Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para usar o RNA de interferência pequena específico da proteína de choque térmico 27 (HSP27) para avaliar a função da HSP27 durante a cicatrização de feridas epiteliais da córnea. A interferência de RNA é o melhor método para efetivamente derrubar a expressão gênica para investigar a função da proteína em vários tipos de células.

Resumo

O RNA interferente pequeno (siRNA) está entre os métodos de interferência de RNA mais amplamente utilizados para o silenciamento de curto prazo de genes codificadores de proteínas. siRNA é um duplex de RNA sintético criado para direcionar especificamente um transcrito de mRNA para induzir sua degradação e tem sido usado para identificar novas vias em vários processos celulares. Existem poucos relatos sobre o papel da proteína de choque térmico fosforilada 27 (HSP27) na cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Aqui, as células epiteliais da córnea humana cultivadas foram divididas em um grupo transfectado por siRNA de controle embaralhado e um grupo transfectado por siRNA específico para HSP27. Ensaios de ferimento direcional induzido por arranhões, western blotting e citometria de fluxo foram então realizados. Concluímos que o HSP27 tem papéis na cicatrização de feridas epiteliais da córnea que podem envolver apoptose e migração de células epiteliais. Aqui, são fornecidas descrições passo a passo da preparação da amostra e do protocolo do estudo.

Introdução

Células epiteliais da córnea (PEC) são eliminados continuamente em filme lacrimal, enquanto eles são simultaneamente substituído por células do limbo e camadas basais do epitélio da córnea. ¹ Vários factores de stress extrínsecos pode induzir a apoptose e descamação do PEC. ² As proteínas de choque térmico (HSPs) são altamente conservados e podem ser divididos em duas famílias de acordo com o tamanho molecular. ³ a maior família HSP inclui HSP90, HSP70 e HSP60, e a família menor inclui HSP27. ⁴ a fosforilação de HSP27 é conhecida por desempenhar um papel importante na sobrevivência celular e é necessária para a migração de células devido ao papel desta proteína na remodelação da actina. ^07/05 Portanto, uma tentativa para testar o potencial papel da fosforilação em HSP27 migração CEC e a apoptose em um modelo in vitro de reparação epitelial.

RNA de interferência (RNAi) utilizando quer ARN interferentes pequenos ou curtos (siARN) tem GEinteresse nerated tanto em biologia básica e aplicada, uma vez que potencialmente permite a expressão de qualquer gene de interesse a ser knocked-down. ⁸ Aqui, usamos siRNA específico do HSP27 para avaliar a contribuição de HSP27 para a cicatrização de feridas CEC e apoptose. ARNi métodos tradicionais para o gene knock-down em células utilizam duplexes de ARN sintéticos, incluindo dois oligonucleótidos 21-meros não modificados que podem ser montadas para criar ARNsi. O RNAi siRNA que usamos no presente estudo é um método simples e altamente eficiente para transfectar células, e este reagente trabalha com várias linhas de células imortalizadas. No presente estudo, demonstramos os métodos utilizados para esta análise, incluindo um ensaio de induzida por zero ferida direcional, western blot, ensaio de transfecção siRNA, imunofluorescência e citometria de fluxo.

Protocolo

Linha 1. celular

1. Cultura de 10 ⁶ culas imortalizadas-telomerase humana corneanas epiteliais (HCEC) em uma placa de 6 poços (densidade: 1039,9 células / mm ²⁾ numa 37 ° C incubadora com uma atmosfera de _CO2 a 5%, utilizando meio de crescimento do epitélio brônquico (BEGM) até atingirem 95% de confluência.

2. Western Blot Analysis após Criando Wounds raspadinhas epiteliais

1. Streak uma ponta estéril 200 ul pipeta através da superfície de um poço de confluentes HCEC cultivadas quatro vezes por placa numa câmara de segurança biológica (Classe II, tipo A2) e incubar HCEC separadamente em um 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO ₂ durante 1, 5, 10, 30, 60, e 120 min.
2. Utilize uma placa de 6 poços para seis amostras diferentes de acordo com o tempo de incubação após a lesão do epitélio da córnea.
3. Lavar feridos HCEC monocamadas três vezes com PBS 1x e, em seguida, adicionar 2,0 ml BEGM a cada poço.
4. Retire HCEC usando 2ml de 0,25% de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por poço durante 5 minutos, centrifugar a 900 xg durante 5 min num tubo de 15 ml, e aspirado de tripsina-EDTA, utilizando uma pipeta de 1 ml.
5. Suspender HCEC com 1 ml de PBS 1x e transferi-los para um tubo de 1,5 ml.
6. Centrífuga HCEC a 10.000 xg durante 15 seg e aspirado de 1x PBS utilizando uma pipeta de 1 ml.
7. Ressuspender HCEC em 100 de tampão de lise arrefecido com gelo ul (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, EDTA 2 mM, NaF 25 mM, 2 mM Na ₃ VO _4, fenilmetanossulfonil fluoreto de 1 mM [FPMS], inibidores de protease [1 uM de pepstatina A, 1 | iM de leupeptina, e 0,1 uM de aprotinina] e 0,5% de Triton X-100 [pH 7]) e misture bem.
8. Incubar as células durante 30 min em gelo para induzir lise celular.
9. Os lisados ​​Centrifugar a 4 ° C a 10000 xg durante 15 min, e, em seguida, transferir os sobrenadantes para novos tubos de 1,5 ml (90 mL alíquotas) e armazená-las a -80 ° C.
10. Determinar as concentrações de proteína total dos lisados ​​celulares utilizando o pr Bradfordensaio otein ^9.
11. Carregar 30 ug de proteínas de células totais num gel de acrilamida a 10% ou 12% por electroforese em dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida gel (SDS-PAGE), e depois por electroforese transferência separada bandas de proteínas a filtros de nitrocelulose com uma corrente de 200 mA durante 1 hora a 4 ° C para usar em ensaios de western blot.
12. membranas de filtro em bloco de nitrocelulose com 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST), durante 1 h, adicionar anticorpos policlonais de coelho primários contra a HSP27 não-fosforilada (diluição 1: 1000) ou anticorpo policlonal primário de coelho contra a HSP27 fosforilado (1 : 1000 de diluição) em 5% de albumina de soro bovino (BSA), e incuba-se as membranas durante a noite a 4 ° C num agitador.
13. Detectar bandas imunorreactivas com anticorpos anti-coelho com peroxidase de rábano de cabra conjugado com (1: 10.000 de diluição) em BSA a 5% após a lavagem durante 10 minutos 3 vezes com TBST.
14. Incubar a membrana nos reagentes de luminol de Western blotting (6-7 ml por 10 cm × membrana 5 cm) durante 1 min à temperatura ambiente.
15. Remover a membrana da solução reagente, remover o excesso de líquido com uma toalha absorvente e coloque em um protetor de folha de plástico.
16. Trabalhando em um quarto escuro com uma luz segura, coloque membrana coberta com uma cassete de filme com o lado proteína voltado para cima.
17. Coloque um filme de raios-X em cima da membrana e expor durante 1 min.

3. Transfection siRNA Assay ¹⁰

1. HCEC cultura a 5 x 10 ⁵ células / poço numa placa de 6 cavidades em uma incubadora de 37 ° C com uma atmosfera de _CO2 a 5%, utilizando BEGM até atingirem 95% de confluência.
2. Dilui-se o reagente de transfecção (2,5 ou 7,5 ul) com 100 ul reduzidas meio de soro para a transfecção (o factor de diluição foi de 41 ou 14,3) e dissolve-se o específico do HSP27 e mexidos ARNsi de controlo em 100 ul de meio de soro reduzido para criar 10 ou 50 nM de -HSP27 específico e mexidos siRNA controle.
3. Misturar 100 μ; L com solução de siRNA 100 ul de reagente de transfecção diluída (1: 1) e incuba-se a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente.
4. Adicionar os complexos de siRNA-lípido às células. Em seguida, após 4 h mudanças de meios para completar BEGM e incubar as células durante 2 dias a 37 ° C.
5. Analise as células transfectadas por transferência de Western, como descrito a partir de secções de 4,1 a 4,7.

4. Ensaio de Western Blot para células transfectadas com ARNsi ¹¹

1. Extrair específicos de HSP27 e mexidos controlo HCEC transfectadas com ARNsi numa câmara de segurança biológica usando 100 ul de tampão de lise gelado (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, ácido etilenodiaminotetracético 2 mM (EDTA), NaF 25 mM, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF), inibidores de protease, e 0,5% de Triton X-100, pH 7).
2. Incubar as células durante 30 min em gelo para induzir lise celular.
3. Os lisados ​​pelete a 10000 xg durante 15 min e depois transferir os sobrenadantes para banheira de 1,5 ml frescoes (90 ul Alíquotas) e armazená-los a -80 ° C.
4. Determinar as concentrações de proteínas dos lisados celulares utilizando o ensaio de proteína de Bradford ^9.
5. amostras de carga com quantidades iguais de proteínas celulares totais sobre um gel de acrilamida a 10% ou 12%, submeter o gel de SDS-PAGE e electrof transferir as bandas de proteínas separadas para filtros de nitrocelulose com uma corrente de 200 mA durante 1 hora a 4 ° C a utilização em ensaios de western blot.
6. Bloco de membranas de filtro de nitrocelulose com 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST), durante 1 h, adicionar anticorpos primários contra fosforilada e não fosforilada HSP27 (diluição 1: 1000), Akt fosforilada (diluição 1: 1000), não fosforilada Akt (diluição de 1: 1000, utilizado como um marcador de sobrevivência celular), Bcl-2 associada proteína X (diluição de 1: 1000, usado como uma proteína pro-apoptótica), e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 1 : 200 de diluição, utilizados como um controlo de carga) em 5% de albumina de soro bovino (BSA), eincubar as membranas durante a noite a 4 ° C num agitador.
7. Detectar bandas imunorreactivas com anticorpos anti-coelho com peroxidase de rábano de cabra conjugado com (1: 10.000 de diluição) em BSA a 5% após a lavagem 3 vezes com TBST, 10 minutos cada lavagem.
8. Incubar a membrana nos reagentes de luminol de Western blotting (6-7 ml por 10 cm x 5 centímetros de membrana) durante 1 min à temperatura ambiente.
9. Remover a membrana da solução reagente, remover o excesso de líquido com uma toalha absorvente e coloque em um protetor de folha de plástico.
10. Trabalhando em um quarto escuro com uma luz segura, coloque a membrana coberta com uma cassete de filme com o lado da proteína voltado para cima.
11. Coloque um filme de raios-X em cima da membrana e expor durante 1 min.

5. direcional ferindo Ensaio de Avaliação da migração celular ¹² induzida por risco

1. Numa câmara de segurança biológica, fazer uma ferida, arrastando uma ponta de pipeta estéril através da superfície de um poço de culturas confluentes deespecíficos do HSP27 transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi HCEC transfectadas mexidos.
2. Imediatamente após o ferimento, lavar as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) e mantê-las em culturas BEGM numa incubadora a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO ₂ durante 24 horas após o ferimento.
3. Fotografar imagens HCEC usando um microscópio vertical em 100X 24 horas após o ferimento e executar fundo achatamento usando o Filtro comando no software de análise de imagem.
4. Usando o comando Selecionar Medidas, definir a área de interesse (AOI) com a mesma forma poligonal tamanho que pode cobrir perpendicularmente a partir de uma extremidade à outra da ferida inicial, e determinar três AOI diferente na área ferida de cada amostra.
5. contar automaticamente o número de células em cada campo usando as opções do menu Medida Contagem / Tamanho.

6. Fluxo de Análise de Citometria de apoptose

1. Cultura transfectadas com siRNA e específicos de HSP27 controle sHCEC contendo cada 10 nM de ARNsi iARN-transfectado numa concentração de 5 x 10 ⁵ células / poço em placas de 6 poços até as células atingirem 95% de confluência em uma temperatura de 37 ° C incubadora com uma atmosfera de _CO2 a 5% em BEGM.
2. Retire HCEC utilizando 2 ml de 0,25% de tripsina-EDTA por poço durante 5 minutos, centrifugar a 900 xg durante 5 min num tubo de 15 ml, e aspirado de tripsina-EDTA, utilizando uma pipeta de 1 ml.
3. Lavar as células duas vezes com PBS frio e, em seguida, voltar a suspender as células em 1x tampão (HEPES 0,1 M / NaOH, [pH 7,4], NaCl a 1,4 M, e CaCl ₂ 25 mM) de ligação a uma concentração de 10 ⁶ células / ml.
4. Transferir 100 ul de suspensão de células (1 x 10 ⁵ células) num tubo de cultura de 5 mL.
5. Adicionam-se 5 ul de fluoresceína conjugado com isotiocianato de Anexina V e iodeto de propídio 5 ul.
6. Suavemente Agitar as células e incubar durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.
7. Adicionar 200 ul de 1x tampão de ligação a cada tubo e analisar as células por um fluxo cytometer dentro de 1 hora.

Resultados

A expressão de HSP27 fosforilada aumentou significativamente a 5, 10, e 30 min após a lesão, em comparação com zero HCEC intacta ^13. A análise por Western blot revelou que a expressão de HSP27 fosforilada e fosforilada de Akt foram ambas significativamente reduzida, enquanto que a expressão do Bax foi significativamente aumentada em HCEC transfectadas com ARNsi específico-Hsp27 (Figura 1A-E). A expressão de HSP27 fosforilado foi reduzido em 30% e 40% em 10 nM ...

Discussão

No presente estudo, avaliamos o papel potencial da HSP27 no ferimento epitelial da córnea usando abordagens in vitro . As etapas críticas envolveram a transfecção de siRNA para o knock-down de HSP27 para observar a função de HSP27 em células submetidas a estresse. Notavelmente, um papel para HSP27 foi revelado por esses experimentos na migração de células epiteliais e apoptose durante a cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Ao contrário de estudos anteriores¹⁰ que usaram siRNA específico de HS...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Armário de segurança biológica	CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, República da Coreia	CHC-777A2-06	Classe II, Tipo A2
Stealth RNAi™ siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; siRNA de controle embaralhado e siRNA específico para HSP27
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Meio de crescimento do epitélio brônquico
Inibidor de protease	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340, P7626	1 μ M Pestatina A, 1 μ M Leupeptina, 0,1 μ Ensaio de proteína M Aprotinin
Bradford	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001 Ensaio de	proteína Bradford
Filtros de nitrocelulose	Amersham, Little Chalfont, Reino Unido	RPN3032D	Membrana de Blotting
Western HSP27 não fosforilada	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	diluição 1:1.000 (HSP27 total)
HSP27 fosforilado (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	diluição 1:1.000 HSP27 foi fosforilada em Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagente	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Reagente de transfecção
Akt fosforilada (Ser473)	Tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA	No. 4060	Diluição 1:1.000 Akt foi fosforilada em Ser473 (marcador de sobrevivência celular)
Akt não fosforilada;	Tecnologia de Sinalização Celular, Danvers, MA	No. 4061	Diluição 1:1,000 (Total Akt)
Bcl-2-proteína X associada	Tecnologia de Sinalização Celular, Danvers, MA	No. 4062	1:1.000 (marcador de proteína antiapoptótica)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	No. 4063	marcador de controle de carga 1:1.000 (gene de manutenção doméstica)
Anticorpos anti-coelho de cabra conjugados com peroxidase de rábano	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	diluição 1:10.000
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	meio de soro reduzido para transfecção
Software de análise de imagem	Olympus, Inc., Tóquio, Japão	Image-Pro Plus 5.0
Leite em pó desnatado	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Alemanha	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Cloreto de Sódio	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Placa de cultura de seis poços	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35,00 mm de diâmetro / poço
Prato de cultura de 24 poços	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Agitador orbital	N-Bioteck, Inc., Seul, Coréia do Sul	NB1015
Albumina de soro bovino	Santa Cruz Biotecnologia, Santa Cruz, CA	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ
Filme de Citometria de Fluxo para Raios-X	Kodak, Rochester, NY		de Raio-X Médico com Tela Verde 400
reagente de luminol western blotting	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
Kit de detecção de apoptose FITC Annexin V I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547