Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

Resumo

Este manuscrito descreve uma técnica suave baseado em litografia para engenharia matrizes uniformes de tridimensional (3D) de tecidos epiteliais geometria definida rodeados por matriz extracelular. Este método é favorável a uma ampla variedade de tipos de células e contextos experimentais e permite o rastreio de alto rendimento de réplicas idênticas.

Resumo

A arquitetura de órgãos ramificados, como pulmões, rins e glândulas mamárias, surge através do processo de desenvolvimento da morfogênese ramificada, que é regulada por uma variedade de sinais solúveis e físicos no microambiente. Descrito aqui é um método criado para estudar o processo de morfogênese ramificada, formando tecidos epiteliais tridimensionais (3D) projetados de forma e tamanho definidos que estão completamente embutidos em uma matriz extracelular (ECM). Este método permite a formação de matrizes de tecidos idênticos e permite o controle de uma variedade de fatores ambientais, incluindo geometria do tecido, espaçamento e composição da MEC. Este método também pode ser combinado com técnicas amplamente utilizadas, como microscopia de força de tração (TFM), para obter mais informações sobre as interações entre as células e o ECM circundante. O protocolo pode ser usado para investigar uma variedade de processos celulares e teciduais além da morfogênese ramificada, incluindo a invasão do câncer.

Introdução

O desenvolvimento de tecidos epiteliais ramificada, conhecidos como ramificação morfogênese, é regulado por, e fatores ambientais físicas derivadas de células. Na glândula mamária, ramificação morfogênese é um processo iterativo pelo qual guiou a migração de células coletiva cria uma arquitetura de árvore. O primeiro passo é a formação de gemas primário dos canais de leite, seguido pela iniciação e alongamento ramo ^1,2. Invasão de filiais no estroma circundante é induzida pela liberação sistêmica de hormônios esteróides na puberdade. Botões novos primários, em seguida, iniciar a partir das extremidades dos ramos existentes, e este processo continua a criar....

Protocolo

1. Preparação de Soluções

1. Para preparar uma solução a 5 mg / ml de insulina, dilui-se a base de insulina em pó com ácido clorídrico a 5 mM (HCl) em dH ₂ O (500 mg de insulina em 100 ml de solvente). Preparação de 100 ml de solvente por adição de 50 ul de HCl concentrado a 100 ml de água destilada _(dH2O).
2. Para fazer uma solução de PBS 1x, dilui-se a solução de reserva 10x de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para 1x com _dH2O sob condições estéreis.
3. Prepara-se o (PDMS) elastómero solução de polidimetilsiloxano como segue: misturar a pré-polímero de PDMS, juntamente com o agente de cura numa propor....

Resultados

Esquemática geral de microfabricação tecido epitelial mamário

Um esquema geral do processo de microfabricação descrição do fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1. O resultado final é uma série de tecidos epiteliais de geometria e espaçamento idênticos que estão completamente encaixadas dentro de um gel de ECM. Uma experiência representativa utiliza rato EpH4 células epiteliais mamarias cultivadas num gel de col.......

Discussão

O protocolo descrito acima descreve um método para produzir tecidos epiteliais idênticos de forma pré-definida, permitindo o controle espacial do estresse mecânico experimentado pelas células no tecido. Um molde elastomérico é usado para criar cavidades no colágeno tipo I que são então preenchidas com células epiteliais e cobertas com uma camada adicional de colágeno, de modo que as células sejam completamente encapsuladas em um ambiente de matriz de colágeno 3D. A cultura adicional desses tecidos e o tratamento com fato.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
PDMS agente de cura	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
mestre de silício com padrão litográfico	de fabricação própria	N/A
Barco de pesagem de plástico	Fisher Scientific	08-732-115
Placas de Petri de 100 mm de diâmetro	BioExpress	D-2550-2
Álcool Etílico 200 Prova	Pharmco-Aaper	111000200	Faça uma solução de EtOH a 70% (v:v) misturando com lâmina de barbear dH2O
	Safety Razor	620179
1:1 Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio: Presunto' s Mistura de Nutrientes F12 (DMEM/F12) (1:1)	Hyclone	SH30023FS
Fetal Soro Bovino (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' s solução salina balanceada (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulina	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicina	Life Technologies	15750-060
10x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Bovino colágeno tipo I (não pepsinizado)	Koken	IAC-50
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Pinças curvas de aço inoxidável	Dumont	7
placas de cultura de tecidos de 35 mm de diâmetro	BioExpress	T-2881-6
tubos cônicos de 15 ml	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Tubo de Trava de Cofre	USA Scientific	1615-5500
Lamínulas de vidro #1 circulares, 15 mm de diâmetro	Bellco Glass Inc.	Pedido
0,05% 1x Tripsina-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldeído	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Detergente
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Ressuspenso em dH2O a 50 mg/ml
Anticorpo FAK de coelho anti-rato	Vida útil Tecnologias	AMO0672
Cabra anti-coelho Alexa 488 anticorpo	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Usado para mapas de frequência de pixel de codificação de cores.
FIJI (ImageJ)NIH		N/A	Software de análise de imagem gratuito usado para limitar, registrar e sobrepor imagens para criar um mapa de frequência de pixels. O plugin StackReg foi usado para registrar imagens binárias.