Aqui, apresentamos um protocolo robusto, rápido e escalável de diferenciação de cardiomiócitos para células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Os cardiomiócitos derivados usando este método em larga escala podem fornecer números de células suficientes para seu uso efetivo na modelagem de doenças cardiovasculares humanas, triagem de medicamentos de alto rendimento e aplicações potencialmente clínicas.
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Artigo de método
Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Maximizando o benefício de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) para a investigação, modelagem doença, farmacêutica e aplicações clínicas requer métodos robustos para a produção em larga escala de tipos de células funcionais, incluindo cardiomiócitos. Aqui demonstramos que a manipulação temporal da WNT, TGF-β, e SHH vias de sinalização leva a linhas HPSC diferenciação de cardiomiócitos altamente eficiente de uma única célula passadas em ambos suspensão estática e sistemas de suspensão biorreactor agitado. Empregando esta estratégia resultou em ~ 100% de bater esferóides, contendo consistentemente> 80% de células T-positivos de troponina cardíaca após 15 dias de cultura, validados em várias linhas HPSC. Nós também um relatório sobre a variação deste protocolo para uso com linhas celulares não está adaptado para passaging de uma única célula, o sucesso do que foi verificado em 42 linhas HPSC. Cardiomiócitos gerados usando estes protocolos expressam marcadores de linhagem específica e show esperado electrophysfuncionalidades iological. Nosso protocolo apresenta uma plataforma simples, eficiente e fiável para a produção em larga escala de cardiomiócitos humanos.
Introdução
As células humanas pluripotentes estaminais (hPSCs), incluindo células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), têm a capacidade de auto-renovação e a capacidade de se diferenciar em células dos três folhetos embrionários 1,2. Devido a estas características, hPSCs fornecer uma fonte valiosa e ilimitado para a geração e escalonável de produção de tipos de células doenças relevantes para a modelagem de doenças humanas 3-5, para high-throughput screening de drogas e de toxicidade ensaios 6,7 e, potencialmente, para aplicações clínicas 8 . Geração de cardiomiócitos de hPSCs prop....
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Protocolo
1. Preparação de Meios de Cultura, revestimento de placas de cultura celular e Manutenção de Undifferentiated hPSCs
- Preparação de mídia
Nota: Esterilizar mídia usando um dispositivo de 0,22 filtração e armazenar a 4 ° C ao abrigo da luz por até 4 semanas. Nomes de reagentes, fornecedores e números de catálogo estão listadas na Tabela de Materiais.- Para embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEF) médio, combinar 445 ml de DMEM, 50 mL Soro Fetal Bovino (FBS) e 5 ml de meio de cultura de células (por exemplo, Glutamax).
- Para células estaminais embrionárias humanas Médio, ....
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Resultados
A fim de estabelecer um método simples para a diferenciação em larga escala de cardiomiócitos de hPSCs, criámos um protocolo em que as células foram tratadas inicialmente com um activador da via Wnt / β-catenina (CHIR99021) 16 e subsequentemente com inibidores da via Wnt / β- catenina e vias de crescimento factor de transformação de-β (TGF-β) (IWP2 16 e SB431542 17, respectivamente) e, finalmente, um activador do sonic hedgehog (SHH) via (purmorphamine) <.......
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Discussão
Os cardiomiócitos derivados de hPSCs são uma fonte extremamente atraente para uso em modelagem doença humana, os testes de triagem / toxicidade do fármaco e, talvez, no futuro, as terapias de regeneração. Um dos principais obstáculos para a utilização destas células no entanto, é a capacidade de fornecer o material de alta qualidade suficiente para a sua utilização eficaz. Usando nosso protocolo descrito, oferecemos um método que supera essa limitação.
Recentemente, pequenas moléculas sintét.......
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Divulgações
O Chang Instituto de Pesquisa Cardíaca Victor não se envolver em, nem tolera, a destruição de embriões humanos para pesquisa. A sua contribuição para este estudo foi limitado a trabalhar em células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem.
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado por doações fornecidas pelo Royan Institute, Conselho Iraniano de Pesquisa e Tecnologia de Células-Tronco, Fundação Nacional de Ciência do Irã (INSF), Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (NHMRC; 354400), Fundação Nacional do Coração da Austrália / Heart Kids Australia (G11S5629) e Rede de Pesquisa Cardiovascular de Nova Gales do Sul. A HF foi apoiada por uma bolsa de estudos de pós-graduação internacional da Universidade de Nova Gales do Sul, Austrália. O RPH foi apoiado por uma bolsa do NHMRC Austrália. Os autores expressam sua gratidão aos sujeitos humanos que participaram desta pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Aminoácidos não essenciais | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Fator Básico de Crescimento de Fibroblastos (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM | Gel Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Soro Bovino Fatal (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 menos insulina | Gibco | A18956-01 | |
| Penicilina / Estreptomicina | Life Technologies | 15070063 | |
| 0,05% Tripsina / EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Colgenase Tipo IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomicina C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorfinamina | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| inibidor de ROCK Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Álcool Polivinílico (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Tecnologias Celulares Inovadoras Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Frasco giratório com 1 pêndulo, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) | Preparado internamente (ou disponível comercialmente) | ||
| Linhagens de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) | Preparado internamente (ou disponível comercialmente) |
Referências
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (200....
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Reimpressões e permissões
