Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Resumo

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Resumo

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). Para o início dos experimentos, monócitos frescos ou congelados são cultivados em frascos por 1 semana com M-CSF para induzir sua diferenciação em macrófagos. Em seguida, os macrófagos podem ser colhidos e semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos. O uso de números definidos de macrófagos em vez de números definidos de monócitos para iniciar culturas de macrófagos para experimentos produz culturas de macrófagos nas quais a densidade celular desejada pode ser alcançada de forma mais consistente. O uso de monócitos criopreservados reduz a dependência da disponibilidade de doadores e produz culturas de macrófagos mais homogêneas.

Introdução

O estudo de macrófagos cultivados é um modelo útil para entender a função dessas células na inflamação, como ocorre em placas ateroscleróticas. Quando o foco da pesquisa é em doenças humanas envolvendo macrófagos, é útil estudar macrófagos humanos primários em vez de macrófagos não humanos para evitar diferenças de espécies. Além disso, os efeitos da transformação celular podem ser evitados usando macrófagos primários em vez de linhagens celulares de macrófagos. Para isso, macrófagos diferenciados de monócitos isolados de sangue humano servem como meio de obtenção de macrófagos humanos primários.

Os macrófagos teciduais podem residir nos tecidos ou podem ser derivados de monócitos que migram para o tecido e se diferenciam em macrófagos ¹. Foram definidos dois tipos de macrófagos derivados de monócitos humanos que diferem não apenas na morfologia, mas também na expressão gênica e na função celular ². Esses dois tipos são obtidos a partir de monócitos que são diferenciados em macrófagos na presença de M-CSF + soro fetal bovino (FBS) e monócitos que são diferenciados em macrófagos na presença de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) + FBS ^2-6. Em nossa experiência (observação não publicada), o uso de soro humano em vez de FBS gera o tipo GM-CSF, independentemente de M-CSF ou GM-CSF estar incluído no meio de diferenciação. Os macrófagos do tipo M-CSF tendem a ser mais alongados do que os macrófagos do tipo GM-CSF, que se assemelham a ovos fritos em sua morfologia. Os investigadores devem reconhecer que os macrófagos derivados de monócitos M-CSF e GM-CSF humanos não são os mesmos que os chamados macrófagos derivados da medula óssea de camundongos M1 e M2 ⁶.

Durante a pesquisa usando macrófagos diferenciados M-CSF derivados de monócitos humanos, tivemos dificuldade relacionada à disponibilidade de monócitos para iniciar experimentos e variação nas densidades celulares obtidas de macrófagos durante a diferenciação de monócitos em macrófagos. Para superar esses problemas, desenvolvemos o seguinte protocolo no qual os monócitos são congelados até serem necessários para uso, e os monócitos são diferenciados em massa em macrófagos que podem ser removidos dos frascos de cultura e plaqueados nas densidades celulares desejadas para obter culturas mais uniformes de experimento para experimento.

Protocolo

Leucaférese foi realizado em protocolo de pesquisa de um sujeito humano aprovado por um National Institutes of Health conselho de revisão institucional.

1. Isolamento e criopreservação de monócitos

1. Obtenção de células mononucleares por leucaferese de dadores humanos, monócitos e enriquecer por contínua contra-fluxo centrifugação elutriação de células mononucleares, tal como descrito nas referências ^7,8. Obter aproximadamente 100 x 10 ⁶ células elutriados (aproximadamente 80 - 90% de monócitos) em tampão de elutriação especificado pelo fabricante. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
2. monócitos de centrifugação em um tubo de 15 ml de polipropileno a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
3. Remover o sobrenadante e ressuspender as células suavemente em FBS, seguido de sulfóxido de dimetilo para alcançar uma concentração final de 90% de FBS / 10% de sulfóxido de dimetilo e 50 x 10 ⁶ células / ml.
4. Adicionar cada ml de suspensão de células TO criotubo um indivíduo.
5. Coloque as criotubos num recipiente de congelação de células e transferir para um congelador de -80 ° C durante 24 h antes de transferir para um tanque de armazenamento de azoto líquido criotubo para armazenamento a longo prazo.

2. Diferenciação de monócitos em macrófagos

1. Descongelar um criotubo de células transferindo rapidamente a um banho de água a 37 ° C e, em seguida, imediatamente a remoção quando a suspensão de células foi descongelada cerca de 70%.
2. Imediatamente após a descongelação completa à temperatura ambiente, transferir os 1 ml conteúdo criotubo para 50 ml de 37 ° C aqueceu-se Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 2 mM de L-glutamina, 50 ng / mL de M-CSF, 25 ng / mL interleucina-10 (IL-10), e 10% de FBS (meio completo).
3. Transferir 25 ml de suspensão de monócitos em cada um de dois frascos de 75 cm ² de cultura de células de plástico.
4. Incubar as culturas numa incubadora a 37 ° C de cultura de células com 5% de CO _2/95% de ar durante 48 horas.
5. Lavar o cultures 3 vezes com 10 ml de meio RPMI 1640 (pré-aquecido a 37 ° C), com cuidado de remover o meio de cultura para evitar a retirada quaisquer células fracamente ligados.
6. Após lavagem, adicione meio completo fresco, mudando média a cada 2 dias até monócitos diferenciar e proliferar o suficiente para se tornar confluentes. Isso requer cerca de uma semana de cultura.

3. A colheita em macrófagos para iniciar Experimentos

1. Lavar macrófagos diferenciados em balão de 3 vezes com 10 mL de pré-aquecido solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco a 37 ° C, sem Ca ²⁺ e Mg ²⁺ antes da adição de 10 ml pré-aquecida de ácido etilenodiaminotetra-tripsina solução a 37 ° C 0,25% (EDTA).
2. Colocar o balão numa incubadora de cultura de células para 10 - 15 min, altura em que aproximadamente 90% dos macrófagos deve ter arredondado e individual. Verificar esta através de exame microscópico do balão.
3. Adicionar 10 ml de RPMI 1640 contendo FBS a 10% a stripsinização superior.
4. Transferir a suspensão de células de macrófagos de balão para um tubo de polipropileno de 50 ml, de centrifugação 300 x g durante 5 min, e desprezar o sobrenadante.
5. Suavemente ressuspender os macrófagos em 1 ml de meio completo.
6. Misturar 10 ul de suspensão de células de macrófagos com 10 ul de solução de Azul de Tripano e determinar o número de células de macrófagos e viabilidade (normalmente> 95%), utilizando um hemocitómetro.
7. Com base na contagem de células (usualmente cerca de 15 - 18 x 10 ⁵ macrófagos), adicionar meio completo adicional para atingir a densidade celular desejada semeadura. Nota: 1 x 10 ⁵ macrófagos em 1,5 ml de meio por poço de uma placa de 12 poços de cultura irá produzir um quase confluentes.
8. Após a sementeira, incuba macrófagos durante a noite numa incubadora a 37 ° C de cultura de células com 5% de ar _de CO _2/95% para permitir a fixação das células. Em seguida, começa experiências desejados.

Resultados

A viabilidade de monócitos frescos ou criopreservados foi superior a 95% tal como determinado através da coloração com Trypan Blue ^9. A Figura 1 e a Figura 2 comparar com ampliações inferiores e superiores, respectivamente, o progresso da (isto é, congelada) diferenciação de monócitos frescos e criopreservados em macrófagos. Note que o fresco comparado com monócitos criopreservado mostrar uma subpopul...

Discussão

Geração de tipos de macrófagos definidas podem esclarecer alguns dos resultados conflitantes obtidos pelos investigadores quando se estuda a biologia dos macrófagos. A utilização de várias condições de cultura e dos factores de diferenciação para geração de macrófagos primários humanos pode conduzir a tipos muito diferentes de macrófagos, um facto que não pode ser apreciado pelo pesquisador. Por exemplo, macrófagos, por vezes, são geradas a partir de monócitos humanos utilizando nenhum soro, soro humano por si só, de so...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de 12 poços Cellbind	Corning	3336
CELLSTAR, frasco T-75, cultura de tecidos tratada	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 meio de cultura	Cellgro Mediatech	15-040-CM	aquecido a 37 ° C
L-Glutamina	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Soro fetal bovino	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific
DPBS sem Ca2+ e Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200-056
Tubo cônico de polipropileno de 50 ml	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Hemocitômetro de luz brilhante aprimorado por Neubauer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031 http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX congelamento de células recipiente	BioCision	BCS-405	outros recipientes de congelamento também devem  ser adequados para esta etapa
Sistema de Armazenamento de Nitrogênio Líquido, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	qualquer tanque de nitrogênio líquido deve ser adequado

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