Após uma semana as células invasoras foram detectados a 300-600 uM distância. Por outro lado, a capacidade de invasão foi perdido em P2-MSCs após a diferenciação mesengenic (Figura 2 D).

Figura 1. PPM recentemente isolados têm características distintivas. A cultura HBM-PTM em DMEM / 10% PhABS por sete dias dá origem a uma população de PPM de repouso (A) facilmente distinguível de MSCs (B) por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. PPM diferenciar em MSCs Standard e Mostrar Sprouting Angiogenesis in vitro. Substituição de DMEM / PhABS com RS disponíveis comercialmente médio projetado para a expansão MSC provoca indução mesengenic de PPM. Depois de uma semana em cultura poucas PPM residuais são ainda detectáveis ​​(P1-MSC), enquanto uma outra passagem em meio de MSC-RS leva a uma população de células confluentes, como MSC (P2-MSC, A barra de escala = 100 pm). P2-MSCs diferenciam terminalmente em osteócitos ou adipócitos sob estímulos adequados como revelado por deposição de cálcio (verde no B) e acúmulo de gotículas de gordura (vermelho em B, barras de escala = 200 mm), respectivamente. PPM mostrar surgimento consistente de esferóides em gel de proteína ECM murino (C) com uma diferença com P2-MSCs (D, barras de escala = 1,0 mm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Nas últimas décadas, as CTMs têm sido extensivamente pesquisadas e avaliadas pré-clinicamente para possível aplicação no tratamento de diversos distúrbios ósseos/articulares, imunológicos, neurológicos, cardiovasculares, gastrointestinais e hematológicos^14,15. O isolamento fácil e barato de CTMs multipotentes, de diversos tecidos, juntamente com sua falta de imunogenicidade significativa¹⁶, contribuem para tornar essas células uma das populações celulares mais interessantes a serem aplicadas em terapias baseadas em células. No entanto, a baixíssima frequência no tecido de origem representa uma grande limitação para a aplicação das CTMs nas clínicas, forçando a expansão dessas células, in vitro, antes da infusão ou transplante.

Culturas expandidas de CTM revelaram altos graus de heterogeneidade e variabilidade^17-19 , dificultando a obtenção de um consenso sobre os protocolos de produção e caracterização de CTM. Além disso, investigações recentes sugeriram a presença de múltiplos ancestrais de MSC in vivo em uma ampla gama de tecidos, o que contribui para a heterogeneidade da cultura^10,20. De fato, tem sido proposto que condições particulares de cultura possivelmente selecionam ou simplesmente promovem subpopulações específicas de progenitores de MSCs presentes, em várias porcentagens, em amostras "brutas" e não processadas, como medula óssea (hBM-MNCs) ou tecidos adiposos (fração vascular estromal)². Assim, a variabilidade nas populações de células iniciadoras de CTMs, juntamente com o grande número de diferentes protocolos de enriquecimento/isolamento e cultura aplicados, representam um grande obstáculo para a definição de terapias viáveis baseadas em CTM.

Um fator crucial que afeta a heterogeneidade das culturas de CTM é a suplementação sérica²¹. Em nossas mãos, a substituição de FBS por PhABS em culturas primárias de hBM-MNCs, combinada com semeadura de alta densidade em plásticos hidrofóbicos, levou ao isolamento de uma nova população de células altamente aderentes com características biológicas distintas denominadas MPCs^5,6. Observamos que a adição de pequenas porcentagens de PhABS às culturas primárias de FBS também permitiu o isolamento de MPC, sugerindo a presença de agentes indutores de MPC no soro humano⁶. No momento, o protocolo de isolamento/caracterização de MPC é um método único disponível para obter MPCs quase puros. O protocolo foi cuidadosamente ajustado e é altamente reprodutível para triagem de qualidade de preparações de MPC antes de outras aplicações.

Os MPCs podem ser usados como fonte para a produção de MSC, limitando assim a variabilidade introduzida pelo uso de material de partida não fracionado. A definição precisa das múltiplas etapas que caracterizam a diferenciação mesengênica MPC relatada⁹ permitiria a expansão sincronizada das células mesenquimais. No entanto, esta última condição pôde ser realizada exclusivamente aplicando população de MPC altamente purificada, como consequência da caracterização dos produtos celulares obtidos pelo protocolo aqui descrito, resultados de crucial importância. Este método de isolamento foi relatado permitindo a recuperação do MPC com pureza geralmente em torno de 95%. No entanto, a variabilidade doador/paciente, juntamente com a variabilidade relacionada aos diferentes lotes de soro humano combinado, pode levar a uma porcentagem significativa de células semelhantes a MSC co-isoladas junto com MPCs, sob condições seletivas.

Não está claro se essas células "contaminantes" do tipo MSC podem surgir de outros diferentes progenitores in vivo descritos na medula óssea²² ou da diferenciação descontrolada e espontânea de MPC. Em qualquer caso, uma porcentagem consistente de células semelhantes a MSC nos produtos MPC anula a possibilidade de aplicar essas células como material de partida homogêneo para a expansão do MSC. Assim, aqui foi sugerido um método simples e barato, baseado na resistência do MPC à digestão da tripsina, aumentando a pureza dos produtos MPC. Resultados semelhantes ou até melhores na purificação de culturas de MPC podem ser alcançados por classificação de células fluorescentes ou magnéticas realizando a depleção de CD73 e/ou CD90, mas prolongando significativamente o tempo do processo e aumentando os custos.

Além disso, os MPCs mostraram expressão de marcadores associados à pluripotência e Nestin, todos rapidamente perdidos durante a diferenciação mesengênica⁷. O ensaio de germinação revelou a capacidade do MPC de invadir o gel proteico murino da MEC. Em conjunto, esses resultados indicam que os MPCs devem ser considerados um progenitor mais imaturo, mantendo o potencial angiogênico. No entanto, o entusiasmo inicial sobre o potencial de diferenciação mesodérmica dos MPCs está diminuindo. De fato, após mais de 7 anos de estudos sobre MPCs, o potencial mesengênico e angiogênico foi extensivamente descrito^5-9, mas ainda falta diferenciação em relação a quaisquer outras células de origem mesodérmica. Assim, aqui propomos uma nova, e mais rigorosa, definição dessas células como "Células Progenitoras Mesangiogênicas", mantendo a sigla MPCs.

Acreditamos também que a maioria das controvérsias sobre o potencial angiogênico das CTMs pode estar relacionada à composição heterogênea de culturas expandidas constituídas por subpopulações de CPMs e CTMs em percentuais variáveis²³.

Finalmente, os MPCs também podem desempenhar um papel crucial para a implementação de CBMPs aplicáveis à reconstrução tecidual, pois essas células também podem suportar a neovascularização. De fato, estudos futuros sobre regeneração devem levar em consideração que o crescimento do tecido recém-formado deve ser suportado pela neoangiogênese concomitante. A coexistência de potencial mesengênico e angiogênico em MPCs pode melhorar significativamente o potencial de regeneração de novas abordagens terapêuticas que envolvam essas células interessantes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz de Membrana Basal Matrigel	BD Bioscience (San Jose, CA-EUA)	354230	Proteínas ECM murinas Concentração de estoque: 100% (9 - 12 mg/ml) Concentração final: 100%
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS)	Sigma (St. Louis, MO, EUA)	D8537
70 μ m Filtros	Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare (Uppsala, Suécia)	17-5442-03	meio para centrifugação de gradiente de densidade descontínuo
Soro humano tipo AB agrupado (PhABS)	LONZA (Walkersville MD-EUA)	14-490E	Concentração final: 10%
Glutamax-I	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	35050-038	L-Glutamina Estabilizada Concentração de Estoque: 100x Concentração Final: 2 mM
de Albumina de Soro Bovino (BSA)	Sigma (St. Louis, MO, EUA)	A8412	Concentração de Estoque: 7,5% Concentração Final: 0,5%
Azida de Sódio	Sigma (St. Louis, MO, EUA)	S8032	Concentração Final: 0,02%
Penicilina/Estreptomicina (Estreptococo de Caneta)	Gibco ( Grand Island, NY, EUA)	15070-063	Antibióticos Concentração de estoque: 5.000 UI/ml de penicilina, 5.000 μ g/ml de estreptomicina Concentração final: 50 UI/ml de penicilina, 50 μ g/ml de frasco de cultura de estreptomicina
T-75 para culturas em suspensão	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Alemanha)	658 190
Frasco de cultura T-75 tratado com TC	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Alemanha)	658170
TrypLE Select	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12563-011	Solução de desprendimento de proteases sem animais Concentração de estoque: 1x Concentração final: 1x
Tripsina/EDTA	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	15400-054	Vermelho de fenol livre Concentração de estoque: 0,5% Concentração final: 0,25%
anti-CD90 anticorpo APC  (CD90)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-095-402	Concentração final: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 anticorpo (CD45)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-096-609	Concentração final: 1:40
anti-CD73 PE anticorpo (CD73)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-095-182	Concentração final: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 anticorpo (CD31)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-105-260	Concentração Final: 1:40
Anticorpo IgG1 APC de camundongo	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-098-846	Concentração final: 1:40
Anticorpo IgG2a APC Vio770 de camundongo	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-096-637	Concentração final: 1:40
Anticorpo IgG1 PE de camundongo	MiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Alemanha)	130-098-845	Concentração Final: 1:40
Camundongo IgG1 PE Vio-770 anticorpo	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-098-563	Concentração Final: 1:40
Baixa Glicose Meio Eagle Modificado por Dulbecco  (DMEM)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	13-1331-82	Meio essencial mínimo sem vermelho de fenol Concentração de estoque: 1.000 mg/L de glicose
Soro Fetal Bovino  (FBS)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	10500	Concentração de estoque:0,2 mg/ml Concentração final: 2 μ g/ml
de reagente antidesbotamento Prolong Gold com 4',6-diamidino-2-fenilindol	Invitrogen (Waltham, MA,  EUA)	P-36931	Meio de montagem aquoso + DAPI Concentração Final: 1x
Paraformaldeído	Sigma (St. Louis, MO, EUA)	P6148	Fixador Concentração Final: 4%
LAB-TEK lâminas de câmara de dois poços	Sigma (St. Louis, MO, EUA)	C6682
Anticorpo anti-Nestina [clone 10C2]	Abcam (Cambridge, Reino Unido)	ab2035	Concentração de estoque: 1 mg/ml Concentração final: 7 μ g/ml
Alexa Fluor 555 Faloidina	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A34055	Concentração de estoque: 200 UI/ml Concentração final: 5 UI/ml
Triton X-100	Euroclone (Milão, Itália)	EMR237500	Concentração final: 0,05%
MesenPRO RS Médio  (MSC-RS médio)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12746-012
Alexa Fluor 488 kit SFX anti-mouse	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A31619	Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra + intensificador de sinal Concentração de estoque: 2 mg/ml Concentração final: 2 μ g/ml
Pipeta	Pasteur Kartell Labware  (Noviglio (MI), ITÁLIA)	329
StemMACS AdipoDiff  Mídia	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-091-679
StemMACS OsteoDiff  Mídia	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Alemanha)	130-091-678
Osteoimage Ensaio de mineralização óssea	LONZA (Walkersville MD-USA)	PA-1503	Solução de coloração fluorescente específica para hidroxiapatita
50 ml Tubo cônico de poliestireno	Greiner bio-one (Kremsmü nster Áustria)	227261
Nile Red	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	N1142	Solução de coloração fluorescente para lipídios Concentração de estoque: 100 mM Concentração final: 200 Nm
Glicerina	Sigma (St. Louis, MO, EUA)	G2289	Concentração final: 50%
Placas de Petri de poliestireno	Sigma (St. Louis, MO, EUA)	P5606
Placas de 24 poços tratadas com TC	Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Alemanha)	662160
Meio de Crescimento Endotelial, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)	LONZA (Walkersville, MD-EUA)	CC-3162	Meio de crescimento de células endoteliais rico em VEGF
Leica Qwin Image Analisys Software	Leica (Wetzlar, Alemanha)		Software de análise de imagem