Coletamos, coramos e fotografamos células da conjuntiva da margem interna da pálpebra de seres humanos. Ao caracterizar a morfologia celular e a atividade metabólica, este método pode aprofundar nossa compreensão do olho seco e do papel que o atrito entre as superfícies oculares pode desempenhar na percepção do desconforto ocular.
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Artigo de método
A citologia de impressão da Área Wiper a tampa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Existem poucos relatos sobre a anatomia celular da área do limpador de pálpebra (LW) da pálpebra interna e apenas um relato faz uso de métodos citológicos. A otimização de um método de coleta, coloração e imagem de células da região LW usando citologia de impressão (IC) é descrita neste estudo. As células são coletadas da superfície interna da pálpebra superior de indivíduos humanos usando membranas hidrofílicas de politetrafluoretileno (PTFE) e coradas com corantes citológicos para revelar a presença de células caliciformes, mucinas, núcleos celulares e vários graus de pré e paraqueratinização. Os corantes imunocitoquímicos mostram atividade da esterase celular e membranas celulares comprometidas pelo uso de um microscópio confocal a laser de varredura. Até 100 imagens digitais microscópicas são capturadas para cada amostra e costuradas em uma imagem de alta resolução e grande escala de todo o intervalo do IC. Demonstramos uma sensibilidade de CI maior do que a relatada anteriormente, apropriada para identificar morfologias celulares e atividade metabólica na área de LW. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que essa seleção de corantes fluorescentes foi usada para obter imagens de membranas LW IC. Este protocolo será eficaz em estudos futuros para revelar detalhes não documentados da área de LW, como avaliar particularidades celulares de usuários de lentes de contato ou pacientes com olho seco ou epiteliopatia do limpador de pálpebras.
Introdução
A pálpebra superior humano executa cerca de 10.000 pisca a cada dia 1, com apenas um 1 - região conjuntival 2 milímetros estreita opostos do globo ocular. Devido ao seu movimento de limpeza durante o pestanejar, esta porção da margem da pálpebra foi denominada a "tampa do limpador" região 2. Supõe-se que o atrito é aumentada nessa região durante a piscar habitual, devido à tampa limpar todo o globo. Isto pode desempenhar um papel significativo no conforto ocular. Lente de contato usuários em particular experiência de desconforto ocular e esta é uma das razões principais para cessar o uso das lentes 3. Quando uma lente de contacto é colocada sobre o olho, o coeficiente de atrito entre o material da lente e a superfície ocular foi mostrado para alterar 4. Há evidências que sugerem que os sintomas de secura pode estar relacionado a este atrito alterado 2,5,6.
Esta associação também pode ser refletida em fenômenos observáveis clinicamente, nomeadamente wi tampapor epiteliopatia (LWE), também chamado superior da tampa margem de coloração (ULMS) 6. LWE é um sinal precoce de irritação ocular e um preditor potencial para a doença do olho seco. Ele é observado e medido pela coloração vital das regiões superiores e inferiores margem palpebral. Embora este sistema de classificação 2 e sua validade clínica (ou seja, correlação com sintomas subjetivos) ainda estão em debate, desconforto ocular permanece um enigma para os médicos e cientistas e, mais importante, um inconveniente para os pacientes.
Até à data, pouco se sabe sobre as variações clinicamente relevantes no (sub) anatomia celular e fisiologia da área do limpador a tampa 7 e apenas um relatório faz uso de métodos citológicos 8. Citologia de impressão (CI) foi utilizada há mais de 40 anos para recolher as células a partir da superfície do epitélio da conjuntiva tarsal bulbar ou por aplicação de uma membrana de 9,10. Após remoção, as células aderentes submeter Cytological coloração e de imagem microscópica. Devido às diferenças anatómicos celulares e na região do limpador a tampa, esta técnica requer a optimização.
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Protocolo
declaração de ética: Antes da coleta de células de seres humanos, consentimento informado e aprovação ética deve ser obtida.
1. Prepare Stain
NOTA: Prepare mancha no dia do experimento.
- Adicionar 5 uL de etídio (ou 4 mM) e 5 ul de calceína AM (ou 4 mM) a 2,5 ml de tampão fosfato salino (PBS) em 15 ml de tubo de centrifugação; misturar. Embrulhe em papel alumínio para proteger da luz e armazenar a RT até o uso.
2. Células Colete
- Remover inserções de cultura de células a partir de sua embalagem e rotulagem para cada pálpebra a amostrar. Marca de orientação de recolha de células, no lado do suporte de plástico membrana utilizando marcador permanente. Conduta fenda inspecção lâmpada com uma ampliação moderada (aproximadamente 20X) para confirmar a saúde adequada da região de se submeter IC.
- Dispensar uma gota de anestésico tópico (0,5% de cloridrato de proparacaína) no fundo do saco conjuntival de EAch olho e instruir participante para manter os olhos fechados por um minuto.
- Evert tampa e parte superior do olho manter no lugar pelos cílios; evitar qualquer contato com a área da tampa do limpador.
Opcional: a ajuda de um investigador secundária pode ser necessário para executar esta etapa. - Aplicar membrana perpendicularmente sobre a parte central da região do limpador a tampa com o mínimo de pressão.
- Segure membrana no local por 3-5 seg. Observe a membrana se tornar translúcida na área de contato. Neste ponto, remover suavemente a membrana e permitir tampa do participante para "flip" de volta no lugar.
- Prontamente aplicar uma gota de PBS à amostra, para impedir que sequem. Membrana girará translúcida e opaca não deve ligar a qualquer momento, como isso indica secagem. Têm o investigador secundário prosseguir imediatamente com o processamento de amostras (secção 3).
- Realizar verificação final olho para garantir a integridade da conjuntiva. Dispensar lubrificantes oculares e instruir participantepara evitar esfregar os olhos até que o efeito anestésico desgasta fora (aprox. 15 min).
Processamento 3. Amostra
- Utilizando micro-tesoura, cortar a membrana na metade (metade de cada uma das análises a jusante), perpendicular através do meio da recolha de células. O corte ao longo da margem exterior de uma metade da membrana para separar o do suporte de plástico; evitar a interacção com as células recolhidas na membrana, incluindo assegurar que a membrana não se dobra sobre si própria.
- Garantir a membrana usando uma pinça antes completamente desconectar do titular. Ponto de membrana para dentro do tubo de centrífuga de 2 ml rotulados, contendo 500 ul de 95% (v / v) de etanol e deixa-se fixar durante um mínimo de 20 min a um máximo de 2 horas antes do processamento (secção 4.2).
- segunda metade imediatamente separada da membrana (como descrito na seção 3.2) e proceder imediatamente com a secção 4.1.
Coloração 4. Amostra
- Immunocytochemical coloração
- Com cuidado, coloque membrana em 35 milímetros de vidro prato de cultura inferior com o lado coleção voltada para baixo; garantir a membrana é plana.
- Pipetar 20 l de composição mancha imunocitoquímica montada na secção 1 para a membrana. Se amostra cachos, use pontas de pipeta descartáveis para achatar cuidadosamente a membrana, empurrando suas bordas para baixo. Evitar o contacto com as zonas de recolha de células.
- Gentilmente cobrir a membrana com tampa de vidro deslizante. Evite movimento desnecessário da amostra. Cubra a assadeira com tampa e vedação com laboratório de película em torno das bordas. Não obstrua a transparência de prato (superior e inferior) e visibilidade da amostra. Etiqueta com marcador de laboratório.
- proceder imediatamente à imagem (secção 5.1), em seguida, voltar a secção 4.2 para continuar com coloração citológica da outra metade da membrana.
- citológico coloração
- Gradualmente hidratar membrana por adição lenta de 500 mL de água destilada para o tubo de retornosed para fixação na secção 3.4. conteúdo aspirado várias vezes na ponta da pipeta para misturar, em seguida, remover conteúdo.
- Adicionar 500 uL de água destilada. Deixe repousar por alguns segundos, em seguida, remover. Adicionar 500 mL de mancha azul Alcian e deixe por 3 min. Remover manchas e realizar 3 consecutiva 500 mL de água destilada lavagens ou até que o líquido lavagens claras.
- Adicionar 500 mL de Hematoxilina # 1 mancha e deixe por 3 min. Remover manchas e realizar três consecutivos 500 mL lavagens água destilada ou até que o líquido lavagens claras. Desidratar (inverso do ponto 4.2.1) por aspiração do líquido claro.
- Adicionar 500 mL de Papanicolaou OG-6 mancha e deixe por 3 min. Remover mancha e executar um de 500 ul 95% (v / v) de lavagem etanol.
- Adicionar 500 ul de corante Papanicolaou EA-65 e deixar durante 3 min. Remover mancha e executar três consecutiva de 500 ul de 95% (v / v) de etanol lavagens.
- Totalmente desidratar usando 500 ul três lavagens consecutivas de 100% de etanol. usando tweezers, retirar amostra de solução; evitar áreas de coleta de células tocantes.
- Coloque membrana sobre lâmina de vidro; assegurar que a linha de colheita de células é paralela ou perpendicular a deslizar margem para o alinhamento mais fácil durante o exame.
- Aplique uma gota de etanol 100% e cubra com deslizamento de vidro. proceder imediatamente à imagem (secção 5.2).
5. Amostra de imagem
- Imagens fluorescentes imunocitoquímicos Stains
- Use um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) 11 ou microscópio de fluorescência 12, equipado com uma câmera de cor digital, conectado a um computador com um software de aquisição de imagem. Devido às amostras a ser contido dentro placas de cultura, um microscópio invertido pode ser necessário.
- Defina-se 11,12 microscópio de acordo com espectros de absorção e emissão de etídio homodímero-1 (528/617 nm máximos Ex / Em na presença de ADN) e calceína AM (494/517 nm Ex / Em máximos).
- Selecione menor ampliação do microscópio (por exemplo, objetiva 2,5X) e ativar o sistema de imagem digital; observar a amostra indicada no monitor do computador.
- Inspecione amostra para características celulares de interesse.
- Selecione ampliação microscópio desejado e adquirir imagens usando software de imagem.
- Salvar arquivos em qualquer formato de arquivo microscópio nativo ou um formato de arquivo não compactado (por exemplo, * .raw, * .tiff).
- Imagem citológica Stains
- Use um microscópio padrão de laboratório de campo brilhante sem filtros, equipado com uma câmera de cor digital, conectado a um computador com um software de aquisição de imagem.
- Local e lâmina de vidro bloqueio (do passo 4.2.8) no palco microscópio. Rehidratar amostra com etanol a 100%, conforme necessário, ao longo do procedimento de imagem inteira.
- Selecione menor ampliação do microscópio (por exemplo, objetiva 2,5X) e ativar thsistema de imagem digital e; observar a amostra indicada no monitor do computador.
- Assegurar a recolha de células é alinhado com um dos eixos X ou Y de controle do estágio de microscópio. Ajuste, se necessário, pela remoção da tampa de deslizamento e rotação da amostra, utilizando uma ponta de pipeta ou pinças.
- Usando a imagem (s) de captura de toda a amostra com o microscópio de ampliação menor software de imagem,.
- Mudar para a ampliação do microscópio moderada (por exemplo, 10 - 20X objetiva) e ajustar fonte de luz do microscópio e parâmetros de imagem de software (exposição, contraste, balanço de brancos, etc.), e desativar a sua medição de software automatizado. Salvar essas configurações para uso futuro.
- Determinar pontos inicial e final de varredura (por exemplo, superior esquerdo e direito cantos inferiores de recolha de células).
- Usando a imagem (s) de captura de toda a área de colheita de células dentro dos pontos inicial e final software de imagem,. Certifique-se a 20% lado-a-lado e de cima para baixo sobreposição between todas as imagens adjacentes.
- Salvar arquivos usando o formato de arquivo microscópio nativo ou um formato de arquivo não compactado (por exemplo, * .raw, * .tiff).
- Gerar imagem panorâmica final usando o software automatizado costura de escolha (por exemplo, o Adobe Photoshop Elements). Use imagens de referência tomadas no passo 5.2.5) para confirmar a precisão da costura automatizada na imagem final.
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Resultados
A membrana de cultura de células durou mais o suporte de plástico é uma ferramenta conveniente para a recolha de mão de células epiteliais da conjuntiva tampa do limpador. Este método elimina a necessidade de instrumentos esterilizados adicionais tipicamente utilizados para preparar e manipular membranas IC. A Figura 1 representa a área de IC limpador a tampa usando uma inserção de cultura de células. Nós otimizamos dois protocolos de coloração diferentes que se compleme...
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Discussão
citologia de impressão é tipicamente realizada na conjuntiva bulbar, utilizando membranas de ésteres de celulose misturados. As amostras são cortadas ao tamanho a partir de folhas de material a granel, esterilizado, aplicado e removido da superfície conjuntival utilizando fórceps. Usando o mesmo material de membrana, um dispositivo de IC controlado-pistão foi recentemente concebido para coincidir com a geometria da superfície da conjuntiva bulbar, e manter a pressão constante entre 13 aplicações. Essas aborda...
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Divulgações
Os autores não têm financiamento relevante ou conflitos a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao nosso colega Dr. Jalaiah Varikooty, que forneceu informações e conhecimentos sobre o tema do limpador de tampa, que ajudou muito nesta pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Azul de Alcian, 1% em ácido acético a 3% | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxilina, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Coloração de Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Coloração de Papanicolaou, Kit de | Sigma | HT40232-1L | |
| Vivo/Morto | Life Technologies | L-3224 | contém etídio homodímero-1 e corantes de Calceína AM |
| Alcaine (0,5% de cloridrato de proparacaína) | Millicell Alcon | ||
| , 12 mm, PTFE hidrofílico, 0,4 µ m | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Pratos com Fundo de Vidro de 35 mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referências
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Reimpressões e permissões
