Reconstituição do Basic mitótico Fusos no esféricas Emulsão Gotas

Summary

A montagem e o posicionamento do fuso mitótico dependem das forças combinadas geradas pela dinâmica dos microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes. Aqui apresentamos nossos métodos recentemente desenvolvidos nos quais o confinamento geométrico de gotículas de emulsão esférica é usado para a reconstituição de baixo para cima de fusos mitóticos básicos.

Abstract

A montagem, posicionamento e orientação do fuso mitótico dependem das forças combinadas geradas pela dinâmica dos microtúbulos, proteínas motoras dos microtúbulos e reticulantes. Os microtúbulos em crescimento podem gerar forças de empurrão, enquanto os microtúbulos despolimerizados podem converter a energia do encolhimento dos microtúbulos em forças de tração, quando ligados, por exemplo, à dineína cortical ou aos cromossomos. Além disso, proteínas motoras e reticuladores difusíveis dentro do fuso contribuem para a arquitetura do fuso conectando e deslizando microtúbulos antiparalelos. In vivo, tem se mostrado difícil desvendar a contribuição relativa de jogadores individuais para o equilíbrio geral de forças. Aqui apresentamos os métodos que desenvolvemos recentemente em nossos esforços para reconstituir fusos mitóticos básicos de baixo para cima in vitro. Usando técnicas microfluídicas, os centrossomas e a tubulina são encapsulados em gotículas de emulsão de água em óleo, levando à formação de ásteres de microtúbulos geometricamente confinados (duplos). Ao introduzir adicionalmente dineína ancorada corticalmente, motores de microtúbulos direcionados de ponta a ponta e reticuladores difusíveis, este sistema é usado para reconstituir estruturas semelhantes a fusos. Os métodos aqui apresentados fornecem um ponto de partida para a reconstituição de fusos mitóticos mais completos, permitindo um estudo detalhado da contribuição de cada componente individual e para obter uma visão quantitativa integrada do equilíbrio de força dentro do fuso mitótico.

Introduction

Durante a mitose, os cromossomos do genoma replicado são organizados no equador célula para assegurar a igualdade de distribuição de cromatídeos irmãos sobre as células filhas recém-formados. posicionamento cromossomo e segregação é mediada pela sua adesão aos microtúbulos do fuso originários de dois centrossomas opostas. Além de garantir a distribuição cromossoma fiel, a orientação do fuso mitótico também determina do plano de divisão celular ^1. Orientação coordenada de divisão celular é essencial durante muitos estágios de desenvolvimento e para a homeostase do tecido ^2. Especificamente, regulado o posicionamento do fuso mitótico pode resultar numa distribuição assimétrica dos conteúdos celulares ou mesmo produzir células filhas de diferentes tamanhos ^2. Montagem de fuso mitótico e orientação começa na prófase e é orquestrado por uma complexa interação entre cooperação e antagonizar força-geradores ^3,4. As forças geradas consistem em bpuxar e empurrar as forças OTH. Estas forças são originários a partir de ambos os contactos de fuso com o córtex celular, bem como a partir de dentro do fuso, e pode ser gerado por dinâmica dos microtúbulos, bem como por motores moleculares e agentes de reticulação (Figura 1).

forças que empurram pode ser gerado quando microtúbulos crescer contra estruturas rígidas, tais como o córtex célula. Dependendo da força de resistência total gerada dentro do sistema, isso pode resultar em reposicionamento do fuso mitótico (forças inferiores) ou desencadear encurvadura microtúbulos ou catástrofe (forças elevadas) ^5-8. A quantidade de força que pode ser gerada por empurrando depende do comprimento do microtúbulo, uma vez que o comprimento é um determinante forte do microtúbulo-flambagem ^9. Além disso, os microtúbulos que se originam a partir de um centrossoma podem empurrar contra a outra centrossoma, um mecanismo que tem sido sugerido para conduzir a separação do centrossoma no início de profase ^3,10.

Em anúnciocondição para empurrar as forças geradas por microtúbulos crescimento, microtúbulos termina contactar o córtex celular também pode mediar puxando forças ^11. Estudos de vários laboratórios tem mostrado que a actividade controlada de geradores de força corticais é necessário para o posicionamento assimétrico de fusos mitóticos in vivo ^1. Essencial para essas forças que puxam é dineína localizada-cortex citoplasmática (doravante referida como "dineína '), um sinal de menos-end microtúbulos dirigido proteína motora ^8,12,13. Por exemplo, na levedura de brotamento, interacções laterais de dineína cortical com o resultado da estrutura de microtúbulos em microtúbulos dependente do motor de deslizamento ao longo do córtex ^14. No entanto, as forças de tracção corticais também pode ser gerado pela capacidade de dineína para formar ligações de extremidade-para despolimerizar os microtúbulos ^8. A energia gerada pelo encolhimento dos microtúbulos podem conduzir a forças que são, geralmente, uma ordem de magnitude maior (~ 50 pN (Referência ¹⁵ )) do que as forças geradas pelo motor proteínas individuais (~ 7-8 pN (ref. ^16)). Apego End-on de dineína cortical aos microtúbulos despolimerização promove o posicionamento do fuso em brotamento levedura ¹⁷ e C. elegans ^13. Se corticais forças de tracção impulsionado deslizante dependentes de motor e microtúbulos despolimerização podem cooperar ou são mutuamente exclusivas in vivo é actualmente desconhecido.

Além das forças que empurram microtúbulos e forças de tracção corticais mediada por dineína, centrossoma posicionamento é controlado a partir de dentro do fuso mitótico por numerosas outras proteínas. Cinesina-5 motores, por exemplo, existir como tetrâmeros que podem reticular os microtúbulos interpolares antiparalelas, resultando na geração de forças para o exterior de deslizamento ^18-20. Os membros da família motora cinesina-5 são necessárias para a separação do centrossoma e montagem do fuso bipolar em todos os eucariotas estudados, com a excepção de C. elegans (revisto em referência ^21).

Além disso, difusíveis reticulantes da família / PRC1 Ase1 também são conhecidos para localizar regiões de sobreposição dos microtúbulos de microtúbulos interpolares in vivo e in vitro ^22-27. As forças geradas pela expansão Ase1-driven do microtubule-região de sobreposição são grandes o suficiente para contrabalançar kinesin-14 forças de correr mediadas in vitro ^28,29. Em células, Ase1 / PRC1 é necessário para a formação estável de sobreposição de regiões de microtúbulos no fuso midzone ^25-27,30, sugerindo que as forças geradas pela reticuladores difusíveis pode contribuir significativamente para a organização do fuso. Finalmente, as forças da cromatina mitótico e cinetócoros influenciar a formação do fuso mitótico e posicionamento através de várias vias ^3. Uma vez que estes componentes não fazem parte dos ensaios de reconstituição descritos aqui, eles não serão discutidos em detalhe.

jove_content "> Existem diferentes teorias sobre como os diferentes componentes moleculares e as forças descritas acima cooperar na montagem do fuso e posicionamento, mas ainda estamos muito longe de um entendimento quantitativo. Além de experimentos em células vivas, in vitro experimentos com componentes purificados fornecer uma poderosa rota para ajudar a atingir este objectivo. Aqui é apresentado um guia visual para uma versão adaptada e estendida dos métodos publicados recentemente (Roth et al., ^31), em que fusos básicos são reconstituídos em água-em-óleo de gotículas de emulsão, começando com um número mínimo de componentes. Utilizando técnicas de microfluidos, gotas esféricas são gerados com tamanhos que são comparáveis ​​aos das células mitóticas. dentro destas gotículas, centrossomas purificadas e tubulina podem ser combinados a fim de estudar a dinâmica do áster de microtúbulos, forçar as interacções de geração e áster-áster. por introduzindo corticais (tais como dineína) e inter-polares (tais como cinesina-5 / Ase1) força-geradores, nósreconstituir estruturas fusiformes cada vez mais complexos que começam a assemelhar-se a situação in vivo.

Protocol

1. Preparação de chips microfluídica

NOTA: Para o estudo ascendente de montagem do fuso, gotículas de emulsão de água em óleo esféricos são usados. Estes são microgotículas aquosa foi separada a partir da fase de óleo circundante por uma monocamada de fosfolípidos e surfactante. Estas gotículas de emulsão são produzidos dentro de microfluidos de polidimetilsiloxano (PDMS) fichas. Alterações em geometrias de canal e as taxas de fluxo pode ser usado para sintonizar o tamanho de gotícula. Na concepção de microfluidos descrito aqui, as gotas são gerados com um diâmetro de cerca de 15 um para imitar o confinamento geométrica de uma célula de mamífero mitótico.

1. Photomask Projeto e fabricação de moldes
   1. Projetar um photomask contendo três canais de entrada ^31. Uma entrada do canal conecta-se a fase aquosa, que contém os conteúdos das gotículas (ver secção 3 "Reconstituir ásteres básicos microtúbulos"). canal de entrada 2 conecta-se à fase de óleo (ver secção 2.1 "Lipid / oil-phaSE preparação "). Use canal de entrada 3 para diluir a emulsão de goticulas com / óleo-fase lipídica antes da observação adicional (opcional) (Figura 2a-b).
      NOTA: Todos os canais de entrada de ar é seguida por um filtro de poeiras (de um labirinto de 2 uM canais) para a poeira armadilha, partículas e agregados (PDMS em proteínas) e para impedi-los de bloqueio dos canais de microfluidos (Figura 2d). Os canais são 75 m de largura e o lípido se encontre / óleo de fase e de fase de água a 12,5 m de largura junção onde gotículas de emulsão irá formar (Figura 2c).
   2. Ordem e obter máscaras impressos em um substrato de filme, com uma polaridade negativa (o photomask será escuro com estruturas concebidas transparentes).
2. fabricação de moldes
   1. Fabricar moldes por spin-coating SU-8 3025 fotorresistência sobre uma bolacha de silício de 4 polegadas usando um spin-coater (500 rpm, 10 s, seguido de 1800 rpm, 45 s) em um ambiente de sala limpa.
   2. Expor o SU-8 revestidobolacha de silício através da foto-mascara. Desenvolver bolachas de acordo com as instruções do fabricante para criar canais de ~ 40 um de espessura.
3. Fazendo um chip microfluídico
   1. Misturar 10 partes de pré-polímero de PDMS com um agente de cura parcial (total ~ 40 g) num vaso de barco semelhante usando uma espátula de plástico. PDMS lugar contendo embarcação do barco, como em uma câmara de vácuo para ~ 30 min. para remover as bolhas de ar. Enrole a folha de alumínio em torno do molde para formar um copo com ~ 1 cm bordos virados para cima.
   2. Verter o PDMS (~ 75% do volume total) para dentro do molde, deixar em uma câmara de vácuo para um outro ~ 30 min. (Para remover as bolhas de ar) e curar durante 1 hora a 100 ° C num forno.
   3. Spin-revestir os restantes PDMS em lâminas de vidro (5 seg a 200 rpm seguida de 30 segundos a 4000 rpm), seguida por cura durante 1 hora a 100 ° C. Remova a poeira de lâminas de vidro que utilizam ar comprimido / N ₂ -flow, pré-limpeza não é necessário.
      Nota: O PDMS revestido lâminas de vidro pode ser usado tanto para micchip de rofluidic e produção de células de fluxo (ver também 2.2).
   4. Gentilmente tira os PDMS fora do molde utilizando uma lâmina de barbear e furos (0,5 mm para enseadas, 0,75 mm para saída) .Corona-tratar o chip microfluídico e uma lâmina de vidro PDMS revestido usando um tratador superfície laboratório corona por alguns segundos .
   5. Colocar o chip de microfluidos para a lâmina de vidro (canais voltados para baixo) e cozer os chips de O / N a 100 ° C (Figura 3a). Armazenar chips microfluídicos durante vários meses em um ambiente livre de poeira.

2. Setup Microfluidic

NOTA: água-em-óleo de gotículas de emulsão são geradas utilizando uma configuração de microfluidos e os chips de microfluidos descritos acima. A composição da / óleo-fase lipídica pode ser variada dependendo dos requisitos experimentais. lípidos solubilizados em óleo irá formar uma monocamada na interface óleo-água com a cabeça grupos polares virada para a água no interior. A fim de orientar proteínas(Por exemplo dineína) para o limite das gotículas, baixas quantidades de biotinil-fosfatidiletanolamina (PE-biotinil) lípidos podem ser adicionados. Isso permite que o recrutamento de dineína biotinilado (ver secção 4.1 "Dineína direcionamento para o córtex gota"), através de multimerização mediada por estreptavidina. Gotas são estabilizadas por adição de um agente tensioactivo e armazenado em células de fluxo revestidas com PDMS.

1. Lipid / óleo em fase de preparação
   1. Misture Dissolveu-clorofórmio dioleoyl- 1,2-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (DOPS) e lípidos biotinil-PE em uma proporção de 4: 1 molar de um tubo de vidro usando pipetas de vidro (enxaguar exaustivamente com clorofórmio antes pipetas usar). Preparar um total de ~ 250 ug lípidos, resultando numa concentração lipídica de ~ 0,5 mg / ml.
   2. Secar cuidadosamente a mistura de lípidos com N ₂ -flow e, subsequentemente, numa câmara de vácuo durante ~ 1 h. Dissolve-se os lípidos secos em óleo mineral e 2,5% de agente tensioactivo a 0,5 mg / ml (~ 500 ul de fazer).
   3. Colocar a amostra de lípido / óleo numabanho de ultra-som e sonicate durante 30 minutos. a 40 kHz para dissolver completamente os lípidos.
2. Preparação de células de Fluxo
   1. PDMS Spin-coat (ver também a secção 1.3) nos copos de cobertura (5 seg a 200 rpm seguida por 30 segundos a 4.000 rpm) e lâminas de vidro (5 seg a 100 rpm seguida por 30 seg 1.500 rpm), a fim de depositar a camada homogênea de PDMS.
      NOTA: Para obter a qualidade de imagem ideal, certifique-se de usar óculos de cobertura com uma espessura que corresponde a objetiva do microscópio. Neste caso: 1,5 (~ 0,17 milímetros).
   2. Curar os vidros de cobertura PDMS-revestidos e lâminas de vidro por 1 hora a 100 ° C num forno. Certifique-células de fluxo pelo espaçamento de perto (~ 2 mm) fatias finas de filme laboratório vedação (~ 3 mm de largura) sobre o vidro deslizamentos de PDMS-revestidos. Quando armazenado em um ambiente livre de poeira, os canais que não tenham sido utilizados podem ser utilizados em outros momentos.
   3. Assegurem o fluxo de células com uma lamela PDMS-revestido e selo por fusão do laboratório de vedação filme ~ 1 min. a 100 ° C, primagentilmente (Figura 3c). Feche o filme laboratório vedação -vidro-fronteiras com valap (Figura 3c). flow-células durante vários meses em um ambiente livre de poeira Store.
3. PDMS Preparação Cup
   1. Para geração de imagens de longo prazo, fazer uma xícara PDMS, perfurando um furo 4 mm de diâmetro em uma fatia de PDMS (~ 3 mm de espessura)
   2. Corona-tratar a fatia de PDMS e um vidro de cobertura com revestimento de PDMS e colocá-las em cima uns dos outros. Asse o copo de PDMS O / N (a 100 ° C) (Figura 5a).
4. A formação da emulsão de goticulas
   1. Monitorar a formação de gotículas em um microscópio de campo brilhante invertido. Ligue o controlador de pressão para o chip de microfluidos usando tubos de PEEK (diâmetro: 510 uM (exterior) e 125 uM (interior)) (Figura 3a). Preencha chips microfluídicos completamente com lípidos / óleo de fase de entrada 2.
   2. Apresente-fase à base de água-MRB80 (ver secção 3 "Reconstituir asters básicos de microtúbulos4;) entre a entrada 1. O controlo de gotículas de tamanho por alterações de pressão lípido / óleo de fase e de fase de água para criar gotas de ~ 15 um de diâmetro (Figura 3b).
      NOTA: Usando esta configuração, use ~ 800 mbar para o / oil-fase lipídica e ~ 200 mbar para a fase de água para criar gotículas do tamanho desejado.
   3. Depois de obter o tamanho desejado gota-e quantidade necessária (~ 10 ul por amostra), recolher gotas de canal de saída e de carga em célula de fluxo (encher a célula de fluxo completamente).
   4. Fechar as extremidades da célula de fluxo cuidadosamente usando valap (incompletamente-células de fluxo fechados pode resultar em grande movimento das gotículas, tornando-o difícil de imagem los). Além disso, evitar a formação de bolhas de ar o que resulta em movimento gota.
   5. Lavar os tubos PEEK extensivamente com isopropanol antes e após o uso para evitar a contaminação cruzada e entupimento amostra.

3. reconstituição Asters microtúbulos básicas

NOTA: O conteúdo das gotas pode ser variada, dependendo dos requisitos experimentais. Todos os tampões são MRB80-base (80 TUBOS mM, EGTA 1 mM, 4 mM de _MgCl2 (pH 6,8)), e todas as amostras são preparadas em gelo. Em geral, as gotas de conter sempre centrossomas, os componentes necessários para a polimerização dos microtúbulos, um sistema de limpador de oxigênio e agente de bloqueio (ver secção 3.1). força-geradores de microtúbulos e co-fatores necessários e segmentação-fatores podem ser incluídos se desejado (ver secções 4.1 e 4.2).

1. Configuração geral para a formação aster em gotículas de emulsão (Figura 3d)
   1. Prepare a glicose oxidase (20 mg / ml de glucose oxidase em DTT 200 mM e 10 mg / ml de catalase) mistura em avanço e armazenar em pequenas alíquotas a -80 ° C.
   2. Prepara-se uma "mistura de bloqueio" contendo κ-caseína, albumina de soro bovino (BSA), Tween-20 e dextrano fluorescente (como um marcador neutro) (ver Tabela 1) com antecedência e armazenar em pequena aliquost a -80 ° C. Prevenir ciclos de congelamento e descongelamento repetidos. Garantir que todos os componentes são preparados na hora.
   3. Purificar centrossomas de linhas celulares KE37 linfoblástica humanos como descrito por Moudjou et al. ³² e armazenar a -150 ° C em pequenas alíquotas.
   4. Descongelar à temperatura ambiente centrossomas e incubar a 37 ° C durante ~ 20 min. antes do uso para garantir a nucleação de microtúbulos adequada.
      NOTA: Este promove microtúbulos nucleação durante o experimento.
   5. Nesse meio tempo, prepare-se 'mistura de ensaio', contendo tubulina (fluorescente e "escuro"), guanosina trifosfato (GTP), um sistema de limpador de oxigênio (glicose, glicose-oxidase, catalase e 1,4-ditiotreitol (DTT)), geradores de força molecular (por exemplo, motores de microtúbulos / agentes de ligação cruzada), trifosfato de adenosina (ATP) e de um sistema ATP-regenerador (fosfoenolpiruvato (PEP), piruvato cinase (PK) e lactato desidrogenase (LDH)) em gelo (ver Tabela 2).
   6. Pré-arrefecer oAirfuge rotor em gelo. Girar a amostra no rotor refrigerado Airfuge (30 psi por 3 min) .Add centrossomas pré-aquecidas (otimizar a quantidade de centrossomas apontar para gotículas contendo 1-2 centrossomas).
   7. Utilizar a mistura combinada para produzir gotículas de emulsão, utilizando os métodos descritos na secção 2.3.

Componente	da concentração	Concentração final (em ensaio)	Volume	Comente
Dextrano-647nm	75 uM	3,75 uM (0,6 uM)	5 ul
κ-caseína	20 mg / ml	12,5 mg / ml (2 mg / ml)	62,5 ul
Tween-20	5%	0,375% (0,06%)	7,5 ul
BSA	200 mg / mL	12 mg / ml (1,9 mg / ml)	6 ul
MRB80			19 ul
			100 uL finais	Armazenar em mL alíquotas 2

Tabela 1: Constituintes de 'bloqueio Mix' Constituintes de mix de bloqueio, necessários para a reconstituição das estruturas fusiformes em água-em-óleo gotículas de emulsão.. Para obter uma descrição, consulte a secção texto principal 3 "Reconstituir asters básicos de microtúbulos". Para mais detalhes sobre materiais, consulte "Tabela de Materiais.

Componente	da Concentraçãn	concentração final	Volume	Comente
Bloqueio mix			1,6 ul
tubulin	500 uM	30 uM	0,6 ul
-Tubulina 488/561	50 uM	3 uM	0,6 ul
GTP	50 mM	5 mM	1.0 ul
Dineína-TMR	178 nM	30 nM	1,7 ul
estreptavidina	5 mg / ml	200 nM	0,4 ul	Para Dineína cortical única
Cinesina-5	1,6 mm	80 nM	0,5 ul
ATP	25 mM	1 mM	0,4 ul	Para motores só
PEP	0,5 M	25,6 mM	0,5 ul	Para motores só
PK / LDH	800 U / L 1100	23 U / L 32	0,3 ul	Para motores só
Ase1-GFP	400 nM	80 nM	2,0 ul
Glicose	2,5 M	50 mM	0,3 ul	Último passo
Glicose-oxidase	50x	1.0x	0,3 ul	Último passo
MRB80			X
			9 ul finais

Tabela 2: Constituintes de 'Ensaio Mix'. Os constituintes da mistura de ensaio, necessária para a reconstituição de estruturas fusiformes em água-em-óleo de gotículas de emulsão. Para obter uma descrição, consulte a secção texto principal 3 "Reconstituir asters básicos de microtúbulos". Para mais detalhes sobre materiais, consulte a Tabela de Materiais.

4. Apresentação do Eixo montagem de fatores

NOTA: Nos ensaios descritos aqui, uma proteína fluorescente verde (GFP) tagged versão truncada de S. cerevisiae dineína foi usado que é artificialmente dimerizado por meio de uma glutationa S-transferase terminal amino (GST) -tag ^33. Esta proteína é purificada através de uma etiqueta de afinidade que contém duas cópias da proteína de um domínio de ligação Igg. A variante aqui usado é marcado com uma etiqueta de tetrametilrodamina (TMR) para o carboxi-terminal e N-terminal de SNAP-tag é usada para biotinilar as proteínas purificadas. Para mais detalhes do construto, ver Roth et al ^31.; para mais detalhes de purificação, consulte Reck-Peterson et ai. ^33. GFP-biotina-dineína-TMR podem ser direcionados para a gotícula-córtex através da formação de complexos de biotina-estreptavidina que apontam para lípidos dineína biotinil-PE (Figura 3E).

1. Dineína Segmentação à gota Cortex
   1. Incluem GFP-biotina-dineína-TMR na 'mistura de ensaio' (ver Tabela 2), a uma gotícula-concentração final de 30 nM. Incluem estreptavidina na 'mistura de ensaio' (ver Tabela 2), a uma gotícula-concentração final de 200 nM.
      NOTA: Dineína depende ATP-hidrólise para o movimento passo a passo no microtúbulos. Por conseguinte, incluem ATP e um sistema de regeneração de ATP (contendo PEP e PK / LDH) para a 'mistura de ensaio' (ver Tabela 2).
      NOTA: recombinante de comprimento total S. pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) foi gentilmente cedido pelo laboratório Diez (Center for Molecular Bioengenharia, Technische Universitat Dresden, Dresden, Alemanha), ver. Recombinante full-lS. ength marcaram-histidina pombe GFP-Ase1 foi gentilmente fornecido a partir do laboratório Jansons (Wageningen University, Wageningen, The Netherlands) e adicionou-se a 'mistura de ensaio' em concentrações de 80 nM.

5. Imagiologia

Nota: Durante a experiência, o crescimento de microtúbulos pode ser controlado por variação da temperatura. Na escolha das condições de imagem, soluções de compromisso tem que ser feita entre imagens de alta qualidade e a capacidade de monitorar montagem do fuso por longos períodos de tempo. Para comparar a cinética de formação do fuso, em condições diferentes, com diferentes teores de gotículas podem ser misturados e fotografada no mesmo canal de fluxo.

1. Configurações de imagem básicos
   1. Imagem em um ambiente com temperatura controlada usando uma câmara fechada. Visualizar microtúbulos individuais depois de ~ 30 min a 26 ° C. Enquanto imagiologia, promover-microtúbulo crescimento, aumentando a temperatura até ~ 30 ° C.
      NOTA: Os sCONFIGURAÇÃES ​​abaixo são específicos para a nossa configuração microscópio e pode variar de acordo com diferentes sistemas e software operacional diferente. Todos os ensaios descritos aqui são gravadas num sistema invertido motorizado com uma cabeça de disco rotativo e confocal operado utilizando software de imagem, tais como Andor iQ 3.1. Obter todas as imagens com uma objectiva de imersão em óleo de 100X e câmera EMCCD.
   2. Definir lasers de excitação 488, 561 e 641 nm a intensidade de cerca de ~ 10%. Ir para o painel 'aquisição', clique no botão 'AOTF' guia e laser de slides intensidades para 10%. Clique em 'record' para armazenar as configurações.
   3. Para -projections z, levar pilhas com 1 mm intervalos (~ 20 imagens / gota). Ir para o principal "camera" painel, clique em 'Editar z' e definir "passo Z 'a 1.0. Clique em" Next "para armazenar as configurações.
   4. Definir máxima EM-ganho linear clicando na guia 'câmera' no painel da "aquisição" e deslize a barra ganho de EM para 300. exposição Setvezes para 200 ms na mesma guia. Clique em 'record' para armazenar as configurações.
2. Imagens ao vivo
   1. Para geração de imagens ao vivo, usando os controles de software fazem z -projections cada 2 min. durante o período de 1-2 horas, reduzindo os tempos de exposição para ~ 100 mseg. (tal como descrito em 5.1.4) e aumentar -intervals z a 2 uM (tal como descrito em 5.1.3). Definir a série de tempo no painel principal de "câmara", clique em "repeat t 'e definir a 2 min. intervalos para um tempo total de 120 minutos.
   2. Para os ensaios ao vivo, usar um vaso de PDMS, em vez de uma célula de fluxo regular para garantir que as gotículas são tão imóvel quanto possível.
3. Imagem combinada de 2 Condições
   1. Produzir gotas utilizando microfluidos e armazenar no topo de uma lâmina de vidro de PDMS revestido em gelo. Isso impede que a nucleação dos microtúbulos até que o segundo conjunto de gotas de ter sido formado. Antes de produzir o segundo conjunto de gotas, lavar os tubos PEEK e chip microfluídico comMRB80 e completamente encher chip microfluídico com o / oil-fase lipídica.
   2. Gerar gotículas com e sem dextrano fluorescente (ou utilizando dextrano com fluoróforos diferentes de comprimento de onda), a fim de discriminar entre as gotículas com cores diferentes. Depois de produzir o segundo lote de gotículas, misturar suavemente as gotículas por pipetagem e carregar para um / PDMS-copo célula de fluxo único.
4. Análise de Imagem.
   1. Analisar imagens usando Fiji (software de fonte aberta disponível on-line) ^34.
   2. Para os ensaios ao vivo, converter pilhas em hyperstacks usando 'imagem' - 'hyperstacks' - 'pilha para hyperstack'. Definir o número correto de z-fatias e prazos.
   3. A fim de tornar z-projeções, escolha 'imagem' - 'pilhas' - 'z-projecto ». Escolha projeção 'max intensidade ".
   4. Para 3D reconstruções, primeiro vá para 'imagem' - 'propriedades' e definir o pixel adequada com, em altura de pixel, profundidade voxel e frintervalos Ame. Clique em 'OK'. Escolha 'imagem' - verifique 'projeto 3D', a caixa 'interpolate "e clique em' OK '-' pilhas '.

Results

Os métodos apresentados nas secções precedentes a permitir a reconstituição de estruturas fusiformes com o aumento da complexidade geométrica usando o confinamento de água-em-óleo de gotículas de emulsão. Esta seção descreve os resultados representativos que qualitativamente demonstrar a capacidade destes ensaios.

Durante a mitose, quando o fuso bipolar é montado, as células completam para formar esferas com um diâmetro de cerca de 15 uM, tal como medido para as células humanas. Esta forma da célula mitótica característica fornece um limite geométrico que ambos restringe e dirige o tamanho e a orientação do eixo ^35,36. Técnicas microfluídicos, fornecer um nível de confinamento geométrica que se assemelha com precisão a situação observada em células vivas e, portanto, permite a reconstrução de baixo para cima de fusos mitóticos in vitro.

(Figura 4A, painel da esquerda). Após cerca de 20-30 minutos, os primeiros microtúbulos se tornar difusão visível e centrossoma se torna restrito como microtúbulos crescem contra o córtex em todas as direções. Ásteres com microtúbulos de comprimento intermédio (cerca de 50% do diâmetro das gotículas) pode (estericamente) repelem outro, com microtúbulos empurrar um contra o outro, os outros centrossomas e o córtex. Isso resulta em um arranjo fusiforme 'bipolar' típico com os dois centrossomas opostos uns aos outros (Figura 4A, painel do meio). Quando microtúbulos crescer mais do que ~ 50% da gotícula-diâmmedidor, os centrossomas são empurrados ainda mais para os limites opostos da gota, com os microtúbulos que crescem ao longo do córtex gota (Figura 4a, painel da direita). É importante notar que as taxas de crescimento dos microtúbulos nestes ensaios são muito sensíveis à temperatura e concentrações afim da tubulina. Esses parâmetros, portanto, afetar fortemente o momento em que a nucleação é observada pela primeira vez e quando as posições do áster de estado estacionário são atingidos.

Em células, forças de tracção corticais são geradas através da formação de ligações de suporte de carga entre o microtúbulo e as extremidades plus-dineína associada-córtex. Nas células animais, a associação do complexo depende Gαi / LGN / NUMA, que é orientada para a membrana plasmática através de miristoilação de terminal-N de ^uma Gαi. Nestes ensaios de reconstituição, o requisito de o complexo Gαi / LGN / NuMA é ignorada por acoplamento directo dineína a lípidos através do biotiniladosformação de complexos de biotina-estreptavidina-biotina. Estas ligações são relativamente estáveis ​​(K _D ~ 10 ^-14 M) ³⁷ e formar rapidamente (geralmente dentro de 10 minutos após a formação das gotas da emulsão, antes de microtúbulos nucleação torna-se aparente) (Figura 4b). Na presença de dineína cortical, centrossomas tipicamente reter uma posição mais central, enquanto que, na ausência de dineína, centrossomas são empurrados para os lados opostos do córtex gota (Figura 4c). Nós razão que este é o resultado de dois efeitos, o que evitar e combater as forças de microtúbulos empurrando. (1) Dineína promove diretamente catástrofes microtúbulos, restringindo assim o comprimento dos microtúbulos e prevenir flambagem microtúbulos excessiva, e (2) as forças que puxam corticais levam a forças de centralização líquidos sobre os ásteres individuais ^8, que neutralizam as forças de repulsão aster-aster.

O agente de reticulação difusível Ase1 induz forces que tendem a aumentar a região de sobreposição de microtúbulos anti-paralelos ^29. Consistente com este, na presença de Ase1 (e ausência de dineína) centrossomas são encontradas perto em conjunto com a localização de Ase1 empacotado microtúbulos interpolares (Figura 4D). Os membros da família da cinesina-5 conduzir a separação do centrossoma, fornecendo forças que empurram a partir de dentro do fuso (ver introdução). Na presença de Cut7 (S. pombe cinesina-5 ortólogo), centrossomas são empurrados para os lados opostos das gotículas de emulsão, mesmo na presença de Ase1 (Figura 4E). Através da combinação de geradores de força corticais e inter-polares, o nível de complexidade pode ser aumentada nestas experiências, o que levou a uma compreensão abrangente da montagem do fuso mitótico bipolar. Uma descrição detalhada quantitativa destes resultados estarão disponíveis no futuro (Roth et ai., Manuscrito em preparação).

(Figura 5C). Isto facilita o estudo de comportamento tanto no estado estacionário e cinética de montagem do fuso. Através da combinação de gotículas com diferentes teores na mesma amostra, é, por exemplo, possível comparar directamente posicionamento e montagem do fuso cinética centrossoma em gotículas com e sem geradores de força cortical (Figura 5b).

Figura 1: As forças que actuam sobre o fuso mitótico Várias moléculas geradoras de força agir sobre os microtúbulos do fuso mitótico para promover a formação do fuso e posicionamento.. Os microtúbulos que se transformam em células do córtex gerar uma força de propulsão no centrossoma. dineína cortical (roxo) captura microtúbulos despolimerização e gera uma força puxando os centrossomas. Dentro do fuso, cinesina-5 proteínas do motor / Cut7 fornecer uma força externa que desliza no microtúbulos anti-paralelas, enquanto agentes de reticulação da família PRC1 / Ase1 gerar uma oposição externa força de deslizamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Figura 2:. Microfluidic Chip Design (A) Projeto de photomask 4 polegadas contendo 4 chips microfluídicos. (B) uma representação detalhada de um único chip. Batatas fritas contêm um canal de saída e três canais de entrada de ar seguido por um filtro de poeira. Uma entrada do canal contém a fase aquosa, o canal 2 / óleo de fase lipídica e o canal 3 pode ser utilizado para diluir as gotas formadas com / óleo de fase lípido adicional. (C) Representação detalhada da junção onde o / óleo de fase lipídica (proveniente da parte superior e inferior) encontra-se com a fase aquosa (vindo da esquerda). Na junção, as gotas irão formar e fluir em direcção ao canal de saída do lado direito. (D) a representação detalhada de um dust-filtro com 2 mm canais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:. Metodologia para a formação de água-em-óleo das gotas da emulsão (A) e tubos de chip microfluídico microfluidos em um microscópio de campo brilhante. Ambos os tubos de água e /-óleo de fase lipídica está ligado às entradas de chip 1 e 2, respectivamente. (B) Restrição no chip de microfluídica, onde a água e lipídios / óleo-fases se encontram. Ao mudar as pressões, as gotas de tamanho pode ser controlada. (C) Projeto de células de fluxo de PDMS-revestidos. Depois de colocar as gotas para a célula de fluxo, as extremidades abertas são fechadas com valap adicional. (D) Esquema de formação de gotículas. Gotas são usados ​​para encapsular centrossomas, tubulina e componentes adicionais necessários para a formação do fuso mitótico. (E) esquemático de segmentação cortical-dineína. Biotinilada (Bio) dineína é direcionado para lipídios biotinilados através de estreptavidina (Strp).

Figura 4:. Os resultados representativos do eixo-Reconstituições com a complexidade crescente (A) as projeções de intensidade máxima de gotículas contendo dois centrossomas que mostram exemplos de microtúbulos curtas, médias e longas. Centrossomas e microtúbulos são visualizadas através da adição de 10% HiLyte-488 marcado tubulina. Barras de escala = 10 uM. (B) Localização de GFP-biotina-dineína-TMR na ausência (-, esquerda) e na presença (+, direita) de estreptavidina (Strp). Posicionamento (C) Microtubule áster na ausência (-, esquerda) ou na presença (+, direita) da cortical GFP-biotina-dineína-TMR. (D) aster microtúbulos (painel esquerdo, green) posicionamento na presença de Ase1 (painel do meio, vermelho). (E) microtúbulos aster (painel esquerdo, verde) posicionamento na presença de Ase1 e Cut7 (kinesin-5) (painel do meio, vermelho). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: geração de imagens Aster de posicionamento Dynamics in vitro (A) Projeto de um copo PDMS que permite imagens gota por até várias horas.. (B) Geração, armazenamento e tratamento de imagens de gotas (transmitida) contendo diferentes teores, ilustrados por ausência (à esquerda) inclusão (direita) de dextrano fluorescente (Alexa 647). (C) imagens planas individuais de um 60 min de lapso de tempo (intervalos de 2 min), tomada a partir de um z-stack (2 mm distâncias) de anúncioroplet contendo um único centrossoma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os métodos descritos aqui presentes os recentes esforços para reconstituir eixos básicos mitóticas em água-em-óleo gotículas de emulsão. Estudar montagem do fuso dentro de limites geométricos oferece inúmeras vantagens. Existem mecanismos importantes de feedback entre os microtúbulos do fuso mitótico e as restrições geométricas em que são montadas. Os microtúbulos pode gerar forças que empurra quando crescem em limites geométricos, o que pode resultar num deslocamento do fuso mitótico. Além disso, crescendo em uma barreira física pode induzir catástrofes microtúbulos. Além disso, a montagem do eixo dentro de uma geometria confinada pode levar a uma redução gradual dos componentes individuais, tais como a tubulina, que por sua vez afecta directamente a taxa de crescimento dos microtúbulos ^36. Estes são todos determinantes essenciais do porta-veios, que podem ser estudados utilizando os ensaios descritos aqui.

Os ensaios descritos são muito sensíveis à pequena concentração diferenc ias de os componentes das gotículas. Este é o caso para a tubulina, em que as diferenças de concentração pequenas podem resultar em crescimento de microtúbulos, quer muito lenta ou muito rápida. Neste caso, as taxas de crescimento de microtúbulos pode muitas vezes ainda ser corrigido ajustando a temperatura durante o primeiro ~ 30 min da experiência. montagem do fuso mitótico e posicionamento é também muito sensível a variações na concentração dos geradores (cortical) de força. É provável que isto depende da concentração, a pureza e a actividade dos componentes purificados e precisa de ser cuidadosamente titulada para cada nova proteína purificada.

Além disso, certas soluções de compromisso tem que ser feita em configurações de imagem, dependendo da natureza do ensaio. Inicialmente, altos níveis de dímeros de tubulina fluorescentes solúveis dificultar a imagem microtúbulos individuais. Como microtúbulos tubulina e crescer mais lentamente solúvel é esgotado, a relação sinal-ruído gradualmente torna-se maior e permite a imagiologia de INDIVIDUmicrotúbulos al. Em contraste com as configurações com sistemas abertos, o confinamento geométrica impede a troca de moléculas fluorescentes e componentes do sistema eliminador de oxigénio dentro de um reservatório a granel, resultando em branqueamento significativo. Especialmente para monitorizar a montagem do fuso e o posicionamento ao longo do tempo, que é necessário para a imagem com baixas intensidades de luz, mesmo na presença de um sistema eliminador de oxigénio potente.

Estes métodos permitem a reconstituição de baixo para cima de estruturas fusiformes simplificados in vitro. Em adição aos componentes aqui apresentados, muitos outros factores têm sido descritas para influenciar a formação do fuso bipolar, posicionamento, orientação, moldagem, etc ^3. Este sistema também pode ser expandido para estudar os efeitos individuais e combinados de geradores de força adicional. importantes contribuintes para a formação do fuso que estão atualmente ausente deste sistema são os cromossomos mitóticos. cromatina mitótica foi mostrado paraformação do fuso directo, por (1) chromokinesins que podem gerar os chamados "forças polar-ejecção ^'3, (2) a formação de um gradiente RanGTP pela ligada à cromatina RanGEF RCC1 ^38, (3) cinetócoros que pode interagir com (despolimerização microtúbulos) ³⁹ e (4) do próprio cromatina, o que pode funcionar como uma mola mecânica entre-microtúbulos opostas ^40.

Finalmente, o sistema descrito atualmente fornece controle espacial e temporal limitado sobre a atividade e localização de força-geradores introduzidas. Nas células, muitos fatores de montagem do fuso localizam compartimentos específicos ou estão ativos dentro de uma janela de tempo restrito. Um exemplo notável é a actividade de dineína, que é especificamente enriquecida no lado posterior da C. elegans fase de embrião de uma célula para promover o posicionamento do eixo assimétrico e divisão celular. Neste sistema, estamos a explorar a possibilidade de imitar tais tmétodos emporal e assimétricas atividade usando emprestado de técnicas opto-genéticos. Além disso, como é o caso para o C. elegans embrião e as células com uma parede celular rígida, muitas células não completam na mitose. A forma do confinamento geométrica terá um impacto fundamental sobre as forças que atuam sobre o eixo ^41. Assim, será importante para reconstituir montagem do fuso e posicionamento em gotículas não esféricas, bem como, potencialmente usando sistemas microfluídicos mais complexos que permitem que moldam e armazenamento de emulsão de gotas ^42,43. Finalmente, em tecidos, célula-célula e sinalização-substrato celular e apego fornecer pistas externas que podem ser traduzidos em orientação do fuso dirigido, como é muitas vezes observada em células epiteliais e células-tronco. Todos estes aspectos especializados não foram tidos em conta neste estudo atual e pode fornecer futuros desafios para construir no sentido mais in vivo -como reconstituições de assemb fuso mitóticoly e posicionamento.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Preparação de chips microfluídicos
Photomask (Photomask on film substrate)	Selba S.A. Suíça
SU-8 3025	MicroChem
Silicon wafer (4 polegadas silicon wafer p/Boron < 1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μ m, SSP, com 2 planos)	WRS Materials	4P0SSP-005
Revestidor de spin:	Polos	SPIN150I
PDMS pré-polímero RVT615 A+B	Lubribond	9481
Corona treater	Produtos eletrotécnicos	BD-20ACV
2. Configuração microfluídica
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DOPS (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina)	Avanti Polar Lipids	840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-( biotinil))	Avanti Polar Lipids	870285
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	650498
Pipetas
Tubos de
Bomba de vácuo	Laboport	KNF
Câmara de vácuo	Kartell	Polipropileno Dessecador
Óleo mineral	Surfactante Sigma-Aldrich	M5904
(Span80)	Sigma-Aldrich	85548
Sonicator	Branson	M2800H
Lamínulas			24 mm x 60 mm, espessura 1.5
Lâminas			26 mm x 76 mm
Perfurador	Harris Uni-Core	135840/135841/135843
Vedação de laboratório filme	Parafilm
Valap (Vaselina, lanolina, cera de parafina derretida em concentrações iguais)			Microscópio
de Campo Claro	Leica	PMIRB	Qualquer campo claro invertido seria suficiente
Regulador de pressão	Fluigent	MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Tubing	Cluzeau Info. Labo, França
Frascos de microfluídica (Tubos Micrew 0,5 ml e 1 ml)	VWR, Países Baixos
3. Reconstituição da formação e posicionamento do fuso
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10.000 MW, aniônico, corrigível)	Life Technologies
Tween-20	Sigma-Aldrich
BSA - Albumina sérica bovina	Sigma-Aldrich
Glucose (D-(+)-Glucose)	Sigma-Aldrich	G8270
Glucose-oxidase (Glicose oxidase de Aspergillus niger)	Sigma-Aldrich	G6125
DTT (DL-ditioletolitol)	Sigma-Aldrich	646563
Catalase (Catalase forma fígado bovino)	Sigma-Aldrich	C9322
Tubulina (Tubulina do cérebro bovino)	Citoesqueleto Inc.
Tubulina-488/561 (tubulina marcada com HiLyte-488 / Rodamina do cérebro suíno)	Cytoskeleton Inc.
GTP (Guanosina-'5-trifosfato, hidrato de sal de sódio)	Sigma-Aldrich	51120
κ-caseína (κ-caseína de leite de soro bovino)	Sigma-Aldrich	C0406
Airfuge (ultracentrífuga acionada a ar)	Beckman-Coulter	CLS
4. Apresentando os fatores de montagem do fuso< / strong>
Nome< / strong>	Empresa< / strong>	Número de catálogo< / strong>	Comentários< / strong >
Neutravidina	Sigma-Aldrich	A2666
ATP (Adenosina-'5-trifosfato, hidrato de sal dissódico)	Sigma-Aldrich	A9187
PEP (Ácido fosfo(enol)pirúvico monossódico hidratado de sal ≥ 97% (enzimático))	Sigma-Aldrich	P0564
PK/LDH -(enzimas piruvato quinase/desidrogenase láctica do músculo do coelho)	Sigma-Aldrich	P0294