Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

Vários relatórios têm discutido o desenvolvimento de métodos de extracção aplicada sobre papel ou à base de membrana para uso em point-of-care (POC) dispositivos ^1-5 com o objectivo de tornar a requintada sensibilidade e especificidade do diagnóstico molecular disponíveis para todos. A Organização Mundial de Saúde (OMS) Doenças Sexualmente Transmissíveis Diagnostics Iniciativa cunhou o termo assegurada (, sensível, específico, rápido e robusto, livre de Equipamentos e entregue a quem precisa fácil utilização acessível) para descrever as características ideais de um POC teste ^6. Destas orientações, a característica livre de equipamento é particularmente difícil de conseguir para diagnóstico molecular. No entanto, todas as inovações no campo vai avançar o objetivo de alcançar os mais necessitados, e não há esperança para melhorias de curto prazo no desempenho do teste, adaptando a tecnologia existente ^7.

Descrevemos aqui um protocolo simples para a extracção de ADN a partir de sangue inteiroque não requer a química complexa ou instrumentação de laboratório. A FINA (isolamento filtração de ácidos nucleicos) método de preparação da amostra foi originalmente desenvolvido para extrair o ADN de leucócitos a partir de sangue total, a fim de detectar o pró-vírus de HIV-1 como parte de um ponto de atendimento (POC) de amostra-para-resposta de PCR quantitativa plataforma (qPCR) no início infantil de diagnóstico (EID) para uso em ambientes de recursos limitados ^8-11. Extracção FINA difere dos métodos de purificação convencionais que utilizam membranas de sílica ou partículas paramagnéticas revestidas de sílica para se ligar reversivelmente o DNA na presença de ¹² agentes caotrópicos. Em vez disso, utiliza FINA verticais filtração através de uma membrana de separação para extrair o ADN celular directamente a partir de sangue total. A membrana contendo o ADN retido pode ser colocada directamente num tubo de PCR e, ou imediatamente utilizados numa reacção de PCR ou seco ao ar para amplificação posterior ^9. Sem caotrópicos agentes, fenol, ou álcoois são utilizados na extracção da amostra, EliminaTing os extensos passos de lavagem necessários para remover inibidores potentes qPCR derivadas do processo de extracção ^13,14.

A membrana FINA pode capturar tanto células ⁹ ou ADN genómico libertado por lise ^da célula ¹¹ antes que a amostra é adicionada à membrana. Para a captura de células, sangue total é adicionado directamente à membrana. As células são subsequentemente lisadas na membrana através da adição de NaOH a 10 mM. A vantagem deste método é que ele envolve apenas três passos: 1) a adição da amostra; 2) lise celular / lavagem e 3) a colocação disco de filtro no tubo de qPCR. A desvantagem deste método é que a membrana pode conter apenas um número definido de células directamente proporcional ao diâmetro do disco de membrana. Para atingir o limite de detecção requerido para Eid, 100 uL de sangue total é necessária para a entrada de amostra, o que implica um filtro que é demasiado grande para ser colocada num tubo de qPCR. Lisar as células do sangue com o detergente antes da adição da amostra para a recolhamembrana adiciona uma etapa de processamento, mas permite o uso de um filtro mais pequeno para o mesmo tamanho da amostra. Fomos capazes de demonstrar a alta reprodutibilidade, detecção de cópia única, e quantificação de menos de 10 cópias do HIV-1 DNA proviral de 100 l de sangue usando esta configuração de teste ^11.

Neste relatório, nós descrevemos o protocolo FINA como originalmente desenvolvido para uso em laboratório. A sanduíche de membrana / filtro conhecido como o módulo de preparação de amostra FINA pode ser preparado em grandes lotes e armazenadas para uso posterior. Quando as amostras são para ser extraído este processo leva 2 min e pode ser realizada em vários lotes de tamanho. A qPCR pode ser executado imediatamente ou os filtros que contenham o ADN incorporado pode ser armazenado até que seja conveniente para realizar qPCR. Este método é muito conveniente para a análise de rotina de amostras em ambas as configurações de baixa e alta de recursos.

declaração de ética: amostras de sangue total utilizados neste estudo não são considerados pesquisa envolvendo seres humanos. Os espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico clínico, que foram satisfeitos, eo restante destes espécimes foi fornecido para o ensaio de pesquisa FINA. As amostras foram codificadas de modo a que os investigadores não foram capazes de determinar facilmente a identidade dos indivíduos.

1. Preparação da FINA Amostra Módulo Preparação

1. Prepare absorvente pad cortando um 35 x 35 mm ² de um 2,6 mm de espessura almofada de algodão 100%. Corte um pad por espécime.
2. Prepare a película de parafina de plástico com uma fita de papel de suporte por uma peça de corte da película de parafina (de 25 mm (H) por 50 mm (W)) e, em seguida, perfurando um orifício de diâmetro 7,14 milímetros, no centro da fita usando um furador conduzido martelo. Prepare uma fita por espécime.
3. Prepare uma membrana de separação de sangue de vidro ligado (membrana de captura) de disco perfurando um círculo 8,35 mm de diâmetrousando um furador impulsionado martelo. Perfurar um disco por espécime. O disco tem uma capacidade de retenção de partículas de 2,3 | im.
4. Montar o módulo de preparação de amostra FINA, colocando o disco de captura no centro da almofada de blotting usando uma pinça. Colocar a fita da película de parafina sobre o disco de captura de modo que o orifício da fita parafina deixa o centro do disco de captura exposta.
5. Garantir o contato máximo entre o disco eo mata-borrão, esticando a fita de parafina ligeiramente para cobrir o mata-borrão e pressionando a fita de parafina com firmeza para colá-la ao mata-borrão em torno de todas as bordas do disco.
6. Faça como muitos módulos conforme necessário para o experimento ou estoque para uso futuro.

2. Preparação de qPCR Tubo

1. Prepara-se uma fita de disco 5,1 milímetros que vai ancorar a membrana de captura de células para o lado do tubo de qPCR para evitar que a membrana bloquear a detecção por fluorescência perfurando um círculo de polye com revestimento duploster fita de diagnóstico com um punção accionado martelo a partir de uma folha de a fita. Prepare um disco de fita por espécime.
2. Retire um lado do forro da etiqueta da fita. Colocar a fita para um tubo de PCR de 200 ul, aderindo-o para um lado e para o fundo do tubo. Remova o segundo forro etiqueta. O tubo está agora pronto para receber disco preparado.
3. Produzir tantos tubos, como necessário para a experiência ou reserva para uso futuro.

3. Contrive amostra de sangue

Nota: Se um espécime verdadeiro teste está sendo preparado, vá para a etapa 4.

1. Células descongelamento 8E5-LAV ¹⁵ que abrigam uma única cópia dos pró-vírus HIV-1 obtidos a partir do Virology Quality Assurance Laboratory (VQA; Ponta Presbyterian / St Centro de Luke Medical, Chicago, IL.).
   Nota: São armazenados como sedimentos celulares congelados a uma concentração de 4000 células / ml. A contagem de células foi verificada como descrito anteriormente ^9.
2. Prepare Sorial de diluição em meio de congelação (90% de soro bovino fetal, 10% de dimetil sul f óxido) a concentrações que variam de 1 a 400 células / mL.
3. Pipetar 10 ul de células de cada uma das diluições em série para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 100 ul de EDTA negativo amostra de sangue inteiro fresco HIV-1 tratado a cada tubo para criar uma curva padrão de 8E5-LAV 10-4,000 números de cópias. Misture sacudindo suavemente o fundo do tubo 5 vezes.

4. Execute FINA Extração

1. Lisar células sanguíneas por adição de Triton-X100) para uma concentração final de 1% (11 ul 10% de Triton-X100 a 110 ul de sangue completo ou células provenientes de passo 3.3).
2. Misture sacudindo suavemente o fundo do tubo 5 vezes. O sangue deve ficar vermelha translúcida.
3. Pipeta de todas as amostras de sangue para o disco de captura.
   Nota: Uma vedação estanque à água entre a fita de parafina e a membrana de captura assegura que o sangue flui através da membrana, e um bom contacto entre a captura membrane e mata-borrão conjunto da almofada garante a absorção da amostra rápida.
4. Deixar a amostra para absorver através do filtro.
   Nota: As mechas de lisado de sangue para o mata-borrão, devido à acção capilar, capturando o ADN genómico na superfície do disco de captura. O ligado foi embebido no disco quando ele aparece fosco.
5. Adicionar 600-1,000 ul NaOH 10 mM gota a gota para o disco de captura.
   Nota: O tampão de lavagem, também podem ser adicionados como uma adição em massa de 600 ul. O tampão formará uma gota sobre a fita de parafina hidrofóbico e pavio através do orifício para o disco em cerca de 20 seg. O filtro irá mudar de vermelho para apuramento indicando branco da hemoglobina.
6. Separa-se o disco a partir do mata-borrão com uma pinça e aplicar o disco à fita no tubo de PCR preparados. Se houver qualquer cor vermelha retido no filtro adicionar 50-100 ul de tampão de lavagem para limpar o filtro, antes de colocar no tubo.
   Nota: Raramente, o excesso de pressão aplicada durante a preparação daa FINA módulos resultado em particionamento das camadas de membrana durante a separação do mata-borrão. Descartar esses discos e preparar uma amostra fresca.
7. Após o filtro é colocado no tubo de PCR, a análise das amostras de imediato. Alternativamente, secar durante a noite em uma caixa contendo sulfato de cálcio dessecante, em seguida, cap e coloque em uma bolsa de alumínio com dessecante de sílica e armazenar até que esteja pronto para análise.

5. qPCR Reaction

1. Preparar 100 ul qPCR Master Mix por reacção usando HIV iniciadores e sondas específicas como descrito anteriormente ^9,11. Incluir um controlo interno de amplificação para monitorizar a presença de inibidores de amplificação e para verificar que uma amostra negativa é um verdadeiro negativo. Certifique-se de que o filtro é completamente coberto com a mistura principal e que o filtro fica fixo ao lado do tubo ao longo da reacção.
2. Efectue a amplificação utilizando um dispositivo de PCR em tempo real como descrito anteriormente ^9.

O fluxo de trabalho para a extracção de ADN proviral de sangue total enriquecida com células 8E5-VAE é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra o módulo da amostra FINA e preparado tubo qPCR. Este método permite a amplificação eficiente de VIH-1 a partir de células pró-vírus LAV-8E5 em diferentes números de cópias, tal como mostrado na curva padrão de espécimes artificiais (Figura 3). PCR teve uma eficiência de 103%, como calculado a partir Eficiência = -1 + 10 (-1 / inclinação). Equação da reta foi y = -3.25x + 27,95, com uma correlação de R² = 0,996. A curva padrão de ADN proviral de VIH replica também têm amplificação altamente reprodutível, como evidenciado na Tabela 1. Adicionalmente, um controlo interno de 500 cópias Hydroxypyruvate Redutase está presente para mostrar que não há nenhuma inibição da PCR resultante de extracção de sangue com FINA, independente do número de cópias do HIV-1 provirus presentes (A Figura 4). amplificação CI foi obtido de forma eficiente em todas as 18 amostras testadas, com uma média de Cq 21,92 ± 0,25 e um CV de 1%.

Figura 1: Fluxo de trabalho para a detecção de DNA pró-viral do sangue total enriquecida com células 8E5-LAV para qPCR. (A) a partir da esquerda para a direita, o módulo de FINA preparado, depois o sangue é adicionado à membrana de captura e depois de tampão de lavagem foi adicionado. Tubos (B) qPCR com discos de captura de presas de fita dupla revestida com mistura principal qPCR acrescentou. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: FINA módulo in-house e preparação tubo qPCR. (a) um disco de membrana de captura de diâmetro 8,35 mm foi ensanduichada entre um quadrado 707 mata-borrão e uma folha fina de fita de parafina contendo um orifício de 7,14 mm de diâmetro no centro de modo a que o furo da fita de parafina foi centrado sobre o disco de captura para a aplicação direta de sangue lisadas por pipeta. (B) Uma fita de diagnóstico de poliéster 5,1 milímetros duplo revestimento está preso no lado de 200 tubo de qPCR ul. O segundo forro da fita é removida para expor a superfície adesiva para aplicação de disco de captura quando estiver pronto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:. Curva padrão de espécimes inventados HIV-1 DNA proviral parcelas de amplificação (A), obtidos a partir de 100 ul de 4 repetições de HIV-1 NEgativos sangue total enriquecida com 4.000, 400, 40 e 10 células 8E5-LAV com 500 cópias / reacção dos controles internos linhas sólidas = parcelas de amplificação; linha pontilhada = limiar. Eixo Y representa as unidades de fluorescência e o eixo X é o número do ciclo de qPCR. (B) curvas padrão de valores Cq calculado a partir trama de amplificação versus o número de cópia log de ​​células 8E5-LAV por 100 ml de sangue total. Equação da reta: y = -3.25x + 27,95; R = 0,996; Eficiência da PCR = 103,23%, calculada através de Eficiência = -1 + 10 (-1 / inclinação) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Controle interno indica que não há qPCR inibição 500 cópias Hydroxypyruvate redutase Amplification plasmídeo controle adicionado por reacção.. Sólidolinhas = terrenos de amplificação; linha pontilhada = limiar. Média Cq de IC = 21,92 ± 0,25. CQS variou 21,21-22,32. Coeficiente de variação (CV%) = 1%; N = 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Média Cq, desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV%) de 4.000, 400, 40 e 10 cópias de curva padrão 8E5-LAV com extracção FINA e HIV-1 iniciadores específicos e sondas. N = 4. WB = sangue total.

Os autores não têm nada a divulgar.