25 de julho de 2016
Aqui, apresentamos um protocolo robusto, rápido e escalável de diferenciação de cardiomiócitos para células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Os cardiomiócitos derivados usando este método em larga escala podem fornecer números de células suficientes para seu uso efetivo na modelagem de doenças cardiovasculares humanas, triagem de medicamentos de alto rendimento e aplicações potencialmente clínicas.
O objetivo geral deste experimento é diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em cardiomiócitos com alta eficiência e reprodutibilidade. Este protocolo pode ser ampliado em um biorreator ou modificado para linhagens celulares que são sensíveis ao cultivo em células isoladas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na modelagem de doenças cardíacas utilizando células-tronco pluripotentes induzidas humanas.
As principais vantagens desta técnica são seu baixo custo e alta eficiência, reprodutibilidade e aplicabilidade tanto para células-tronco embrionárias humanas quanto para células-tronco pluripotentes induzidas. Nossa demonstradora hoje é Hananeh Fonoudi, atualmente estudante de doutorado no Victor Chang Cardiac Research Institute, que veio até nós do Royan Institute. Antes do revestimento, utilize uma escova de limpeza e água destilada para remover completamente qualquer poeira ou resíduo de cultura de um frasco agitador de 100 mililitros com pêndulo de vidro.
Em seguida, preencha o frasco com etanol 70%. Após 30 minutos, enxágue o frasco com água destilada e preencha-o com hidróxido de sódio cinco molar. Na manhã seguinte, enxágue o frasco em água corrente por cinco minutos e preencha-o com ácido clorídrico um molar.
Após 15 minutos, enxágue o frasco sob água corrente por mais cinco minutos, seguido por duas lavagens com água bidestilada. Coloque o frasco em uma cabine de segurança biológica para secar. Em seguida, adicione 1,5 mililitros da solução siliconizada ao frasco e gire o frasco horizontalmente para cobrir todas as superfícies com silício.
Aqueça o frasco revestido em uma estufa seca por uma hora a 100 graus Celsius. Após o resfriamento do frasco, enxágue-o três vezes por 15 minutos com água deionizada. Em seguida, esterilize o recipiente em autoclave a 121 graus Celsius por 20 minutos.
Após o repicagem de esferoides não diferenciados, utilizando o método de repicagem em células simples pelo menos três vezes, use uma pipeta de cinco mililitros para transferir todos os esferoides não diferenciados para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os poços com um mililitro de meio de células-tronco embrionárias humanas para coletar quaisquer esferoides remanescentes e reúna a lavagem com os esferoides colhidos. Deixe os esferoides sedimentarem por cinco minutos para formar um pellet solto.
Em seguida, aspire o sobrenatante, tomando cuidado para não remover nenhum esferoide. Depois, lave os esferoides com um mililitro de PBS durante cinco minutos e incube-os em 5 mililitros de tripsina EDTA a 37 graus Celsius. Após quatro a cinco minutos, interrompa a reação com um mililitro de meio de células-tronco embrionárias humanas e utilize uma pipeta P1000 para dissociar os esferoides em uma suspensão de células isoladas.
Após a contagem pelo método de exclusão com azul de tripano, re-suspenda as células numa concentração de 200.000 células por mililitro em meio condicionado suplementado com fator de crescimento de fibroblastos básico e inibidor de ROCK, e transfira 100 mililitros da suspensão celular para o frasco do biorreator silanizado. Coloque o frasco no agitador a 35 RPM. Após 24 horas, aumente a agitação para 40 RPM.
Após 48 horas, interrompa a agitação por cinco a dez minutos até que todas as esferoides reorganizadas tenham sedimentado no fundo do frasco e substitua metade do meio por meio condicionado suplementado com fator básico de crescimento de fibroblastos. Em seguida, reinicie o agitador a 40 RPM por mais 24 horas, substituindo metade do meio pelo mesmo processo a cada dia, durante os próximos três dias. No quinto dia, pare o agitador por cinco a dez minutos.
Em seguida, transfira todos os esferoides para um tubo de 50 mililitros contendo 50 mililitros de meio ou menos. Descarte todo o meio remanescente no frasco, tomando cuidado para que nenhum esferoide permaneça no recipiente. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante dos esferoides sedimentados e lave os aglomerados celulares com 25 mililitros de PBS contendo cálcio e magnésio.
Após cinco a dez minutos, remova a lavagem e ressuspenda os esferoides em 40 mililitros de meio RPMI-B27 suplementado com inibidor da glicogênio sintase quinase-3, inibidor de ROCK e álcool polivinílico. Transfira todos os esferoides de volta para o frasco do biorreator. Em seguida, adicione meio RPMI-B27 fresco até um volume total de 100 mililitros e reinicie a agitação a 40 RPM.
Após 24 horas, siga o mesmo processo para trocar o meio para o meio RPMI-B27. Após mais 24 horas, siga o mesmo processo e troque o meio por RPMI-B27 contendo IWP2, purmorfanina e SB43. Incube por 48 horas.
A primeira batida geralmente é observada após sete dias. Para a diferenciação rápida de linhagens de células-tronco pluripotentes humanas que não foram adaptadas ao cultivo em células isoladas, trate primeiramente um cultivo de células-tronco pluripotentes humanas com 70 a 80% de confluência, crescido sobre células de fibroblastos embrionários de camundongo, com 5 mililitros de solução de dissociação por 30 a 60 segundos. A solução de dissociação deve permanecer apenas até que os MEFs se arredondem e as bordas das colônias de hPSC fiquem nítidas.
Se as células permanecerem por muito tempo, elas não irão se diferenciar corretamente. No momento apropriado, substitua rapidamente a solução de dissociação por 75 mililitros de colagenase tipo IV e incube as células por cinco a 15 minutos a 37 graus Celsius, verificando a cultura sob o microscópio a cada poucos minutos. Quando colônias inteiras começarem a se soltar, substitua a colagenase por 1,5 mililitro de meio para células-tronco embrionárias humanas e use uma pipeta P1000 para desprender suavemente colônias inteiras de células do fundo da placa.
As células devem ser cuidadosamente destacadas para que as colônias não se fragmentem em pequenos pedaços. Em seguida, utilize uma pipeta de cinco mililitros para transferir as células para um tubo cônico de 15 mililitros e lave as cavidades com um mililitro de meio de células-tronco embrionárias humanas, reunindo as células remanescentes no tubo de 15 mililitros. Após cinco minutos de sedimentação, substitua cuidadosamente o sobrenadante por dois mililitros de meio fresco de células-tronco embrionárias humanas suplementado com fator de crescimento de fibroblastos básico.
Usando uma nova pipeta de cinco mililitros, transfira as células para uma placa de adesão ultra-baixa e incube as colônias por seis a 12 horas. Ao final da incubação, use uma pipeta de cinco mililitros para transferir cuidadosamente os agregados de colônias para um novo tubo de 15 mililitros e colete os agregados remanescentes com uma lavagem com meio RPMI-B27. Quando as colônias tiverem sedimentado, substitua o sobrenadante por meio RPMI-B27 fresco suplementado com inibidor da glicogênio sintase quinase-3 e transfira cuidadosamente as colônias para placas revestidas com laminina para adesão a 37 graus Celsius.
Após 24 horas, troque o meio por meio RPMI-B27. Após mais 24 horas, troque o meio por RPMI-B27 contendo IWP2, purmorphamina e SB43. A primeira contração geralmente é observada após sete dias.
Até o momento, o protocolo de diferenciação em suspensão estática foi testado em cinco linhagens de células-tronco embrionárias humanas e quatro linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas humanas, resultando em mais de 90% de esferoides contráteis em cada linhagem, demonstrando a alta reprodutibilidade deste protocolo entre diferentes linhagens de células-tronco pluripotentes humanas. Os esferoides em diferenciação exibem comportamento semelhante em um ambiente de biorreator de suspensão agitada e no sistema estático, com aproximadamente 100% dos esferoides observados em contração no dia 10. De fato, cortes de esferoides contráteis coletados no dia 30 revelam a expressão citoplasmática da troponina T cardíaca e a expressão nuclear do fator de transcrição cardíaco NKX2.5, respectivamente.
Além disso, quando esferoides indiferenciados são substituídos por agregados celulares indiferenciados, surgem aglomerados contráteis sete dias após a diferenciação. Com 42 linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas humanas testadas, gerando em média mais de 60% de populações celulares positivas para troponina T cardíaca no dia 15. Os aglomerados contráteis também demonstram expressão citoplasmática semelhante de troponina T cardíaca e expressão nuclear de NKX2.5, como observado nos esferoides gerados em biorreatores de suspensão agitada.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de utilizar hPSCs que tenham sido adaptadas ao cultivo de células únicas por pelo menos três passagens antes da diferenciação no biorreator. Este procedimento pode ser combinado com outros métodos de enriquecimento de cardiomiócitos para obter uma população pura de células. Esta técnica abriu caminho para a comercialização de cardiomiócitos derivados de hPSCs.
Tem potencial para uso em aplicações clínicas, farmacêuticas, engenharia de tecidos e desenvolvimento de órgãos ou organoides. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como diferenciar eficientemente células-tronco pluripotentes humanas em cardiomiócitos e como ampliar o cultivo em biorreator.
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Este artigo apresenta um protocolo escalonável para a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em cardiomiócitos. O método foi desenvolvido para alta eficiência e reprodutibilidade, tornando-o adequado para modelagem de doenças cardiovasculares e triagem de fármacos.
A diferenciação em larga escala e reprodutível de células-tronco pluripotentes humanas em cardiomiócitos resolve um gargalo crítico na modelagem pré-clínica de doenças cardíacas e na descoberta de fármacos. Este protocolo permite a geração robusta de cardiomiócitos funcionais, apoiando pesquisas translacionais e triagens de alto rendimento. Sua escalabilidade e consistência impactam diretamente o avanço da carteira de projetos e a confiança preditiva no desenvolvimento cardiovascular em estágios iniciais.
Este protocolo integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica, fornecendo uma fonte escalável de cardiomiócitos funcionais para diversas fluxos de trabalho de P&D.