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Artigo de método

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

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DOI:

10.3791/54255

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12 de agosto de 2016

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1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University

Neste artigo

Resumo

Os monócitos são componentes integrais do sistema imunológico inato humano que dependem do metabolismo glicolítico quando ativados. Descrevemos um protocolo de citometria de fluxo para medir a expressão do transportador de glicose e a captação de glicose por monócitos totais e subpopulações de monócitos em sangue total fresco.

Resumo

Os monócitos são células imunitárias inatas que podem ser ativadas por patógenos e inflamação associados a certas doenças inflamatórias crónicas. A activação de monócitos induzem funções efectoras e um deslocamento concomitante da oxidativo ao metabolismo glicolítico que é acompanhada por um aumento da expressão do transportador de glucose. Este aumento do metabolismo glicolítico é também observada para a imunidade treinada de monócitos, uma forma de memória imunológica inata. Embora os protocolos in vitro que examinam a expressão do transportador de glucose e a captação de glicose pelos monócitos foram descritos, nenhum foi examinado por fluxo multi-paramétrico citometria em sangue total. Descreve-se um protocolo de citometria de fluxo multi-paramétrica para a medição da absorção de glucose análogo 2-NBDG fluorescente no sangue total pelo total de monócitos e a clássica (CD16 ++ CD14 -), intermediário (CD14 ++ CD16 +) e não clássico ( CD14 + CD16 ++) de monócitossubpopulações. Este método pode ser usado para examinar a expressão do transportador de glucose e a captação de glucose para o total de monócitos e subpopulações de monócitos durante a homeostase e doenças inflamatórias, e pode ser facilmente modificado para analisar a absorção de glucose por outros leucócitos e subpopulações de leucócitos de sangue dentro.

Introdução

Os monócitos são um dos principais componentes do sistema imune inato humano que são rapidamente mobilizados para os locais de infecção e inflamação 1. Activação dos monócitos é fundamental para limitar os danos aguda por patógenos e também é central para a patogênese de diversas doenças crônicas, incluindo a aterosclerose 2, do cancro de 3, e HIV 4,5.

O metabolismo de repouso e monócitos ativados difere radicalmente, com monócitos descansando utilizando metabolismo oxidativo e monócitos activados utilizando metabolismo glicolítico (ou seja, a fermentação da glicose em lactato) 6. A activação de monócitos induz a expressão dos transportadores de glicose que permite maior captação de glicose para o metabolismo glicolítico 7. transportador de glucose de monócitos 1 (GLUT1) é um tal transportador regulada positivamente durante a activação e a sua expressão tem sido mostrado para levar a produção de citocinas pro-inflamatórias em vITRO e no tecido adiposo de ratos obesos 8. A infecção de uma linha celular monocítica de sarcoma de Kaposi associada herpesvírus leva à sobre-regulação celular da Glut1 9, e, recentemente, mostraram que durante a infecção crónica pelo HIV um aumento da percentagem de monócitos que expressam GLUT1 estão presentes durante a infecção tratados com terapia anti-retroviral não tratada e 10 combinação. Tomados em conjunto, estes estudos mostram que a absorção de glicose e metabolismo glicolítico por monócitos são aspectos importantes de muitas doenças inflamatórias. Assim, um método simples para medir a expressão de monócitos GLUT1 e a absorção de glicose durante a homeostase e doença inflamatória é provável que seja de utilização de uma vasta gama de pesquisadores.

Os monócitos humanos são heterogéneo, sendo compreendido de três subconjuntos distintos que podem ser examinados por expressão diferencial de CD14 a marcadores da superfície celular CD16 e 11,12. Classical monócitos expressam um alto nível de expressão de CD14, mas não expressam CD16 (CD14 ++ CD16 -), monócitos intermediários expressam um alto nível de CD14 e um nível intermediário de CD16 (CD14 ++ CD16 +), e não-clássica monócitos expressam um baixo nível de CD14 e um alto nível de CD16 (CD14 + CD16 ++). Os monócitos que expressam CD16 são denominados CD16 + monócitos, que em comparação com CD16 - monócitos têm alta expressão de citoquinas inflamatórias e a capacidade para mais efectivamente apresentar antigénios 13,14. Aproximadamente 10% dos monócitos expressam CD16 durante a homeostase com percentagens mais elevadas observadas durante a inflamação 15. Subpopulações de monócitos estão associados com certos estados de doença e podem ser marcadores biológicos úteis de doença e progressão da doença 16.

Nosso objetivo foi identificar um método que pode medir a expressão transportador de glicose e captação de glicose pelos monócitos humanos e subpopulações de monócitos em condições tão próximas phycondições fisiológi- possível. Estudos anteriores medido expressão do transportador de glucose de monócitos e a absorção de glicose 17,18, embora estes métodos examinados monócitos isolados que pode ter alterado a expressão da proteína em comparação com as condições fisiológicas 19, e nenhum estudo anterior examinou subpopulações de monócitos humanos. Usando fluxo multi-paramétrico citometria, nós descrevemos um método para examinar a expressão do transportador de glucose e a absorção do análogo de glucose fluorescente 2-NBDG pelo total de monócitos e subpopulações de monócitos (com base em CD14 e CD16 expressão) dentro de sangue inteiro não manipulada.

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Protocolo

NOTA: HIV-infectados e indivíduos não infectados pelo HIV foram recrutados a partir da Unidade de Doenças Infecciosas no Hospital Alfred de Melbourne, VIC, Austrália e da comunidade local, respectivamente. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes, e a pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa Alfred Hospital.

Detecção de Superfície Celular 1. Glut1 em monócitos e de monócitos subpopulações

  1. Recolha de sangue em tubos anticoagulantes ACD-B citrato e começar os experimentos em uma cabine de segurança biológica dentro de 1 hora da coleta.
  2. Adicionar 100? L de sangue para tubos de polipropileno. Adicionar 2 ml de solução de lise 1x (ver Materiais Tabela) para tubos em gelo, enquanto, pipetando cuidadosamente para misturar. Incubar durante 15 min em gelo. Centrifugar a 220 xg durante 5 min.
  3. Decantar e lavar duas vezes por adição de cerca de 2-4 ml de solução de lavagem (0,5% de BSA em PBS 1x) e centrifugação a 220 xg durante 5 min.
  4. Use um tubotte para remover cuidadosamente o máximo de solução de lavagem possível. Colocar os tubos em gelo e re-suspensão em 100 uL de solução de lavagem.
  5. Para identificar subpopulações de monócitos específicos corar as células com o seguinte volume de anticorpos por cada 100 ul de suspensão de células preparada no Passo 1.4: 5 uL de anti-CD3-PE, 5 uL de anti-CD14-APC, 5 uL de anti-CD16-PECy7, 5 ul GLUT1 -FITC ou IgG2b-FITC (tubo de controlo de isotipo).
  6. Colocar em gelo durante 30 min no escuro. Lavar 2 vezes com solução de lavagem. Fix com 200-300 ul de 0,5% de formaldeído feita em PBS 1x.
  7. Analisar num citómetro de fluxo capaz de detectar a 4 cores dentro de 24 horas, dentro do seguinte excitação e emissão de comprimentos de onda: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. Glucose captação pelos monócitos

  1. Pipeta de 90 mL de sangue coletado na etapa 1.1 em tubos de polipropileno. Adicionam-se 10 ul de uma solução de trabalho de 14,60? M 2-a NBDGos 90 l de sangue (concentração final de 1,46 mM) e filme suavemente para misturar. É crítico para limitar 2-NBDG exposição à luz, cobrindo tubos com folha de alumínio.
  2. Incubar a 37 ° C no escuro durante 15-30 minutos e, em seguida, colocar imediatamente em gelo. Adicione 4 ml de 1x FACS lise solução para tubos, enquanto no gelo. Centrifugar a 220 xg a 4 ° C durante 5 min.
  3. Lavar uma vez por adição de 4 ml de solução de lavagem (0,5% de BSA em PBS 1x). Centrifugar a 220 xg a 4 ° C durante 5 min. Decantar e colocar no gelo.
  4. células mancha com anticorpos: 5 ul anti-CD3-PE, 5 jul anti-CD14-APC, 5 l anti-CD16-PECy7. Misturar e colocar em gelo durante 30 min no escuro.
    NOTA: Durante este período, certifique-se o citômetro de fluxo está pronto para análise imediata. Adquirir células dentro do seguinte excitação e emissão de comprimentos de onda: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), a APC (633, 660).
  5. Adicione 4 ml de tampão de gelo lavagem a frio (0,5% BSA em 1x PBS) para tubos.Lavar uma vez por centrifugação a 220 xg, a 4 ° C durante 5 min. Decantar e adicionar 200-300 mL de gelo antigo PBS e manter em gelo no escuro (coberto com folha de alumínio). Analisar num citómetro de fluxo dentro de 10 min, utilizando excitação e de emissão de ajuste de comprimento de onda como no passo 2.4.

3. Aquisição e Análise de Dados

NOTA: O conhecimento de análise de dados de citometria de fluxo e é assumido.

  1. Usando um citômetro de fluxo capaz de análise de, pelo menos, 4 cores, a remuneração definida usando amostras não coradas e corados individualmente.
    NOTA: coloração utilizando um único CD4 marcado com FITC e CD14 podem ser usados ​​para GLUT1 e de compensação 2-NBDG.
  2. Configurar e rotular janelas apropriadas antes de adquirir amostras. Desenhar uma porta em torno da população de monócitos, e adquirir 100.000 a 300.000 eventos por amostra na taxa média. 50.000 eventos por amostra de compensação é suficiente.
    NOTA: A compensação pode ser realizada antes de provaraquisição ou em software de análise de uma única célula, seguindo procedimentos padrão.
  3. Exportação e salvar dados em um local apropriado. Abra o software de análise única célula, como FlowJo ou outro software de análise (Suplementar Figura 1) e as amostras de arrastar e soltar, conforme especificado (Supplemental Figura 2).
  4. Clique duas vezes para abrir o arquivo (Supplemental Figura 3). Desenhar um círculo ao portão de monócitos com base em frente e propriedades de dispersão lado, como mostrado na Figura 1A e Suplementar Figura 4. Clique duas vezes a população de monócitos. Observar e desenhar uma caixa em torno do CD3 - população (Supplemental Figura 4).
  5. Clique duas vezes no CD3 - população. Para observar as subpopulações de monócitos CD14-APC seleccionar no eixo "X", e CD16-PECy7 sobre o 'eixo Y'-, e rotular em conformidade (Suplementar Figura 5).
  6. Onde não há distintapopulações positivas e negativas, medir a expressão de Glut1 ou absorção de 2-NBDG nas sub-populações específicas de monócitos. Determinar as intensidades de fluorescência média (IFM) de GLUT1 e 2-NBDG subtraindo-se o isotipo e sem fundo 2-NBDG (Suplementar Figura 6).
  7. Onde existem populações definidas, utilizar o IgG2b-FITC para definir a porta, e determinar a percentagem de células positivas (figura 3).
    NOTA: Utilize este procedimento para analisar totais CD14 + monócitos. Desde a absorção de 2-NBDG é normalmente marcado por uma mudança na fluorescência intensidades os dados são melhor representados por IFM e histogramas.

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Resultados

A compensação deve ser realizada para fluorocromos individuais para evitar transbordamento de fluorescência. Os monócitos são primeiramente enriquecido por gating com base na dispersão frontal e lateral. As parcelas apresentados são representantes de pelo menos seis experiências independentes realizadas em sangue total a partir de seis ou mais participantes, como previamente relatado 10 A Figura 1A mostra a propagação inicial de monócitos por dispersão e a exc...

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Discussão

O protocolo descrito aqui detalha um método simples para examinar a expressão transportador de glicose e captação analógica glucose fluorescente por monócitos e monócitos subpopulações em sangue total. Ao avaliar a absorção de 2-NBDG em sangue total, esta técnica permite condições semelhantes aos in vivo. Um estudo anterior analisou-6 em monócitos NBDG absorção separadas do sangue total por centrifugação de densidade de 17. No entanto, este estudo não avaliou subpopulações de monócitos e separação de...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Centro Australiano para HIV e Hepatite Virology Research (ACH 2) e uma subvenção de desenvolvimento de 2010 (CNIHR) da Universidade de Washington Center for AIDS Research (CFAR), um programa NIH financiados sob o número prêmio AI027757 que é apoiado pelo seguinte NIH institutos e centros (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP é um receptor da concessão 2 CNIHR e ACH. SMC é um destinatário de uma Health and Medical Conselho Nacional de Pesquisa da Austrália (NHMRC) principal Research Fellowship. Os autores agradecem a contribuição para este trabalho do Programa de Apoio Infra-estrutura Operacional Victorian recebido pelo Instituto Burnet. Nós reconhecemos a assistência de Geza Paukovic e Eva Orlowski-Oliver do Mecanismo AMREP Citometria de Fluxo Núcleo de citometria de fluxo formação e aconselhamento técnico. Agradecemos Angus Morgan para o treinamento de mídia e organização da gravação do vídeo. nossa gratidãopara Jesse Masson e Jehad Abdulaziz K. Alzahrani de assistência laboratório durante a gravação do vídeo. Agradecemos os esforços do Dr. David Simar da Faculdade de Ciências Médicas da UNSW, Austrália, que ofereceu aconselhamento metodológico crítico. CSP gostaria de agradecer www.nice-consultants.com de consultas gráficas.

CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES:

CSP concebeu o projeto, concebido e realizado experimentos, analisados ​​e interpretados de dados, e escreveu o manuscrito. JJA interpretado de dados e escreveu o manuscrito. TRB escreveu o manuscrito. JMM interpretado de dados, fizeram sugestões intelectuais críticos e revisão do manuscrito. SMC interpretado de dados, fizeram sugestões intelectuais críticos e revisão do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo VACUETT Tubos anticoagulantes ACD-B de 9 ml GreinerBio-One GmbH455094
tubos de polipropileno estéreis de 5 mlBD Biosciences352063
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA7906
solução de formaldeído a 16%Microscopia eletrônica Ciência15710
BD Solução de lise FACS (10x)BD Biosciences349202Solução de lise BD FACS diluída 1/10 com água deionizada para concentração de trabalho (armazene por até 1 semana a 4 &graus; C)
anti-CD3-PEBD Biosciences555340
anti CD14-APCBD Biosciences555399
anti-CD16-PECy7BD Biosciences557744
anti-Glut1-FITCR & D SistemasFAB1418F
IgG2b-FITCR & D SystemsIC0041F
2-NBDGLife technologiesN13195Suspenda 5 mg de 2-NBDG em 1 ml de água deionizada para fazer uma solução estoque de 14,60 mM (mantenha por até 6 meses a 4 ° Para fazer a concentração de 2-NBDG de trabalho, dilua o estoque 1/100 com 1x DPBS. Cubra com papel alumínio. (armazene por até 1 semana a 4 ° C)
Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (1x)Life technologies14190-144Para fazer a solução de lavagem, adicione 0,5 g de BSA por 100 ml de DPBS (armazene por até 2 semanas a 4 &graus; C)

Referências

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