Artigo de método

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

DOI:

10.3791/54281

⸱

25 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve uma técnica de transferência de bisturi de carga e corante fluorescente que mede comunicação intercelular através dos canais de junções de hiato. Gap comunicação intercelular juncional é um importante processo celular pelo qual a homeostase do tecido é mantido e ruptura dessa sinalização celular tem efeitos adversos para a saúde.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma técnica (SL-DT) bisturi carregamento-corante fluorescente transferência que mede a comunicação intercelular através de canais de junções de hiato, que é um importante processo intercelular através da qual a homeostase do tecido é mantida. A interrupção da comunicação intercelular por junções de hiato (CIJH) por agentes tóxicos, toxinas, fármacos, etc. tem sido associada a numerosos efeitos prejudiciais à saúde. Muitas doenças humanas genéticas à base de ter sido associada a mutações nos genes de junções de hiato. A técnica de SL-DT é um ensaio funcional simples para a avaliação simultânea de CIJH em uma grande população de células. O ensaio envolve as células de pré-carregamento com um corante fluorescente através da perturbação da membrana celular brevemente com uma lâmina de bisturi através de uma população de células. O corante fluorescente é então deixada a atravessar através de canais de junções de hiato às células vizinhas por um tempo designado. O ensaio é então terminada através da adição de formalina para as células. A propagação do fluodye rescent através de uma população de células é avaliada com um microscópio de epifluorescência e as imagens são analisadas com qualquer número de pacotes de software morfométricas que estão disponíveis, incluindo pacotes de software livres encontrados no domínio público. Este ensaio também foi adaptado para estudos in vivo utilizando fatias de tecido de vários órgãos de animais tratados. No geral, o ensaio de SL-DT pode servir uma ampla gama de necessidades farmacológicos e toxicológicos in vitro, e pode ser potencialmente adaptado para sistemas set-up alto rendimento com imagens de microscopia de fluorescência automatizada e análise para elucidar mais amostras em menos tempo.

Introdução

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O objectivo geral do presente método é o de proporcionar uma técnica simples, relativamente barato e abrangente para avaliar a toxicidade potencial dos compostos. Esta é uma abordagem in vitro que pode ser usado em várias linhas celulares. laboratórios de biologia celular standard equipados com microscópios de epifluorescência pode conduzir pesquisas com este ensaio.

Nosso conhecimento básico de funções celulares tem sido altamente dependente de bioensaios in vitro, e tornou-se um componente essencial nas avaliações toxicológicas de produtos farmacêuticos, poluentes ambientais e alimentares nascido contaminantes. Infelizmente, não existe um único sistema in vitro bioensaio que podem exaustivamente atender às demandas de todas as avaliações toxicológicas. Muitos ensaios in vitro foram concebidas e optimizadas para avaliar, assim como um ponto de extremidade avaliar bioquímica ou molecular específico. Estes são muitas vezes combinados em uma alta taxa de transferência configurado de modo a reflectir uma perturbação de umdeterminada via de transdução de sinal, tais como estrogénio-receptor de sinalização 1. Esta estratégia tem sido bastante bem sucedido, mas o número grande de vias de transdução de sinais envolvidos na expressão do gene torna a tarefa de escolha de uma via de sinalização específicas para avaliar bastante complexa. Elevadas protocolos através colocam-estão actualmente a ser desenvolvidos e utilizados para medir simultaneamente numerosas vias de sinalização, o que tem sido uma abordagem para ultrapassar algumas das limitações dos ensaios individuais. No entanto, nem todas as vias de sinalização foram incorporados com sucesso em abordagens mais abrangentes, além de novas vias de sinalização estão constantemente a ser descoberto que torna ainda mais complicado esse processo de avaliação. Utilizando números extensos de abordagens in vitro, particularmente elevada por meio-put sistemas, para avaliações toxicológicas abrangentes também são muito caros e não são conducentes a maioria investigador único liderado projectos de investigação.

GJIC é um tig processohtly controlada por mudanças na tensão, concentração de cálcio, pH, equilíbrio redox, reguladas pelas principais vias de transdução de sinal intracelular e interações com proteínas da membrana e do citoesqueleto 2,3. Assim, a inibição da CIJH pode reflectir diferentes tipos de stress celular, disrupção de funções celulares diferentes, ou perturbações de diferentes vias de transdução de sinal. Outra abordagem para superar o uso de bioensaios de transdução de sinal é limitado para tirar partido dos fenómenos biológicos que muitos, se não a maioria, vias de transdução do sinal modulado são ainda por sistemas de sinalização intercelular cooperativas através de canais de junções de hiato 4-8. Embora os sistemas de sinalização intercelular também são numerosos e sob controlo via múltipla, a sinalização intercelular através de canais de junções de hiato é em última análise, uma função dos canais a ser aberta, parcialmente fechado ou completamente fechado. Isto proporciona um ponto de extremidade, que pode ser facilmente medida utilizando váriasem sistemas de bioensaio in vitro 7. Considerando-se que o ponto de regulação homeostático de um tecido requer canais abertos, a determinação do efeito dos compostos sobre junções de hiato comunicação intercelular (CIJH) é uma abordagem mais abrangente na determinação de potenciais efeitos tóxicos de compostos 4,8. Na sua essência, este fenómeno biológico crítico que desempenha um papel central na coordenação de múltiplos eventos de transdução de sinais que controlam a expressão de genes permite uma avaliação global de efeitos tóxicos. Assim, os bioensaios para avaliar a CIJH é um excelente ponto de partida para avaliar o potencial tóxico de compostos.

As técnicas mais extensas utilizados para avaliar a CIJH são baseados em pré-carregamento de células com uma sonda fluorescente e, em seguida, o controlo da migração do corante a partir da célula ou células carregado para células adjacentes. Técnicas para pré-carregar o corante ter envolvido microinjeção 9, raspar de carga 10 e metil ésteres das sondas 11 . A bisturi de carga-fluorescente de transferência de corante (SL-DT) é uma modificação do método de carga de raspagem - tingir ensaio de transferência desenvolvida pela El Fouly 10. Em vez de a raspagem mais invasivo, o método bisturi carregamento deste relatório envolve um rolo suave de um bisturi com uma lâmina redonda através de uma monocamada de células que minimizam os danos invasiva (figura 1). As vantagens desta técnica são a avaliação toxicológica de uma população de células, em vez de células individuais do ensaio de micro-injecção. Além disso, a simplicidade desta ensaio permite a detecção rápida de várias placas num curto período de tempo enquanto que os métodos que utilizam técnicas e técnicas que usam os ésteres metílicos de sondas fluorescentes microinjecção são significativamente mais demorado e requer consideravelmente mais elevado nível de habilidade.

Embora não haja nenhum método único para atender a todas as necessidades de estudar GJIC; o ensaio de SL-DT é um ensaio simples, relativamente barato e versátil que podesatisfazer muitas das necessidades de avaliações iniciais de toxicidade de diversos compostos. As principais vantagens incluem: simplicidade, não há necessidade especial para o equipamento ou capacidades que são necessários para outros métodos, tais como micro-injecção, recuperação de fluorescência após a fotodegradação de ensaio (FRAP) e activação de locais de ensaios com sondas fluorescentes moleculares, uma avaliação rápida e simultânea da CIJH em um grande número de células, conducente a uma alta taxa de set-up com imagens de fluorescência e análise automatizada microscopia, bem como a sua adaptabilidade para estudos in vivo.

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Protocolo

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O protocolo deste estudo foi aprovado pelo Animal Care e do Comitê Utilização dos Institutos Nacionais de Ciências da Saúde do Japão, que é onde o in vivo experimentos foram feitos, para garantir que os ratos foram tratados com humanidade e com respeito pelo alívio do sofrimento.

1. SL-DT Bioensaio

  1. Semente de 3 x 10 5 WB-F344 células epiteliais de fígado de rato Onto 35 mm placas de cultura de diâmetro contendo Eagles modificado médias mais soro bovino fetal a 5%, e cultivar as células em uma incubadora a 37 ° C, 100% de humidade relativa (HR), 5% CO 2.
  2. Cultivar as células até atingirem 100% de confluência (tipicamente, 2 dias) e realizar o tratamento experimental desejado das células, tal como descrito abaixo.
    1. Conduzir experimentos Dose Response
      1. Adicionar 10 ul e 20 ul de uma solução-mãe 2 mM de fenantreno, em 100% acetonitrilo e 4 mL, 6 uL e 8 uL de uma solução de estoque 20 mM de phenanthrene em 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento para cada volume adicionado de solução de estoque.
      2. Adicionar 4 mL, 6 uL, 8 uL, 10 uL, e 20 ul de uma solução 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento para cada volume adicionado de solução de acetonitrilo para servir como controlo de veículo.
      3. Incubar as placas durante 15 min numa incubadora a 37 ° C, 100% de humidade relativa e 5% de CO 2.
      4. Avance para o passo 1.3.
    2. Experiências de resposta à conduta horárias
      1. Adicionar 7 ul de uma solução de estoque 20 mM de fenantreno, em 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento para cada ponto de tempo (isto é, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
      2. Adicionar 7 ul de acetonitrilo a 100% para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento para cada ponto de tempo para servir como controlo de veículo.
      3. Incubar as placas para cada tempo p designadoonto numa incubadora a 37 ° C, 100% de humidade relativa e 5% de CO 2.
      4. Avance para o passo 1.3.
    3. Conduzir experimentos de tempo de recuperação
      1. Adicionar 7 ul de uma solução de estoque 20 mM de fenantreno, em 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento durante 15 min.
      2. Adicionar 7 ul de acetonitrilo a 100% para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento durante 15 min para servir como controlo de veículo.
      3. Decanta-se o meio contendo o fenantreno ou acetonitrilo e lavar 3x cada uma com 3 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
      4. Adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco a cada placa e incubar durante os tempos de recuperação desejado (isto é, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) numa incubadora a 37 ° C, 100 % de HR e 5% de CO 2.
      5. Avance para o passo 1.3.
    4. Experimentos Mecanismo de Conduta
      1. Adicionar o inibidor da transdução de sinal, isto é,
      2. Adicionar 5 mL de acetonitrilo a 100% para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento durante 15 min para servir como controlo de veículo.
      3. Adicionar 7 ul de uma solução de estoque 20 mM de fenantreno, em 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento mais do D609 para um adicional de 15 min.
      4. Adicionar 7 ul de acetonitrilo a 100% para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento mais acetonitrilo a 100% durante mais 15 minutos adicionais para servir como controlo de veículo.
      5. Avance para o passo 1.3.
  3. Descartar o meio de cultura por ambos os suavemente decantar o meio ou por sucção a vácuo.
    Nota: Descarte meio de cultura contendo resíduos perigosos de forma adequada.
  4. Enxaguar as células três vezes cada uma com 3 ml de PBS e decantar ou seja aspirado entrn lavagens.
  5. Pipete 1 mL de 1 mg / ml de corante Amarelo Lúcifer dissolvido em PBS (LY) em cada placa de células.
  6. Pré-carregar o corante dentro das células por laminagem suavemente uma lâmina de aço cirúrgica # 20, com uma borda arredondada através de uma população de células em três diferentes áreas da placa.
    1. Comece colocando o bisturi perpendicular (90 ° de ângulo) e 5 mm da aresta da placa de cultura, e, em seguida, enrolar o bisturi a partir deste ângulo perpendicular a cerca de um ângulo de 15 ° (ver a Figura 1).
      Nota: Isto é conseguido por beliscar o bisturi entre o dedo indicador eo polegar. Use gravidade para permitir que o bisturi de ir suavemente a partir dos 90 ° a 15 ° posição (como a lâmina arredondada simplesmente rola sobre as células). Este movimento vai deixar uma linha de recuo visualmente perceptível.
  7. Incubam-se as células com a solução LY durante 3 minutos à temperatura ambiente.
  8. Decantar ou aspirar o LY e lavar três vezes com 3 ml de PBS para remover todas as extracellular corante extracelular para eliminar a fluorescência de fundo.
  9. Adicionar 0,5 ml de solução de formalina tamponada com fosfato a 10% para fixar as células.
    Nota: Após a fixação em formol, o ar seco das células e armazenar no escuro por até dois anos com fotobranqueamento mínimo do corante LY. Quando necessário, re-hidratados com uma solução de formalina a 10% para visualizar a frente de corante fluorescente.
  10. Ver as células fixadas utilizando um microscópio de epifluorescência, equipado com um cubo dicróico para picos de excitação / emissão de 428/536 nm com uma ampliação de 200X. Alinhar todas as placas de modo a que a linha de indentação é paralelo ao campo de visão horizontal.
    Nota: Um cubo com FITC dicróico funciona bem.
    1. Capturar a imagem com uma câmera CCD e software de apoio.
      1. Abra o software de suporte para a câmera CCD e usar as configurações de exposição automática. Use o botão "captura" para adquirir digitalmente a imagem. Salve a imagem como arquivos .tif utilizando o botão "Save".

2. Adaptação do SL-DT Ensaio para o tecido do fígado

  1. Retirar a cerca de 2 x 2 cm, fatia do lóbulo esquerdo do fígado de um 5 semanas de idade, do sexo masculino Fischer 344 ratos usando tesouras de dissecação e coloque-o em um plástico pesam prato coberto com gaze molhada 12.
  2. Pipetar 0,5 ml de uma solução de PBS contendo 1 mg / mL de cada um de placa amarela lucifer e rodamina-dextrano (RD) sobre a superfície da fatia de fígado no plástico pesar.
    Nota: O RD é um corante que não pode atravessar os canais de junções de hiato e irá marcar as células que foram carregados.
  3. Adicione três a cinco incisões aproximadamente 1 cm de comprimento na superfície da fatia de fígado, que possui a solução de corante na placa de pesagem com uma lâmina afiada e, em seguida, adicionar corante adicional suficiente para preencher as incisões.
  4. Incubar o tecido durante 3 minutos à temperatura ambiente sobre a placa de plástico pesar.
  5. Lavar três vezes com 5 ml de PBS.
  6. Fixar o ove tecidornight em 30 ml de formalina a 10% tamponada com fosfato em um tubo de centrífuga de 50 mL cónico, no escuro, à temperatura ambiente.
  7. No dia seguinte, lave as fatias com água, cortar o tecido ao redor da incisão com dissecando tesoura em 1 x 1 x 0,5 centímetros 3 tiras e, em seguida, usar técnicas padrão para incorporar as fatias em parafina 13.
  8. Seção as fatias perpendiculares à linha de incisão para espessura de 5 mm e armazenam as amostras no escuro até pronto para ser fotografada usando técnicas de seccionamento padrão com um micrótomo 13.
  9. Use um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera digital CCD de visualizar e capturar as imagens das frentes de corantes fluorescentes de acordo com a secção 1.10 7.

3. Quantificação GJIC

  1. Medir o corante fluorescente propagação usando um pacote de software morfométrica (por exemplo, ImageJ).
    1. Clique na guia "Arquivo" e clique em "Abrir" para abrir osalvo imagem.
    2. Clique em "Ferramenta de Mão Livre" na guia Barra de Ferramentas para traçar o contorno da frente de corante.
    3. Clique na guia "Analisar" e clique em "Measure".
      Nota: Isso irá gerar um valor de área em uma planilha, que pode ser copiado para outros programas de planilha, se desejar.
  2. Usando um programa de folha de cálculo, calcular a fracção do controle (FOC) é calculada dividindo a área da propagação corante na placa experimental pela área do corante percorrida na placa de controlo utilizando a seguinte equação:
    figure-protocol-1
    Um E = área da propagação de corante em células expostas a uma variável experimental, tais como as células tratadas com um produto químico em uma dose ou tempo específico
    Um c = área da difusão do corante no controlo, que são as células tratadas com o veículo utilizado para dissolver a substância química de interesse
    Nota: Para determinar o efeito do veículo,A e seria a área da propagação de corante em células tratadas com o veículo e um c seria a área da propagação de corante em células não tratadas com o veículo. O efeito do veículo deve de preferência ser inferior a 10%.

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Resultados

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Interrupção da GJIC tem sido amplamente utilizada como um biomarcador para identificar compostos tóxicos ao nível genotóxica, epigenética de controle do gene que induz efeitos adversos à saúde 14. Por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são contaminantes ubíquos do meio ambiente, mas variam em suas toxicidades epigenéticas em função das suas estruturas moleculares 15. Os PAHs de baixo peso molecular são normalmente encontrados em concentrações re...

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Discussão

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O ensaio de SL-DT é uma técnica simples e versátil para medir GJIC, mas existem várias preocupações críticas que deveriam ser contabilizados na concepção de protocolos experimentais apropriados. Para medições consistentes de CIJH utilizando o ensaio de SL-DT deve haver um bom corante propagação da LY através de junções das células. No mínimo, um tempo adequado deve ser seleccionado para assegurar que a tinta se espalha através de oito ou mais linhas de células a partir de células de bisturi carregado em ambas as direcçõ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apoiado pelas bolsas NIEHS #R01 ES013268-01A2, e os conteúdos são da exclusiva responsabilidade do autor e não representam necessariamente as opiniões oficiais do NIEHS, e apoiados pelo projeto CETOCOEN UPgrade nº. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células epiteliais do fígado de rato WB-F344Dos Drs. J. W. Grisham e M. S. Tsao da Universidade da Carolina do Norte (Chapel Hill, NC)nenhumaFornecido pelos Drs. J. W. Grisham e M. S. Tsao Universidade da Carolina do Norte-Chapel Hill-NC
Placas de cultura de 35 mmCorning430165
frascos de cultura de 25 cm2Corning430639
Frascos de cultura de 75 cm2Corning430641
D-medium, um meio modificado Eagles ThermoFisher/GIBCO Fórmula No. 78-5470EF
soro fetal bovinoThermoFisher/GIBCO 10437
0,25% de tripsina-EDTA ThermoFisher/GIBCO 15050
tampão fosfato salinacaseiroveja abaixo para o ingrediente cat#'s137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KCl JTBaker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT Baker - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt 3246-01
Lucifer Yellow CH, sal de lítioSigma-Aldrich ChemicalL0259
rodamina-dextranoSigma-Aldrich ChemicalR9379
1-metilantracenoSigma-Aldrich Chemical
phenanthreneSigma-Aldrich ChemicalP11409
resveratrolSigma-Aldrich ChemicalR5010
D609Tocris Biociência 1437
acetonitrilEMDAX0145-1
37% solução formaldeídoJT Baker - Mallinckrodt 2106-01
#20 lâmina cirúrgicaFine Science Tools Inc. 10317-14
Tubos cônicos estéreis de 50 mlThermo scientific 
microscópio de epifluorescência Nikon Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC cubo dicróicoNikon -Mager Scientific96107
câmera CCDNikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ CCD
sistema de imagemNikon -Mager ScientificNikon NIS-Elements F2.2 sistema de imagem.
ImageJInstituto Nacional de Saúdehttp://imagej.nih.gov/ij/
339652

Referências

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