Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

Resumo

Este manuscrito apresenta um modelo in vitro único de células citotrofoblásticas vilosas humanas imunopurificadas cultivadas sob hipóxia/reoxigenação. Este modelo é adequado para estudar os efeitos protetores de tratamentos promissores, como a melatonina, nas complicações da gravidez associadas ao aumento do estresse oxidativo e à alteração da função placentária.

Resumo

Este protocolo descreve como as células citotrofoblásticas vilosas são isoladas das placentas a termo por sucessivas digestões enzimáticas, seguidas de centrifugação por densidade, isolamento de gradiente de meio e purificação imunomagnética. Como observado in vivo, as células citotrofoblásticas vilosas mononucleadas em cultura primária se diferenciam em células sinciciotrofoblásticas multinucleadas após 72 horas. Em comparação com a normóxia (8% O₂), as células citotrofoblásticas vilosas que sofrem hipóxia/reoxigenação (0,5% / 8% O₂) sofrem aumento do estresse oxidativo e apoptose intrínseca, semelhante ao observado in vivo em complicações da gravidez, como pré-eclâmpsia, parto prematuro e restrição de crescimento intrauterino. Nesse contexto, os trofoblastos vilosos primários cultivados em condições de hipóxia/reoxigenação representam um sistema experimental único para entender melhor os mecanismos e vias de sinalização que são alterados na placenta humana e facilitar a busca por medicamentos eficazes que protejam contra certos distúrbios da gravidez. Os trofoblastos vilosos humanos produzem melatonina e expressam suas enzimas e receptores sintetizadores. A melatonina tem sido sugerida como tratamento para pré-eclâmpsia e restrição de crescimento intrauterino devido aos seus efeitos antioxidantes protetores. No modelo de células do citotrofoblasto viloso primário descrito neste artigo, a melatonina não tem efeito sobre as células trofoblásticas em estado normóxico, mas restaura o equilíbrio redox das células sinciciotrofoblásticas interrompidas pela hipóxia/reoxigenação. Assim, as células trofoblásticas vilosas humanas em cultura primária são uma excelente abordagem para estudar os mecanismos por trás dos efeitos protetores da melatonina na função placentária durante a hipóxia/reoxigenação.

Introdução

Durante a gravidez humana, as células citotrofoblasto da placenta, que são células mononucleadas de haste, proliferam rapidamente e se diferenciam em células quer citotrofoblasto vilosos ou extravilosas. citotrofoblastos extravilosas invadir e remodelar as artérias em espiral da parede uterina. Citotrofoblastos viloso, por outro lado, continuar a proliferar, diferenciar-se e fundem para formar trofoblasto multinucleadas (a sincício) ^1. A manutenção da homeostase trofoblasto viloso é essencial para o bem-estar fetal e gravidez saudável. Na verdade, trofoblastos vilosidades permitir a troca materno-fetal de oxigênio e nutrientes, e produzir hormônios essenci....

Protocolo

Placentas foram obtidas imediatamente após partos vaginais espontâneos de gestações sem complicações no CHUM-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Canadá, com o consentimento do paciente informado e aprovação dos comitês de ética (CHUM-St-Luc Hospital e INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Quebec, Canadá).

1. Isolamento e purificação de células das vilosidades citotrofoblasto

1. Soluções e meios de comunicação
   1. Preparar por um meio de transporte complementar do meio modificado por Dulbecco-Glucose alta de Eagle (DMEM-HG) com 1% de antibiótico vol / vol (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) e armaze....

Resultados

Isolamento e imunopurifica�o de células citotrofoblasto vilosidades da placenta normais prazo obtidos por parto vaginal rendeu 1 x 10 ⁸ células viáveis. A placenta pesava 350 g, foi de 19 cm de diâmetro, 4 cm de altura com forma discóide e membranas transparentes. Nenhuma malformação cotilédones foi detectada. O cordão umbilical teve localização paracentral e um comprimento de 56 cm. A pureza foi avaliada por citometria de fluxo usando-vimentina e citoqueratina 7 marcadores........

Discussão

Nos mamíferos, o desenvolvimento fetal é diretamente dependente da função placentária adequada. As origens do desenvolvimento de distúrbios de saúde baseiam-se na hipótese de que a causa de doenças que se manifestam mais tarde na vida pode ser rastreada até ao início do desenvolvimento e que a placenta tem um papel mecanicista na programação fetal ^30-32. A placenta é o mediador chave do crescimento e desenvolvimento fetal: regula a transferência de nutrientes, protege contra as exposições prejudiciais, e tem .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tesoura Curva Metzenbaum	Shandon	9212	equipamento cirúrgico (isolamento celular) (2 unidades)
Pinça de Estilhaços Fina 41/2 in	Fisherbrand	13-812-42	equipamento cirúrgico (isolamento celular) (2 unidades)
Tesoura 4.5 Str Dissecção	Fisherbrand	08-940	equipamento cirúrgico (isolamento celular) (2 unidades)
Esponja de Gaze 10 cm x 10 cm	Cardinal Health
Assadeira de Vidro Oblongo	Pyrex	1105397	Glassware (2.8 L)
Funnel Buchner	Coorstek Inc	10-356E	Glassware (114 mm de diâmetro)
Watch Glass	pyrex	9985100EMD	Vidraria
Solução de formalina, tamponado neutro, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	solução fixadora de tecido histológico
Frascos de tripsinização	Wheaton	355395	Vidraria (1 unidade)
Tubos de cultura descartáveis	Kimble	73750-13100	Vidraria
Pasteur de vidro borossilicato (22,8 cm)	Fisherbrand	K63B1367820C	Copos
Vidro de 250 ml	Fisherbrand	KFS14005250
Garrafas de Mídia de Vidro com Tampa	Fisherbrand	KFS14395250	Glassware (8 unidades)
Tubo Corex de 50 ml	Corning	8422-A	(1 unidade)
15 ml Tubo de Centrífuga de Poliestireno	Corning	430791
50 ml Tubo de Centrífuga de Poliestireno	Corning	430829
10 ml Pipeta Sorológica	Corning	11415038
Cell Strainer 100 μ m Forro	Absorvente 431752		Corning
	Scienceware	1199918
500  ml Garrafas Top Filter	Corning		Pore: 0.22  µ m / médio e preparação HBSS
2 ml Frascos criogênicos	Corning	430488
recipiente de congelamento, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562-1EA
Bomba peristáltica	Pharmacia Fine Chemicals	P3 modelo
Banho maria agitado	Fisher	modelo 127
Bomba de vácuo	ABM	4EKFS6CX-4
Cloreto de sódio	Fisherbrand	EC231-598-3	Solução salina 0,9%
Hank ' s Solução salina tamponada (Hbss)	Sigma-Aldrich	H2387	Quantidade: 9,25 (um frasco) para 1 L de solução de digestão
Ácido hidroxipiperazineetanossulfônico (Hepes)	Life Technologies	15630-080	25 ml (1 M) para 1 L de solução de digestão
Tripsina Tipo I	Sigma-Aldrich	T8003	9.888 U
Desoxirribonuclease Tipo Iv	Roche	10-104-159-001	402.000 U
Cloreto de Cálcio	Sigma-Aldrich	C4901	100 mM
Sulfato de Magnésio	Baker	2500-01	800 mM
Dulbecco' s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)	Life Technologies	10564-045
Penicilina/Streptomycin Sulphate	Hyclone	SV30010
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644	Gradiente de meio de centrifugação de densidade. Volume: 36 ml
Isopropanol	Acros	42383-0010	50 ml
Dimetil Sulfóxido	Sigma-Aldrich	472301
Automacs Separador Magnético	Miltenyi Biotec	Modelo 003
Automacs  Colunas	Miltenyi Biotec	130-021-101
Automacs Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221	http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Automacs Solução de Enxágue	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Clone Purificado Anti-Human Hla Abc W6/32	Affymetrix eBioscience	14-9983-82	anticorpo anti-rato
Microesferas Igg Anti Mouse	Miltenyi Biotec	130048401
Placa de Poço Múltiplo -  6 Poços Com Tampa	Corning	3335	Superfície de ligação celular
Placa de poços múltiplos -  24 Poços com tampa	Corning	3337	Superfície de ligação celular
Placa de múltiplos poços -  96 Poços com tampa	Corning	3300	Superfície de ligação celular
Câmara de incubadora modular	Billups-Rothenberg	MIC-101	Um conjunto de dois é necessário para condições simultâneas de geração de normóxia e hipóxia/reoxigenação
Medidor de Fluxo Único	Billups-Rothenberg	SFM3001
Filtro em Linha de 50 mm	Whatman	6721-5010	PTFE, poro: 1.0 µ m
Regulador de Gás	Pro Star	PRS301233	Um conjunto de dois é necessário para condições simultâneas de geração de normóxia e hipóxia/reoxigenação
Mangueira de Gás Classe Vi Transparente 5/16	Parker	100-05070102	3 peças com ~ 0,5 m
17 mm Braçadeira de Mangueira de Gás Ajustável	Tiewraps	THCSS-16
Cilindro de Gás Normoxia	Praxair	NI CDOXR1U-K	Tamanho K (3rd composição do trimestre: 5% CO2, 8% O2, Bal. Cilindro de Gás N2)
Normoxia	Praxair	NI CDOXR1U-K	Tamanho K (3rd composição do trimestre: 5% CO2, 0,5% O2, Bal. Microeletrodo de Oxigênio N2)
de Oxigênio MI-730	Microeletrodos Adaptador	3572
Reagente de Detecção de ROS: CM-H2DCFDA	Kit ELISA Invitrogen	C-400
β-hCG	DRG internatinal	EIA-4115
Anti-Vimentina purificado anticorpo	eBioscience	14-9897	Host: camundongo
Anti-Citoqueratina 7 (FITC) anticorpo	Abcam	ab119697	Anfitrião: mouse
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-mousse IgG H & L anticorpo	Life Technologies	A-11029

361020733dede Nylon Microeletrodos de Oxigênio INC ;