Coherent dispersão anti-Stokes Raman (CARS) Microscopia baseado em vibração inerente de títulos molécula permite imagens de células vivas quimicamente seletiva sem rótulo. Este trabalho apresenta a implementação de uma técnica de microscopia complementar sobre um microscópio de varredura a laser padrão multiphoton baseado em um Ti femtosecond: laser de safira e um laser OPO.
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Artigo de método
Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
microscópios de varredura a laser, combinando a Ti femtosecond: laser de safira e uma óptica oscilador paramétrico (OPO) para duplicar a linha de laser tornaram-se disponíveis para os biólogos. Estes sistemas são projetados principalmente para a microscopia de fluorescência de dois fotões multi-canal. No entanto, sem qualquer modificação, microscopia óptica não-linear complementar, como segundo harmônico geração (SHG) ou terceira geração harmônica (THG) também pode ser realizada com este set-up, permitindo que imagens sem rótulo de moléculas estruturados ou médio aquosa interfaces de lípidos. Estas técnicas são bem adequados para a observação in vivo, mas estão limitados na especificidade química. Quimicamente imagiologia selectivo pode ser obtido a partir de sinais de vibração inerentes com base na dispersão de Raman. A microscopia confocal Raman fornece resolução espacial 3D, mas requer alta potência média e tempo de aquisição de comprimento. Para superar essas dificuldades, avanços recentes na tecnologia laser permitiram a develmento de microscopia óptica vibracional não-linear, em particular coerente anti Stokes-espalhamento Raman (CARS). CARROS microscopia, portanto, surgiu como uma ferramenta poderosa para imagens de células biológicas e ao vivo, por lipídios quimicamente mapeamento (através da vibração de estiramento CH), água (através de vibrações de estiramento OH), proteínas ou DNA. Neste trabalho, descrevemos a implementação da técnica CARROS em um microscópio multiphoton varredura a laser acoplado a OPO padrão. Baseia-se a sincronização em tempo das duas linhas de laser, ajustando o comprimento de um caminho do feixe de laser. Nós apresentamos uma implementação passo-a-passo desta técnica em um sistema multiphoton existente. A formação básica em óptica experimental é útil e o sistema apresentado não requer equipamento adicional caro. Também ilustram CARROS imaging obtidos em bainhas de mielina do nervo ciático de roedor, e mostra-se que esta imagem pode ser realizado simultaneamente com outra imagem óptica não linear, tal como o padrão two-photon técnica de fluorescência e geração de segundo harmônico.
Introdução
A microscopia óptica tornou-se uma importante técnica para visualização não destrutiva de processos dinâmicos em sistemas biológicos vivendo com uma resolução subcelular. Microscopia de fluorescência é atualmente o contraste de imagem mais popular usado em células vivas, devido à sua alta especificidade e sensibilidade 1. Uma grande paleta de sondas fluorescentes (corantes emergiu exógenos, proteínas geneticamente codificados, nanopartículas de semicondutores). Várias técnicas fluorescente à base de iluminação da amostra floresceram (tal como microscopia confocal ou de dois fotões) realizar imagem 3D e para reduzir uma principal desvantagem desta técnica é....
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Protocolo
Figura 1. Representação esquemática do geral set-up Ele inclui a Ti:. Safira (680 - 1080 nm) e a OPO (1.050 - 1.300 nm) lasers, a linha de atraso com os 4 espelhos (M 1 a M 4), o osciloscópio rápido, o fotodiodo e duas íris fixa diafragmas I 1 e I 2. Espelhos M 2 e M 3 são fixados numa fase de translação linear que permite modificar o comprimento da linha de atraso com uma resolução micrómetro. A 660 -. 685 filtro de passagem de ba....
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Resultados
A frequência de trem de pulsos de Ti padrão: laser de safira é normalmente em torno de 80 MHz. A OPO tem a mesma frequência, uma vez que é bombeado pelo Ti: Safira laser. Por conseguinte, é necessário um osciloscópio de jejum de pelo menos 200 MHz. Um fotodíodo rápido na gama de 600 também é necessária a 1100 nm. A mudança temporais máxima ocorre quando o Ti: safira e os sinais OPO são deslocados de 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanossegundos. Isso corresponde a um desvio má.......
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Discussão
A parte mais desafiadora do trabalho é a sincronização temporal dos feixes de laser. Exige um fotodíodo rápido combinado com um osciloscópio rápido, mas apenas uma sobreposição áspera no tempo pode ser realizada em primeiro lugar. Em seguida, é necessário um novo ajustamento de alguns cm. Finalmente, micrômetro se move por uma fase de tradução linear permite realizar o ajuste fino do final do comprimento da linha de atraso para acionar o sinal de CARS. Este sinal é mantida numa gama estreita de cerca de 20 micrómetros, .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores querem agradecer ao Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, França) pelo empréstimo do osciloscópio rápido e agradecer o apoio financeiro da Montpellier RIO Imaging (MRI). O RH reconhece que a ANR concede à France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) e à France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) redes de infraestrutura para desenvolvimentos coerentes de imagens Raman. Este trabalho foi apoiado principalmente por uma bolsa do Conselho Europeu de Pesquisa (FP7-IDEAS-ERC 311610) e uma bolsa INSERM - AVENIR para NT.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Osciloscópio | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Fotodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm |
| Ti:Laser de safira Camaleão Ultra Família II | Oscilador | ||
| OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscópio LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Periscópio motorizado | Newport | ||
| Objetivo W Plan-Apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Combinador de feixe | Carl Zeiss | ||
| Modulador acústico-óptico | Carl Zeiss | ||
| Atenuador de potência OPO | Carl Zeiss | ||
| Tubo fotomultiplicador | Carl Zeiss | ||
| Software ZEN | Carl Zeiss | ||
| Bandpass Filtros | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 Nm; 465 - 610 nm |
| Espelho dicróico | Carl Zeiss | Comprimento de onda de corte 760 nm | |
| Silver espelhos | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantidade 4 |
| Estágio de tradução de eixo único com micrômetro padrão | Thorlabs | PT1/M | Quantidade 1 |
| Placa de ensaio de alumínio | Thorlabs | MB1015/M | Quantidade 1 |
| Montagem espelhada | Thorlabs | KMSS/M | Quantidade 4 |
| Suporte de espelho para Ø Óptica de 1" | Thorlabs | MH25 | Quantidade 4 |
| Diafragmas de Íris | Thorlabs | ID8/M | Quantidade 3 |
| Caixa protetora | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantidade 1 |
| Postes ópticos | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantidade 8 (comprimentos dependendo da configuração) |
| Filtro passa-banda 661 - 690 nm | Semrock | 676/29 nm BrightLine® filtro passa-banda de banda única | Quantidade 1 |
| Esferas fluorescentes | ThermoFisher | TetraSpeck™ Kit de tamanho de microesferas fluorescentes | |
| P5L07 | |||
| FluoroMielina™ Mancha de Mielina Fluorescente Vermelha | ThermoFisher | F34652 |
Referências
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J.
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Reimpressões e permissões
