Coletamos, coramos e fotografamos células da conjuntiva da margem interna da pálpebra de seres humanos. Ao caracterizar a morfologia celular e a atividade metabólica, este método pode aprofundar nossa compreensão do olho seco e do papel que o atrito entre as superfícies oculares pode desempenhar na percepção do desconforto ocular.
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Artigo de método
A citologia de impressão da Área Wiper a tampa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Existem poucos relatos sobre a anatomia celular da área do limpador de pálpebra (LW) da pálpebra interna e apenas um relato faz uso de métodos citológicos. A otimização de um método de coleta, coloração e imagem de células da região LW usando citologia de impressão (IC) é descrita neste estudo. As células são coletadas da superfície interna da pálpebra superior de indivíduos humanos usando membranas hidrofílicas de politetrafluoretileno (PTFE) e coradas com corantes citológicos para revelar a presença de células caliciformes, mucinas, núcleos celulares e vários graus de pré e paraqueratinização. Os corantes imunocitoquímicos mostram atividade da esterase celular e membranas celulares comprometidas pelo uso de um microscópio confocal a laser de varredura. Até 100 imagens digitais microscópicas são capturadas para cada amostra e costuradas em uma imagem de alta resolução e grande escala de todo o intervalo do IC. Demonstramos uma sensibilidade de CI maior do que a relatada anteriormente, apropriada para identificar morfologias celulares e atividade metabólica na área de LW. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que essa seleção de corantes fluorescentes foi usada para obter imagens de membranas LW IC. Este protocolo será eficaz em estudos futuros para revelar detalhes não documentados da área de LW, como avaliar particularidades celulares de usuários de lentes de contato ou pacientes com olho seco ou epiteliopatia do limpador de pálpebras.
Introdução
A pálpebra superior humano executa cerca de 10.000 pisca a cada dia 1, com apenas um 1 - região conjuntival 2 milímetros estreita opostos do globo ocular. Devido ao seu movimento de limpeza durante o pestanejar, esta porção da margem da pálpebra foi denominada a "tampa do limpador" região 2. Supõe-se que o atrito é aumentada nessa região durante a piscar habitual, devido à tampa limpar todo o globo. Isto pode desempenhar um papel significativo no conforto ocular. Lente de contato usuários em particular experiência de desconforto ocular e esta é uma das razões principais para cessar o uso das lentes 3. Quando uma lente de contacto é co....
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Protocolo
declaração de ética: Antes da coleta de células de seres humanos, consentimento informado e aprovação ética deve ser obtida.
1. Prepare Stain
NOTA: Prepare mancha no dia do experimento.
- Adicionar 5 uL de etídio (ou 4 mM) e 5 ul de calceína AM (ou 4 mM) a 2,5 ml de tampão fosfato salino (PBS) em 15 ml de tubo de centrifugação; misturar. Embrulhe em papel alumínio para proteger da luz e armazenar a RT até o uso.
2. Células Colete
- Remover inserções de cultura de células a partir de sua embalagem e rotulagem para cada pálpebra a amostrar. Marca de orientação....
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Resultados
A membrana de cultura de células durou mais o suporte de plástico é uma ferramenta conveniente para a recolha de mão de células epiteliais da conjuntiva tampa do limpador. Este método elimina a necessidade de instrumentos esterilizados adicionais tipicamente utilizados para preparar e manipular membranas IC. A Figura 1 representa a área de IC limpador a tampa usando uma inserção de cultura de células. Nós otimizamos dois protocolos de coloração diferentes que se compleme.......
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Discussão
citologia de impressão é tipicamente realizada na conjuntiva bulbar, utilizando membranas de ésteres de celulose misturados. As amostras são cortadas ao tamanho a partir de folhas de material a granel, esterilizado, aplicado e removido da superfície conjuntival utilizando fórceps. Usando o mesmo material de membrana, um dispositivo de IC controlado-pistão foi recentemente concebido para coincidir com a geometria da superfície da conjuntiva bulbar, e manter a pressão constante entre 13 aplicações. Essas aborda.......
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Divulgações
Os autores não têm financiamento relevante ou conflitos a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao nosso colega Dr. Jalaiah Varikooty, que forneceu informações e conhecimentos sobre o tema do limpador de tampa, que ajudou muito nesta pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Azul de Alcian, 1% em ácido acético a 3% | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxilina, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Coloração de Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Coloração de Papanicolaou, Kit de | Sigma | HT40232-1L | |
| Vivo/Morto | Life Technologies | L-3224 | contém etídio homodímero-1 e corantes de Calceína AM |
| Alcaine (0,5% de cloridrato de proparacaína) | Millicell Alcon | ||
| , 12 mm, PTFE hidrofílico, 0,4 µ m | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Pratos com Fundo de Vidro de 35 mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referências
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
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Reimpressões e permissões
