Um método fácil para a planta polysome Profiling

Summary

Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

Abstract

A tradução de mRNA em proteína é um processo biológico fundamental e altamente regulado. O perfil polissômico é considerado um padrão-ouro para a análise da regulação translacional. O método descrito aqui é uma maneira fácil e econômica de fracionar polissomos de vários tecidos vegetais. Um gradiente de sacarose é feito sem a necessidade de um criador de gradiente, congelando sequencialmente cada camada. Os extratos citosólicos são então preparados em um tampão contendo cicloheximida e cloranfenicol para imobilizar os ribossomos citosólicos e cloroplásticos em mRNA e são carregados no gradiente de sacarose. Após a centrifugação, seis frações são coletadas diretamente da parte inferior para a parte superior do gradiente, sem perfurar o tubo de ultracentrifugação. Durante a coleta, a absorbância a 260 nm é lida continuamente para gerar um perfil polissômico que fornece um instantâneo da atividade translacional global. As frações são então agrupadas para preparar três populações diferentes de mRNA: os polissomos, mRNAs ligados a vários ribossomos; os monossomos, mRNAs ligados a um ribossomo; e mRNAs que não estão ligados aos ribossomos. Os mRNAs são então extraídos. Este protocolo foi validado para diferentes plantas e tecidos, incluindo mudas de Arabidopsis thaliana e plantas adultas, folhas de Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum e Oryza sativa.

Introduction

A síntese de proteínas é um processo essencial e dispendiosa energeticamente em todas as células ^1. Em primeiro lugar, as células devem investir energia na produção da maquinaria de tradução, os ribossomas. Por exemplo, uma célula de levedura dividindo ativamente produz tanto quanto 2.000 ribossomas por minuto. Essa produção exige até 60% da actividade de transcrição total e até 90% da actividade total de splicing da célula ^2. Além disso, é necessária energia para a síntese de aminoácidos, aminoacil-ARNt e ligações peptídicas. Nas plantas, a adição de um aminoácido a uma cadeia peptídica custos de 4,5 a 5,9 moléculas de ATP ^3. Portanto, não é surpreendente que a tradução do mRNA para a proteína é um importante local de regulação, especialmente quando se trata de lidar com a mudança de condições ambientais.

A etapa de iniciação da tradução, que é a associação de um mRNA com o ribossoma, é o principal alvo da regulamentação dosTradução ^4. Como uma consequência da regulação da tradução, bem como outros passos de regulação pós-transcricional, apenas 40% das variações na concentração de proteína pode ser explicada por ARNm de abundância ^5,6. Assim, o estudo de mRNA total fornece relativamente pouca informação sobre a abundância de proteínas. Por outro lado, a associação de mRNA com ribossomos dá melhor visão sobre a abundância de proteínas, dando acesso a esses mRNAs envolvidos na tradução. mRNAs activamente traduzida estão associados com vários ribossomas em estruturas chamadas polissomas. Por outro lado, mRNAs mal traduzidas será associado a apenas um ribossomo (monosome). Por conseguinte, o status translacional de um ARNm pode ser avaliado por monitorização da sua associação com ribossomas ^7.

Este protocolo descreve o isolamento de polissomas a partir de seis dias de idade plântulas de Arabidopsis thaliana, o subsequente isolamento do ARN e a análise dos resultados. Polysomes monosomes e são separadas através de um gradiente de densidade de sacarose. Gradientes são coletados em seis fracções. Algumas das fracções são reunidas para obter três fracções bem separados: polissomos, monosomes ea fração leve (doravante denominado sobrenadante), que contém os 60 e 40S subunidades ribossomais livres e mRNAs que não estão associados a ribossomas. actividade de tradução global pode ser estimada através da geração de uma relação de polissoma / monosome, que é determinada por integração da área sob a curva, e por comparação dos perfis de polissomas. ARNm e as proteínas são, em seguida, extraiu-se a partir das diferentes fracções e utilizado para análise por RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, Western blot ou proteómica. Este protocolo foi validado para outras plantas e tecidos.

Os equipamentos necessários para realizar este protocolo são comumente encontrados na maioria dos laboratórios: Não há necessidade de uma máquina de inclinação. Congelação cada camada antes de adicionar o próximo prevenirs de qualquer mistura ou perturbação das camadas. Nenhuma perfurador tubo é utilizado para a recolha de inclinação que pode ser obtida por imersão de um tubo capilar de vidro no gradiente. Por conseguinte, os tubos de ultracentrífuga dispendiosos não ficam danificadas e podem ser re-utilizada várias vezes. Coletivamente, isso faz com que o presente protocolo de um método fácil e barato para profiling polysome.

Protocol

1. Preparação de 20 a 50% (p / v) de sacarose Gradientes

Nota: Os gradientes são feitos de 4 camadas de sacarose (50%, 35% e 2 camadas de 20%) em 13,2 ml de um tubo de ultracentrífuga. Em nossa experiência, despejando a sacarose 20% em duas camadas separadas melhora muito a qualidade das preparações polissomas.

1. Preparar as soluções de estoque. Certifique-se que todas as soluções são RNAse e DNAse livre.
   1. Prepare 10X Solução Salina: Tris-HCl 400 pH 8,4, KCl 200 mM e MgCl ₂ 100 _mM.
   2. Prepare M de sacarose Solução 2: Para 200 ml, dissolver 137 g de sacarose em 1X solução salina.
2. Dilui-se a solução de sacarose em solução salina, como descrito na Tabela 1, para preparar os gradientes. Os volumes indicados são para seis gradientes.

Concentração de sacarose final	sacarose 2H (ml)	Sal solução 1X (ml)	Vol final. (ml)
50%	8,8	3.2	12
35%	12,9	12.1	25
20%	7,4	17,6	25
20%	5.8	14.2	20

Tabela 1. As diluições da solução de sacarose para preparar seis gradientes.

3. Despeje as camadas conforme Tabela 2.

camada de sacarose	50%	35%	20%	20%
Vol. (Ml)	1.85	3.65	3.65	1,35

Tabela 2. Volume de solução de sacarose por camada.

4. Depois de verter cada camada, manter os tubos num -40 ° C ou -80 ° C até estar completa congelador de congelação antes da adição de sacarose a camada seguinte. A congelação é geralmente alcançada após 2 h a -40 ° C, mas de esperar cerca de 6 h antes de se verter a camada seguinte é recomendado. A última camada de 20% pode ser congelada ou adicionado de fresco no dia da experiência.
   Nota: Congelamento cada camada antes de adicionar o próximo impede a partir de qualquer mistura ou perturbação das camadas. Os gradientes podem ser mantidos numa -40 ° C ou -80 ° C congelador durante pelo menos seis meses.
5. Se ainda não tiver sido feito, adicionar a última camada de 20% para os gradientes no dia da experiência. Então, deixe-os gradientes descongelar em uma sala fria ou um frigorífico.

2. Preparação de Extratos citossólicos

Nota: Nós recomendaçãacabar usando dois gradientes por amostra biológica. 300 mg é a quantidade óptima de material vegetal para preparar dois gradientes quando se trabalha com 6 dias de idade plântulas de Arabidopsis thaliana. Quando se trabalha com tecidos traducionalmente menos activos, a quantidade de material de planta pode ser aumentada até 600 mg.

1. Colheita de seis dias da germinação cultivadas em ½ Murashige e Skoog ⁸ meio suplementado com 1% de sacarose ou mídia equivalente a-congelação rápida em azoto líquido
2. material vegetal moer num almofariz e pilão pré-arrefecida com azoto líquido.
3. Pesar 300 mg de material em pó em um prato de pesagem pré-arrefecido. Execute esta etapa rapidamente para evitar o descongelamento da amostra.
   Nota: Mantenha as amostras congeladas por mais de uma semana em um C congelador -80 °.
4. Adicionar 2,4 ml de tampão pré-arrefecida polissoma (Solução Salina 4X, EGTA 5,26 mM, 0,5% (v / v), octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol, ramificadas, 50 μg.ml ^-1 ciclo-heximida, 50 ¹ μg.mlcloranfenicol) e homogeneizar por mistura com a ponta da pipeta. Transferir 1,5 ml para dois tubos. Trabalhar rapidamente para impedir que as amostras de aquecimento.
5. Centrifuga-se a 16000 xg durante 15 min a 4 ° C numa microcentrífuga para sedimentar os detritos.
   Nota: Para evitar a degradação do RNA, mantenha sempre as amostras a 4 ° C, utilize RNase / DNase soluções livres e trabalhar em RNase / DNase condições livres. A heparina pode ser adicionado ao tampão de polissoma, a uma concentração final de 300 μg.ml ^-1, para melhorar a protecção de ARN. No entanto, uma vez que a heparina pode interferir com a análise a jusante, que terá de ser removido durante o passo de precipitação de ARN através da realização de precipitação de cloreto de lítio em vez de precipitação com etanol (nota cf. 4.7).

3. polysome Profiling

1. Cuidadosamente pipeta o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Se fragmentos de plantas foram pipetados, repita o passo 2.5. Carregar o sobrenadante no topo do gradiente por pipettin suavementeg para a parede lateral do tubo num fluxo constante. Use um gradiente para cada tubo de 1,5 ml.
2. Transferência para o pré-arref ecido baldes e centrifugar a 175.000 xg durante 2 h 45 min a 4 ° C, em uma ultracentrífuga (por exemplo 32.000 rpm ao utilizar um rotor SW41).
3. Configurar o sistema de recolha de gradiente, tal como descrito na Figura 1. A cuveta UV tem um percurso de 1 mm.

Figura 1. Sistema de recolha de inclinação. A cuvete de UV está ligado um tubo de cloreto de polivinilo a um tubo capilar de vidro, que desce para o fundo do gradiente. O gradiente progride através do sistema graças a uma bomba peristáltica. OD ₂₆₀ é continuamente lido e 2 ml frações são coletadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.

4. Ajustar o colector de fracções para a TA, e definir o carrossel, a uma velocidade que permita a recolha de fracções de 2 mL. Use tubos de coleta pré-arrefecido.
5. Recolher as fracções de baixo para cima utilizando um tubo capilar de vidro ligada a um tubo de cloreto de polivinilo para o sistema de recolha de gradiente. Usar um filme de parafina de plástico para assegurar a ligação entre o tubo de cloreto de polivinilo e o tubo capilar de vidro.
6. Ler a absorvância a 260 nm a partir do fundo para o topo do gradiente. Quando todo o gradiente é recolhido, coloque os tubos de coleta no gelo antes de extração de RNA.

4. Extracção de ARN

1. Reunir as fracções recolhidas a partir de dois gradientes, em 50 ml tapados tubos de centrifugação, como segue:
   Polissomas: fracções de 1 a 3 (12 ml)
   Monosomes: valor correspondente a 4 (4 ml)
   Sobrenadante: fracções 5 e 6 (8 ml)
2. Para cada fracção, adicione 1 vol. Hidrocloreto de guanidina 8M,50 ug transportador acrílico e 1,5 vol. isopropanol.
   Nota: Acryl transportador é acrilamida linear, usado como um co-precipitante para melhorar a recuperação de ácidos nucleicos durante a precipitação com álcool.
3. Misturar por inversão dos tubos e precipitar O / N à temperatura de -20 ° C.
4. Centrifugar a 175.000 xg durante 1 h a 4 ° C, em uma ultracentrífuga (32.000 rpm num rotor SW32). Se o passo de precipitação é realizada de um tubo, o qual não é compatível com a ultracentrifugação, transferir para um tubo adequado.
5. Elimine o sobrenadante e dissolve-se o sedimento em 200 de tampão TE isento de ARNase ul (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5-1 mM de EDTA). Transferir para um novo tubo de 1,5 ml.
6. Extrair ARN por adição de 1 vol. fenol saturado de água (pH 6,6) e 1 vol. clorofórmio: álcool isoamílico (24: 1). Misturar energicamente. Centrifuga-se a 15000 xg durante 20 min a 4 ° C. Transferir a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 mL.
   Nota: ácido fenol (pH 4,5) pode ser utilizado a fim de minimizar a contaminação do ADN.
7. Precipitar o ARN por adição de 1/10 vol. M de acetato de sódio 3 e 3 vol. 100% de etanol. Permitir a precipitação a -80 ° C durante 20 min ou O / N à temperatura de -20 ° C. Centrifuga-se a 15000 xg durante 15 min a 4 ° C.
   Nota: Se estiver usando heparina no tampão polysome (nota cf. 2.5), execute um cloreto de lítio precipitação (LiCl) em vez de precipitação de etanol para remover adequadamente qualquer vestígio de heparina que possa interferir com a análise a jusante ^9. Após extracção, adicionar LiCl até uma concentração final de 2,5 M. permitir a precipitação durante 30 minutos à temperatura de -20 ° C ou O / N a 4 ° C. Centrifuga-se a 15000 xg durante 15 min a 4 ° C.
8. Lavar o sedimento com 500 ul de etanol a 75%. Ar secar o sedimento e dissolvem-se em 30 ul de tampão TE. Avaliar a qualidade do ARN por electroforese num ARNase livre de 1,2% em gel de agarose (100V, 15 min) ou por métodos de electroforese capilar.

Análise 5. Os dados

1. Exportação de dados brutos para um software gráfico e de análise de dados.
   Nota: Como mostrado na Figura 2A e B, os perfis de matérias dar informação qualitativa: o número de picos polissomas que pode ser visto, a altura do pico monosome, e a presença de um ombro correspondente para as subunidades de ribossomas livres.
2. Mesclar perfis para permitir a comparação dos perfis entre as amostras. Utilizar a ferramenta de leitor de tela para determinar o valor de X do pico monosome para cada amostra e alinhar os picos monosome removendo pontos de dados adicionais no início das curvas. Identificar o ponto mais baixo da curva e determinar seu valor Y (utilizando a ferramenta de leitor de tela). Defina o valor mais baixo Y ponto a 0 usando a função "valor definido colunas".
3. Determinar a proporção polissomas / monosomes por integração da área sob a curva de perfis em bruto (Figura 3C). Utilizar a ferramenta selector de dados para definir a fronteira da área a ser integrados. Em seguida, use a função de integrar (Análise-Matemática).
4. Normalizaras curvas para o pico monosome dividindo todos os pontos de dados de uma curva pelo valor Y da cimeira do pico monosome (determinado utilizando a ferramenta de leitor de tela). Selecione a coluna, então sob análise em Matemática, selecione Normalize e escolher os "dividido por um valor especificado" métodos. Este passo permite a comparação do nível relativo de polissomas (Figura 3D).

Figura 2. Perfis polissomas representativos. Arabidopsis thaliana de tipo selvagem (wt, ecotipo Col-0) e mudas mutantes foram cultivadas durante seis dias em ½ Murashige e Skoog sob fotoperíodos o dia (luz 16 horas, 8 horas escuro). A: perfis polissomas brutos de mudas wt. B: perfis polissomas brutos de mudas mutantes. C: Determinação da percentagem de polissomas e monosomes por integração da área sob a curva D: profi polissomales normalizados para o pico monosome. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Results

Na literatura, os perfis de polissomas são mostrados frequentemente a partir da fracção de luz para a fracção pesada como um resultado da forma como os gradientes são recolhidos, ou seja, a partir do topo para o fundo. Uma vez que no protocolo aqui descrito os gradientes são recolhidos a partir da base para o topo, os perfis que mostram começar com a fração pesada (as polissomos) e vá para a fração de luz (subunidades de ribossomas livres e RNAs) (Figura 2A). Em seguida,...

Discussion

O protocolo que apresentamos aqui é um método fácil e barato para gerar perfis de polissomos e isolar mRNAs associados a polissomos, ribossomos únicos ou livres de ribossomos. Uma ampla gama de diferentes métodos de fracionamento de polissomos é descrita na literatura. O método que descrevemos aqui foi otimizado para manter apenas os compostos necessários e foi adaptado para material vegetal. Em particular, reduzimos a quantidade de detergente¹¹ e adicionamos cloranfenicol ao tampão para fixar os ribossomos cl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de ultracentrífuga, parede fina, polialômero - 13,2 ml	Beckman Coulter	331372
Tubo de ultracentrífuga, parede fina, polialômero - 38,5 ml	Beckman Coulter	326823
Tubo capilar de vidro	Ultracentrífuga Drummond Scientific	1-000-1000
	Beckman Coulter	Optima series
SW41	Beckman Coulter	331362
Rotor Ultracentrífugo SW32	Beckman Coulter	369650
Bomba peristáltica	Qualquer
tubo de cloreto de polivinila Tygon R3607	Fisher Scientific	070534-22	Tubo de cloreto de polivinila, 2,29 mm
Coletor de frações Modelo 2110	Bio-Rad	731-8120
Cubeta UV	Hellma	170.700-QS	Cubeta de quartzo de fluxo
através Espectrofotômetro UV	Varian	Cary50	Leia a cada 0,0125 seg
Todos os produtos químicos	Qualquer		uso apenas Grau de Biologia Molecular
Murashige e Skoog Mistura de Sal Basal (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Água livre de rnase	Qualquer
placa de Petri	Fisher Scientific	10083251
Octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol, ramificado (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Acrilamida linear (transportador de acrílico)	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA transportador de precipitação
OriginPro 8	OriginLab		Software de análise