Abstract
תאי גזע Trophoblast (TSCs) העולות אגב החלטת גורל התא הראשונה בפיתוח יונק. הם יכולים להיות מתורבת במבחנה, שמירה על היכולת העצמית לחדש להתמיין בכל תתי הסוגים של השושלת trophoblast, שווה ערך ל vivo ב גזע עלייה נותן אוכלוסיית תאים לחלק העוברי של השליה. לכן, TSCs מציע מודל ייחודי ללמוד פיתוח שליה עוברי לעומת החלטת גורל תא חוץ עוברית במבחנה. משלב הבלסטוציסט ואילך, מחסום אפיגנטיים מובחן המורכב שינויים מתילציה דנ"א היסטון בחוזקה מפריד הוא שושלות. כאן אנו מתארים פרוטוקול להתגבר על זה המכשול השושלת באופן מלא על ידי חולף ביטוי יתר של רגולטורים מרכזיים trophoblast Tfap2c, Gata3, Eomes ו Ets2 ב פיברובלסטים עובריים בעכברים. תאי גזע trophoblast המושרה מסוגלים עצמי לחדש והם כמעט זהים הבלסטוציסט תא גזע trophoblast נגזר iבמונחי n של מורפולוגיה, ביטוי גנים סמנו דפוס מתילציה. תפקודי במבחנת מבחני vivo לאשר כי התאים האלה מסוגלים להבחין לאורך שושלת trophoblast יוצרת תאים ענקים trophoblast polyploid ו chimerizing השליה כאשר מזריקה blastocysts. האינדוקציה של תאי גזע trophoblast מרקמות סומטיים פותחת אפיקים חדשים ללמוד את מאפיינים גנטיים אפיגנטיים של שושלת חוץ עוברית זה, ומציעה את האפשרות ליצור שורות תאי גזע trophoblast מבלי להרוס את העובר בהתאמה.
Introduction
לאחרונה, במחקר שהשווה כמה גישות של תאי גזע עוברי בעכבר כדי Trophoblast המר גזע תאים גילה כי בכל המערכות המנותחות, מרת שושלת נשארת שלמה. במקום תאי גזע trophoblast המושרה (iTSCs) שנקראים גזע trophoblast תאים דמויי תאים נוצרו שמירה על זיכרון של תא גורל ממוצא 1. כאן פעלנו ע"פ גישה שונה של דור iTSC. בדומה האינדוקציה הישירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מ פיברובלסטים עובריים בעכברים (MEFs) 2, iTSCs הומר ישירות מרקמת סומטיים מובחנת. ראשית, זיהינו 12 גורמי מועמד התרמת גורל TSC כאשר ביתר MEFs. בהמשך, הגורמים Tfap2c, Gata3, Eomes ו Ets2 זוהו להיות הכרחי ומספיק אינדוקציה iTSC 3. במקביל, קבוצה נוספת באופן עצמאי מצאו Tfap2c, Gata3 ו Eomes להיות בהן כדי להפוך את MEFs לתוך iTSCs. עם זאת, באותהמחקר, הזמן הנדרש ביטוי transgene מושווה הרבה יותר זמן במחקר שלנו, המציין קינטיקה מרה שונה, כאשר Ets2 תיאור מקוקטייל transdifferentiation 4.
בסרום שור עובר קונבנציונלי (FBS) המכיל תרבות של מושרה בתאי גזע trophoblast נגזר הבלסטוציסט מסתמך על הנוכחות של גורמים המופרשים MEFs מומת צמיחה 5,6. במהלך אינדוקצית iTSC, הגורמים הללו ניתנים על ידי MEFs, אשר חסרים את השילוב המלא של transgenes ואינם עובר transdifferentiation. עם זאת, ברגע הפרט מושבות iTSC הם תת תרבות, הם דורשים מדיה, אשר כבר preconditioned ידי MEFs צמיחה מומת. משם ואילך, iTSCs יכול להיות מתורבת ומטופל כמו TSCs הבלסטוציסט נגזר על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. מן הראוי לציין כי, בניגוד טנקה et al. 5, אנו שגרתי תרבות TSCs ו iTSCs ללא gelatinizing מנות תרבית תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי העכבר נערכו על פי החוק הגרמני של הגנה על בעלי חיים וזאת בהסכמה ובאישור ועדות הטיפול המקומיות מוסדיים בעלי החיים (Landesamt fuer נאטור, Umwelt und Verbraucherschutz, נורדריין וסטפליה [המספר מזהה אישור: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. הכנת Media
- כן בינוני 293T: בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) FBS, L- גלוטמין (2 מ"מ), פירובט נתרן (1 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין (1x).
- הכן בינוני MEF: DMEM, 10% (v / v) FBS, L- גלוטמין (2 מ"מ), חומצות אמינו לא חיוניות 1x, פניצילין / סטרפטומיצין (1x).
- הכן בינוני TS (w / o FGF4 / הפרין): בינוני מכון ממוריאל פארק Roswell (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (גזע כיתה תרבית תאים), פניצילין / סטרפטומיצין (1x), L- גלוטמין (2 מ"מ פירובט), נתרן (1 מ"מ), 2-mercaptoethanol (0.1 מ"מ).
- הכן בינוני TS עם FGF4 / הפרין (F4H TS +): RPMI 1640, 20% (v / v) FBS (תא גזעתרבות כיתה), פניצילין / סטרפטומיצין (1x), L- גלוטמין (2 מ"מ), פירובט נתרן (1 מ"מ), 2-mercaptoethanol (0.1 מ"מ), 25 ng / ml FGF4, 1 מיקרוגרם / מ"ל הפרין.
הערה: FGF4 ו הפרין מתווספים ישירות לתוך התקשורת מיד לפני השימוש. - הכן TS-CM עם FGF4 / הפרין (TS-CM + F4H): 70% ממוזג MEF הפרין TS בינוני + 30% מוכן טרי TS בינוני + 25 ng / ml FGF4, 1 מיקרוגרם / מ"ל.
הערה: FGF4 ו הפרין מתווספים ישירות לתוך התקשורת מיד לפני השימוש. - הכן בינוני Transfection: מתקדם DMEM, 2% (v / v) FBS (גזע כיתה תרבית תאים), L- גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין (1x).
- כן בינוני-ייצור וירוס: המתקדם DMEM, 5% (v / v) FBS (גזע כיתת תרבית תאים), L- גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין (1x).
2. Murine עובריים פיברובלסטים גזירה
- הזדווגויות סט מתוזמן באמצעות WT 129S2SV נשים וגבר הומוזיגוטים עכברים R26 :: rtTA (שם זן; B6.Cg-GT (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). על עכברי קרב E13.5 ידי נקע בצוואר רחם ולבודד פיברובלסטים עובריים בעכברים עיקריים (MEFs) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8. לאחר מכן, תאי צלחת מעובר אחד על צלחת 150 מ"מ תקשורת MEF.
- לאחר תרבויות MEF העיקרית להגיע confluency על 150 מנות מ"מ, לשטוף תאים פעמיים עם 10 מ"ל PBS ולהוסיף 4 מ"ל 0.05% טריפסין / פתרון EDTA. דגירת מנות עבור 3 - 4 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר דגירה לבדוק אם התאים מנותקים מצלחת באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (באמצעות עדשה 10X). הוסף 5 מ"ל של התקשורת MEF להפסיק trypsinization ולאסוף ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
- השעית תא ברכה מכמה מנות ולאסוף לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. תא צנטריפוגה ההשעיה 3 דקות ב 200 XG ו -10 מעלות צלזיוס.
- בטל התא גלולה supernatant ו resuspend ב FBS המכיל 10% (v / v) sulfoxide דימתיל. להקפיא MEFs ב aliquots לשימוש נוסף.
הערה: לחילופין, להשתמש typ פראידואר העיקרי MEFs; עם זאת, וקטור lentiviral נוספים להביע rtTA צריך להיות transduced יחד עם וקטורים lentiviral אחרים (למשל באמצעות פלסמיד FUdeltaGW-rtTA שתיאר Maherali et al. 9). - הכנת בינוני TS ממוזג MEF
הערה: לפני ניסויים מרים, MEF הממוזג (CM) TS תקשורת כדי להיות מוכנה, אשר נדרשה עבור תת קווי iTSC פרט (בסעיף 6).- פלייט 1 x 10 7 MEFs מומת mitotically לכל צלחת 150 מ"מ במדיום MEF על המספר הרצוי של מנות. להשבית MEFs ידי-קרינה γ עם מינון של 9 Gy.
הערה: התשואה לכל צלחת 150 מ"מ הוא כ 60 מ"ל של CM. - יום לאחר ציפוי, לשאוב וזורקים בינוני MEF ולהוסיף 20 מ"ל מוכן טרי בינוני TS (ללא FGF4 / הפרין) על כל מנה של mitotically מומת MEFs ומנות המקום בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר דוגריםTS בינוני במשך שלושה ימים על MEFs mitotically המומת, לאסוף בינוני 50 מ"ל צינורות חרוטים. סנן בינוני דרך פילטר 0.2 מיקרומטר והמשך עם 2.6.4. החלף CM עם 20 מ"ל של מדיום TS טריים להכנת אצווה נוספת של CM.
הערה: MEFs מומת Mitotically יכול לשמש להכנת CM עד שלוש פעמים. - Aliquot 35 מ"ל של CM מסונן לתוך צינורות 50 מ"ל ולאחסן חרוטי ב -20 ° C עד הצורך. לאחר ההפשרה, להוסיף 15 מ"ל של מדיום מוכן טרי TS על מנת לקבל 70% TS-CM ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
- פלייט 1 x 10 7 MEFs מומת mitotically לכל צלחת 150 מ"מ במדיום MEF על המספר הרצוי של מנות. להשבית MEFs ידי-קרינה γ עם מינון של 9 Gy.
3. הפקת וקטור Lentiviral בתאי 293T
הערה: כל השלבים מבוצעים בחלל המעבדה מורשה בטיחות ביולוגית רמה 2.
- לפני ניסויים מרים, להכין וקטורי lentiviral עבור דוקסיציקלין (DOX) תלויים יתר הביטוי של Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 ו mCherry. עבור כל lentivirus, שיתוף transfect תאים 293T באמצעותוקטור העברת בהתאמה lentiviral יחד עם הפלסמיד אריזת פלסמיד מעטפה להביע VSV-G (לפרטי פלסמיד עיינו בטבלת החומרים).
הערה: לקבלת מידע מועיל לגבי ייצור וירוס עיין Gavrilescu ואח 10.. למרות שזה מתאר ייצור רטרו-וירוס, הערות כלליות לגבי איכות תאי 293T ו- DNA פלסמיד מתקיימות לייצור lentivirus גם כן.
זהירות: אמצעי בטיחות מתאימים צריכים להילקח, כשעובדים עם וקטורים lentiviral ואת העבודה צריכה להתבצע במתקן בטיחות ביולוגית רמה 2. - מעיל חמישה 100 מנות מ"מ עם פולי- L- ליזין (100 מיקרוגרם / מ"ל) פתרון על ידי כיסה את המנות עם 5 מ"ל של תמיסת בעדינות נדנדה להפיץ פתרון הציפוי באופן שווה. מניחים את הכלים בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות פתרון ציפוי לשאוב ולשטוף מנות פעם עם PBS.
- פלייט 7 x 10 6 293T תאים לכל צלחת ב 10 מ"ל התקשורת 293T תאים, sמנות wirl להפיץ תאים ומקום מנות שווה בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס.
- למחרת בבוקר, להחליף מדיום הגידול עם 5 מ"ל של מדיום transfection. הוסף 6 μl של המניה 1,000x של פתרון chloroquine (25 מ"מ) ומנות המקום בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס.
- בינתיים מכינים תערובת transfection:
- עבור כל וקטור lentiviral להכין שני צינורות תגובה 5 מיליליטר, שכותרתו A ו- B.
- להוסיף 600 μl של 2x HEPES שנאגרו מלוחים (HBS) כדי צינור א
- בשנת צינור B תערובת 61.5 פתרון μl 2 CaCl (2 מ '), עם 18.5 מיקרוגרם lentivector דנ"א 9.25 מיקרוגרם psPAX2 ו 9.25 מיקרוגרם של pMD2.G. כיוון עוצמת 600 μl עם H תרבות כיתה סטרילי 2 O.
- הוסף פתרון ממבחנה B נפתח חכם לצינור בעוד vortexing. דגירת תערובת transfection במשך 15 דקות ב RT.
- מוסיפים את תערובת transfection מאוד בזהירות טיפה חכם התאים 293T מוכן על צלחת 100 מ"מ. אחרי 5 עד 6 שעות להסיר בינוני ולהחליף עם 10 מ"ל של מדיום וירוס הייצור. מניחים מנות בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: היזהר בעת ההסרה וההחלפה בינונית מאז תאי 293T לנתק בקלות מהצלחת. שנה בינונית 5-6 שעות לאחר transfection חיונית, שכן חשיפה ממושכת chloroquine הוא רעיל לתאים. - למחרת בבוקר, בזהירות להסיר ולסלק בינוני ולהחליף עם 7 מ"ל של מדיום וירוס הייצור.
- למחרת בבוקר למסוק את המנה הראשונה של מדיום המכיל וירוס. לשאוב בינוני ולאסוף צינור חרוטי 15 מ"ל. שוב, להוסיף 7 מ"ל של מדיום-ייצור וירוס על גבי תאים. חנות וירוס המכיל בינוני במקרר עד המנה השנייה היא שנקטפה ביום שלמחרת.
- למחרת בבוקר לשאוב את המנה השנייה של מדיום המכיל וירוס הוספתו 15 מיליליטר צינור חרוטים המכיל את המנה הראשונה. תאי 293T יכולים להיות מושלכים עכשיו. מסנן וירוסים המכיל בינוני באמצעות sur 0.45 מיקרומטרfactant ללא אצטט תאית המסנן -membrane. Aliquot מסונן, וירוס המכיל בינוני ולאחסן ב -80 ° C לשימוש נוסף.
הערה: ייצור וירוס יכול גם להתבצע במנות 6 באר. להקטין כרכים ומספרי טלפונים בהתאם.
4. פיברובלסטים התמרה עם 4 גורמים וקטור בקרת mCherry
הערה: כל השלבים מבוצעים מתקן 2 רמת בטיחות ביולוגית.
- לקבלת ייצוג סכמטי של מתווה הניסוי לעיין ב איור 1. להפשיר aliquot אחד rtTA-MEFs העיקרי צלחת 3.33 x 10 5 תאים לכל גם צלחת 6-היטב בהיקף כולל של 2 מ"ל של התקשורת MEF. הכן לפחות 3 בארות ומדביקים תוויות עם 4 גורמים (4F), mCherry ושליטה.
הערה: לחילופין, MEFs סוג בר ניתן להשתמש, כאשר וקטור lentiviral להביע rtTA מתווסף קוקטייל lentivector במהלך שלב 4.2. - למחרת אחרי תאים התאושש לחלוטין מן cryopreservation, להחליף מדיה MEF בשלושת 6-בארות עם 0.6 מ"ל (4F), 0.9 מ"ל (mCherry) ו 1 מ"ל (שליטה) של התקשורת התמרה, בהתאמה. להפשיר aliquot אחד PLV-TETO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -Ets ווירוסים -mCherry ב RT ולהוסיף 100 μl של כל supernatant המכיל וירוס (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) לתוך 4F היטב.
הערה: במקרה של MEFs סוג בר, להקטין את היקף התקשורת preplated ידי 100 μl ובנוסף להוסיף 100 μl של הנגיף FUdeltaGW-rtTA המכיל supernatant לתערובת 4F. - הוספת 100 μl של תקשורת וירוס המכיל mCherry אל שכותרתו היטב עם mCherry. להוסיף polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל לבאר כל אחד. מניחים את צלחת בחזרה לתוך החממה ב 37 ° C ו דגירה MEFs O / N עם supernatant המכיל וירוס.
הערה: במקרה של MEFs סוג בר, להקטין את היקף התקשורת preplated ידי 100 μl ובנוסף להוסיף 100 μl של supernatant המכיל וירוס FUdeltaGW-rtTA. - למחרת בבוקר, להסיר בזהירותוירוס המכילים התקשורת לשטוף שלוש פעמים עם 2 מ"ל של PBS. לבסוף, להוסיף 2 מ"ל של התקשורת TS (ללא FGF4 / הפרין).
הערה: transduced MEFs יכולים לשמש ישירות לניסויים אינדוקציה iTSC או קפוא לשימוש נוסף.
5. פיברובלסטים מרת iTSC
הערה: כל השלבים מבוצעים בחלל המעבדה מורשה בטיחות ביולוגית רמה 2.
- לשטוף MEFs transduced פעמיים עם 2 מ"ל PBS ואחרי הוספת פתרון 0.5 מ"ל טריפסין / EDTA דגירה אותם בחממה במשך 3 - 4 דקות. בדוק תחת מיקרוסקופ הפוכה להיפרדות תקינה של התאים.
- להשבית טריפסין על ידי הוספת בינוני 1 מ"ל TS. מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל במשך 3 דקות ב 200 x ז. בטל supernatant ו resuspend התאים במדיום 2 מ"ל TS. השתמש המדגם מלא untransduced לספור את התאים.
- פלייט 4F-MEFs, mCherry-MEFs ו MEFs המלא untransduced כל בצפיפות של 2 x 10 5תאים לכל צלחת תרבית תאים 100 מ"מ ב 10 מ"ל TS בינוני המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל DOX (בינוני TS + FGF4 / הפרין + DOX).
- לחלופין, לבצע transdifferentiation על מנות קטנות. פלייט 3.6 x 10 3 תאים לס"מ 2 על גודל המנה הרצויה, נפח בקנה מידה בהתאם.
- למחרת, באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence (באמצעות עדשת 10X ומסנן מתאים עירור קרינה אדום) לפקח ביטוי של חלבון mCherry על מנת להעריך את היעילות התמר.
הערה: תמרת יעילות צריכה להיות קרובה ל -100%. אם מוות של תאים מוגברת ניכרת לאחר אינדוקציה transgene זה אומר כייל הנגיף היה גבוה מדי. תמרה יש לחזור עם כמות מופחתת של מדיום המכיל וירוס. - מעתה לשנות את פני התקשורת על כל מנות פעם ביומיים עד יום 10 לאחר ציפוי. לאחר מכן, להאכיל תאים עם המדיום TS ללא DOX (בינוני TS + FGF4 / הפרין).
- שימוש בצג מיקרוסקופ הפוך עבורהמראה של 'אזורים transdifferentiated' (עיין תרשים 2B ו- C) על צלחת 4F עד 3 שבועות. מושבות כאלה לא צריכות להיות גלויות על שתי מנות השליטה (mCherry-MEFs ו MEFs untransduced).
בידוד 6. קווי פרט iTSC
הערה: צעד 6.3 במנדף בתרבית רקמה אינו נדרש. מומלץ לנגב את מיקרוסקופ הפוכה עם 70% אתנול כדי למזער את הסיכוי של זיהום חיידקי. מושבות iTSC פרט ניתן לבודד בין ימים 21 ו -28 ימים של transdifferentiation.
- הוסף 40 μl של פתרון 0.05% טריפסין / EDTA לתוך 12 בארות של צלחת גם 96 U-התחתונה ומניחים את התבנית על הקרח.
- לפני בידוד המושבה, בינוני לשאוב על צלחת transdifferentiation 4F-MEF. שטפו תאים פעם עם 10 מ"ל PBS. שוב, להוסיף 10 מ"ל PBS ו צלחת מקום תחת מיקרוסקופ הפוכה.
- בעזרת פיפטה 100 μl מוגדרים 40 μl מתרומם מושבות בודדות, על ידי גircling אותם עם קצה פיפטה aspirating המושבה צפה. העברת תאים של המושבה אחת כל לתוך אחד טוב של המנה 96-מוכן היטב. לאחר קטיף 12 מושבות מניחות צלחת 96-היטב בחממה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לנתק את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה עבור מספר פעמים ההשעיה תא העברה לתוך אחד טוב של צלחת 24 גם עם 500 μl מוכן של מדיום TS-CM (30% TS טרי בינוני + 70% CM + FGF4 / הפרין).
- למחרת להחליף בינוני עם בינוני TS-CM טרי כדי להסיר תאים מתים. שנה בינונית בכל יום אחר.
- צג מראה של מושבות אפיתל עם גבולות בהירים (ראה איור 2). לאחר מושבות להופיע, תרבות עד 70% ומחוברות או עד שבוע ובהדרגה להרחיב על מנות גדולות יותר. מעתה ואילך, התרבות תאים כמו בתום לב TSCs, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים בתקשורת בסרום המכיל או סרום ללא מדיה, מוגדר 3,5,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על הצלחת שבו ביטוי transgene של 4F מופעל, תאים לשנות מורפולוגיה במהירות (השווה איור 2 א 'וב'). בסביבות יום 14 - 21 אזורים transdifferentiated ברורים לצוץ (שתי דוגמאות ניתנות באיור 2B ו- C). מושבות העיקריות אלה חסרי מורפולוגיה TSC טיפוסית; אולם ברגע שהם תת תרבות, מורפולוגיה אפיתל מאפיין עם קצוות הדוקים וגבולות בהירים מאוד מזכירים TSCs בתום לב עולה (איור 2 ד). 4F-iTSCs כתם חיובי עבור שעתוק trophoblast גורמי Cdx2 ו Tfap2c (2E איור). קווי iTSC אלה יכולים לשמש כעת עוקבים במבחנה או in vivo מנתח, כלומר, מבחני בידול במבחנה או ניסויי chimerization שליה.
באיור 1. ציר הזמן של MEF כדי iTSC המרה. ייצוג גרפי של transdifferentiation של MEFs לתוך iTSCs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. שינויי נציג במורפולוגיה במהלך MEF מרת iTSC.
(א) Photomicrograph של rtTA-MEFs. (ב) Photomicrograph של 4F-MEFs transdifferentiated. דוגמא של אזור transdifferentiated, מסומנת באדום. (C) דוגמא 2 של מושבה transdifferentiated ביום 21 של transdifferentiation לאחר אינדוקציה עשרה ימים DOX ב 4F-MEFs. פינה מתאימה-culturing תת מסומנת באדום. (ד) Photomicrograph של 4F-iTSCs לאחר culturing המשנה. כל ברי הסולם עולים 100 מיקרומטר. תמונות היו tAken על מיקרוסקופ הפוכה להשתמש בניגודיות 10X עדשה ושלב. (E) מכתים Immunofluorescence נגד שעתוק גורמי Cdx2 ו Tfap2c ב 4F-iTSCs. גרעיני מגואלות Hoechst. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גורם 4 (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) פרוטוקול transdifferentiation המבוסס שהוצג כאן מציע שיטה אמינה לייצר המרת בנאמנות iTSCs מ פיברובלסטים עובריים בעכבר. יתר על כן, השיטה היא גם ישימה עבור פיברובלסטים זנב שלאחר לידה, אם כי עם ירידה יעילה לעומת פיברובלסטים עובריים 3. באופן כללי, איכות פיברובלסטים העיקרי היא גורם קריטי של תוצאת transdifferentiation וטיפול יש לנקוט כדי להשתמש בתאים מעבר מוקדם (מעבר שני כדי שלוש).
כוחו של פרוטוקול זה הוא השימוש וקטורים מושרה דוקסיציקלין, המאפשרים שליטה זמנית של ביטוי transgene. זו מאפשרת את הדור של קווי iTSC יציבים להפעיל את הרשת גורם שעתוק אנדוגני, שמירת TSC גורל עצמאי ביטוי transgene. זאת בניגוד לפרוטוקולים שפורסמו בעבר, המתארת את האינדוקציה של גורל TSC מתאי גזע עובריים, tha שיטהt עד כה מניב רק באופן חלקי גזע trophoblast לתכנות מחדש דמויי תאים תאים 1.
עם זאת, מגבלה ידועה של הפרוטוקול המתואר כאן הוא המספר המשתנה של מושבות transdifferentiated המתעוררים, ולכן קשה לחזות את יעילות transdifferentiation. מגבלות אלה הן בשל גורמים משתנים כמה מן המעלה הראשונה, הם קריטיים עבור תוצאת transdifferentiation: יעילות התמרה של וקטורי lentiviral היחידים, בסך של התפשטות אוכלוסיית התא מתחילה, ואת הסכום של מוות של תאים במהלך transdifferentiation. תחת נסיבות מסוימות transdifferentiated מושבות iTSC להיכשל לצוץ. במקרה זה התקשורת ריאגנטים צריך להיבדק על יכולתם לתמוך בתרבות TSC אמיתי, לפני השימוש בהם בדור iTSC. בנוסף, התמר עם 4F ניתן טיטרציה, מאז כמויות גבוהות מדי של עופרת ביטוי transgene למות תא. באופן כללי, תת-culturing של l iTSC הפרטאינס דורש קצת תרגול. במקרה קשיים עם תת-תרבות של iTSCs להתרחש (כלומר., תאים תת תרבות אינם שומרים התחדשות עצמית במקום ספונטני להבדיל), מושבות מבודדות אחת יכולות להיות מצופות לחלופין על מאכלים עם צפיפות תאי 50% מזין הצמיחה מומת תאים לתמוך בצמיחה מצורפת של תאים. קווי iTSC ניתן אז נגמלו בהדרגה ניזונים במהלך passaging שלאחר מכן. מן הראוי לציין כי אנחנו לא מצליחים MEFs המרת ישירות לתוך iTSCs באמצעות תנאים בינוני TX מוגדר, מאז בינוני TX רק תומך הוקמה קווי iTSC / TSC.
עד כה, הפרוטוקול לזירוז iTSC מ פיברובלסטים מוקם רק בתאים בעכברים. לפיכך, עכשיו יהיה עניין רב להתאים את הפרוטוקול למינים אחרים ולאפשר גזירה של קווי iTSC ממערכות מודל אנושיים או אחרות. יתר על כן, ניתוח של המנגנון המדויק של פיברובלסטים המרה iTSC יציע תובנות חדשות על הטבעשל סומטיים מול מחסום שושלת חוץ עוברי וסיוע בהבנת עקרונות קביעת גורל תא במהלך התפתחות נורמלית ופתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
