Artigo de método

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

DOI:

10.3791/54296

⸱

18 de outubro de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo compara dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para obtenção de células dendríticas (DCs) in vitro. Os monócitos são selecionados por aderência ou enriquecidos negativamente por separação magnética. O rendimento e a viabilidade de monócitos, juntamente com a viabilidade, proliferação e expressão de marcadores de superfície CD11c/CD14 do MDDC, serão comparados entre os dois métodos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos do sistema imunológico que desempenham um papel crucial nas respostas dos linfócitos, nos mecanismos de defesa do hospedeiro e na patogênese da inflamação. O isolamento e o estudo das DCs têm sido importantes na pesquisa biológica devido às suas características distintivas. Embora sejam mediadores-chave essenciais do sistema imunológico, as DCs são muito raras no sangue, representando aproximadamente 0,1 - 1% do total de células mononucleares do sangue. Portanto, as alternativas para os métodos de isolamento dependem da diferenciação de DCs de monócitos isolados de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). A utilização de técnicas de isolamento adequadas que combinam simplicidade, acessibilidade, alta pureza e alto rendimento de células é imperativa a ser considerada. No presente estudo, dois métodos distintos para a geração de CDs serão comparados. Os monócitos foram selecionados por adesão ou enriquecidos negativamente usando o procedimento de separação magnética seguido de diferenciação em DCs com IL-4 e GM-CSF. A viabilidade, proliferação e fenótipo de monócitos e MDDC foram avaliados usando corantes de viabilidade, ensaio de MTT e análise de marcadores de superfície CD11c/CD14 por citometria de fluxo de imagem. Embora o método de separação magnética tenha produzido uma porcentagem significativamente maior de monócitos com maior capacidade proliferativa quando comparado ao método de adesão, os achados demonstraram a capacidade de ambas as técnicas de gerar simultaneamente monócitos capazes de proliferar e se diferenciar em MDDCs CD11c+ viáveis após sete dias em cultura. Ambos os métodos produziram > 70% de MDDCs CD11c+. Portanto, nossos resultados fornecem insights que contribuem para o desenvolvimento de métodos confiáveis para isolamento e caracterização de DCs humanas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células dendríticas (CDs) são mediadores essenciais dos sistemas imunitários inato e adaptativo. Eles funcionam para induzir respostas imunitárias primárias e facilitar o desenvolvimento de memória imunológica. Estas células são os principais responsáveis para a captura de antígeno, migração e estimulação das células T e, portanto, são chamados de células apresentadoras de antígenos, como profissionais (APCs) 1 .Manipulation de DCs poderiam ser utilizados em uma ampla variedade de campos de pesquisa e na prática clínica para o tratamento diferente doenças inflamatórias, tais como o VIH 6,7, 8 cancro, doenças auto-imunes, 9 e 10 respostas alérgicas. DCs também estão sendo usados para a investigação de abuso de substâncias, a fim de resolver os mecanismos desconhecidos e vias, tais como aqueles associados à dependência de álcool 11-14, dependência de drogas 13,15, ea combinação de infecção e abuso de substâncias HIV 16-19. Estes estudos em curso e futuros estudos in campo da imunologia fazer na geração in vitro de DCs extremamente importante para a investigação. No entanto, existem várias dificuldades associadas com o isolamento de DC a partir do sangue humano como elas constituem apenas 0,1-1% do total de células mononucleares de sangue 20.

Até à data, alguns dos métodos bem estabelecidos para a geração de DC in vitro consiste em plástico ou vidro aderência de monócitos 21,22, centrifugação em gradiente de densidade de 23, a separação com base marcador específico, tais como triagem de células activadas magnética 22, triagem de células activadas fluorescentes 24, a selecção positiva de monócitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas revestidas com dextrano 25, e isolamento rápido de monócitos altamente purificados através de selecção celular negativa totalmente automatizado 26. No entanto, o melhor método de escolha permanece controverso. Portanto, para melhorar as técnicas de geração de DC, vários métodos têm sido desenvolvidos nos quaiso grau de pureza destas células pode ser aumentada pela diferenciação de células progenitoras CD34 + purificadas e os monócitos isolados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) 27. Como mencionado antes, um método amplamente utilizado e popular para a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) é explorar a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) 21,22,27. O método de aderência é um método rápido e simples que não requerem o uso de equipamento complexo. No entanto, algumas desvantagens deste processo incluem a contaminação de linfócitos, baixa flexibilidade, e monócitos manipulação transitória 28. Um método alternativo para o método de aderência é o isolamento magnético de monócitos a partir de PBMC totais, particularmente com o uso de um kit de enriquecimento de monócitos humanos, que se destina a isolar os monócitos a partir de PBMC por selecção negativa 26. Durante este procedimento, as células não desejadas são dirigidos para a remoção com tetraméricacomplexos de anticorpo e as partículas magnéticas revestidas com dextrano. A vantagem deste método de isolamento é que as células marcadas não desejados são separados usando um íman enquanto as células alvo podem ser vertida livremente fora para um novo tubo sem a necessidade de colunas. Até à data, com a disponibilidade de anticorpos monoclonais específicos que pode marcar populações de células únicas, a técnica de separação magnética tornou-se não só de um método adicional, mas também uma necessidade para o isolamento de células raras no campo da imunologia. Por exemplo, técnicas como a célula magnética triagem com paramagnéticas MACS-nanopartículas disponíveis comercialmente têm facilitado o desenvolvimento de novas abordagens para a investigação e aplicações clínicas 22,29. Além disso, estudos recentes que compararam geração de DC a partir de métodos de aderência de monócitos e tecnologia MACS têm demonstrado uma maior pureza DC e viabilidade usando MACS monócitos 22,30 separados.

Os presentes estudos atuaisuma comparação entre dois métodos para a geração de DC humanas a partir de monócitos isolados a partir de PBMC: 1) isolamento de monócitos por adesão e 2) isolamento de monócitos por selecção negativa utilizando um kit comercial de enriquecimento de monócitos humanos. Este estudo fornece evidências para mostrar que o processo de separação negativa selecção magnética para isolar monócitos gera o maior rendimento de monócitos com nenhuma diferença significativa na viabilidade de monócitos, quando comparados com os monócitos isolados pelo método de aderência. Por sua vez, depois de sete dias, os monócitos isolados por separação magnética diferenciada em MDDCs com significativamente maior capacidade proliferativa e maior quantidade de células que expressam duplo positivo (CD11c + / CD14 +) fenótipo sem afectar a viabilidade MDDC. No geral, o presente estudo difere dos estudos anteriores referidos acima, uma vez que demonstra a capacidade de ambas as técnicas para gerar, simultaneamente, os monócitos que são capazes de proliferar e de se diferenciar em CD11c +MDDCs (> 70%) após sete dias em cultura, sem comprometer a sua viabilidade. Além disso, a abordagem actual fornece pela primeira vez caracterização de diferentes populações CD11c / CD14 MDDCs por citometria de fluxo de imagem.

Em resumo, uma vez que as DCs desempenhar um papel central em relação à investigação no domínio da imunologia, diferentes parâmetros devem ser tomadas em consideração quando se considera como eles são derivados e métodos que são utilizados para isolar e cultivar-los in vitro. Portanto, este estudo tem como objetivo fornecer informações em dois métodos diferentes de isolamento de monócitos e como esses métodos afetam diferencialmente viabilidade de monócitos e de rendimento, eventualmente, afetar a viabilidade das células dendríticas, proliferação e fenótipo. Estes resultados irão contribuir significativamente para o campo da imunologia e irá proporcionar um protocolo detalhado de DC isolamento, purificação, e caracterização.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

estudos de sangue humano em geral têm sido revistos e aprovados pelo Institutional Review Board (IRB) da FIU, o protocolo IRB aprovação # IRB-13-0440. leukopaks humanos foram adquiridos a partir do banco de sangue da comunidade em Miami, FL.

1. Isolamento de PBMC pela técnica de gradiente de densidade padrão

  1. Efectuar uma diluição de 1: 1 de sangue com solução salina 1x com fosfato tamponada num frasco T75.
  2. Pipetar 15 ml de solução de gradiente de densidade em 50 ml de tubos de centrífuga e cuidadosamente camada (25 - 30 ml / tubo) do sangue diluído ao longo deste gradiente.
  3. Centrifugar durante 20 minutos a 1200 xg, com uma aceleração e desaceleração do de 0.
  4. Após centrifugação, recolher a camada de interface (células brancas do sangue) em 50 ml de um novo tubo de centrífuga e lavar as células duas vezes em PBS (3 min a 1080 xg). Elimine o sobrenadante de cada vez.
  5. as células com tampão de lise de cloreto de amónio-potássio-(ACK) tratar (para lisar os glóbulos vermelhos). Adicionar 10 ml de tampão e emCubate durante 15 min a 4 ° C.
  6. Lavar as células duas vezes com PBS, centrifuga-se durante 3 min a 1080 xg e elimine o sobrenadante de cada vez.
  7. Guardar o sedimento, que conterá as PBMC.
  8. Proceda com método de purificação de monócitos de escolha.

2. Método de Monócitos A purificação por aderência

  1. Prepare meio de cultura celular completo, contendo L-glutamina (300 mg / ml) e suplementado com penicilina (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) e soro fetal bovino a 10%.
  2. Permitir PBMC a aderir durante cerca de 2 horas através da sua cultura num frasco de T75 a uma concentração de 5 x 10 7 células por 10 ml de meio completo a 37 ° C e 5% de CO2 num incubador humidificado.
  3. Após a incubação, remover as células flutuantes não aderentes da garrafa de cultura e lavar cuidadosamente as células aderentes duas vezes com PBS.
  4. Incubar as células aderentes no meio de cultura celular completo suplementado com 2 ul / ml de granulócitos humano-macrophage factor de estimulação de colónia (GM-CSF) e interleucina 4 (IL-4), armazenado a uma concentração de estoque de 10 jig / ml.
  5. Alterar a metade do meio e reabastecer citocinas cada 48 horas.
  6. Permitir 5 - 7 dias para a diferenciação de monócitos em MDDCs.

3. Método de Monócitos A purificação por separação magnética

  1. Recolhe CMSPs de técnica de gradiente de densidade padrão, verter para um tubo de poliestireno de 5 ml e re-suspensão em tampão de PBS a uma concentração de células / ml.
  2. Adicionar cocktail de enriquecimento de células de monócitos humanos utilizando 50 uL / ​​mL, misturar bem e incubar a 4 ° C durante 10 min.
  3. Após a incubação, adicionar partículas magnéticas, utilizando células 50 uL / ​​mL, misturar bem e incubar a 4 ° C durante 5 min.
  4. Trazer a suspensão celular até um volume total de 2,5 ml por adição de tampão PBS, misturar bem por pipetagem para cima e para baixo 2 - 3 vezes.
  5. Colocar o tubo de poliestireno sem uma tampa para o dispositivo magnético e deixada em repouso à TA durante dois0,5 min.
  6. Após a incubação e, em um movimento contínuo, pegar o imã e despeje a fração de monócitos purificado desejado em um 50 ml tubo de centrifugação limpo.
  7. Incubar as células aderentes no meio completo de cultura de células suplementado com 2 ul / ml de factor estimulante de colónias (GM-CSF) de granulócitos-macrófagos humanos e de interleucina 4 (IL-4), armazenado a uma concentração de estoque de 10 jig / ml.
  8. Cada 48 horas, mudar metade do meio, spin para baixo em 1080 xg durante 5 minutos e re-suspender pellet com as novas mídias (cRPMI) e citocinas.
  9. Permitir 5 - 7 dias para a diferenciação de monócitos em MDDCs.

4. Azul de Tripano ensaio de exclusão de Viabilidade

Nota: Use esta técnica para obter rendimento celular e viabilidade de PBMC, monócitos e MDDCs.

  1. Células colheita usando o padrão tripsina-EDTA e executar lavagens dos frascos e o sedimento de células utilizando PBS. Dependendo do tamanho do grânulo, resuspender em 5 a 10 ml de PBS para dissolver o sedimento.
  2. Num tubo de micro-centrifugação, efectuar uma diluição 1: 1 de reagente azul de tripano com sedimento celular diluído.
  3. A partir desta mistura, uma alíquota de 10 ul em uma célula de contagem corrediça e ler os resultados usando um contador de células automatizado de acordo com o protocolo do fabricante. Se um contador de células automatizado não está disponível, uma contagem de células semelhante é possível utilizando um hemocitómetro ou um contador manual.

Ensaio 5. MTT

  1. As células em placas a uma concentração de 4 x 10 4/100 ul de meio completo a cada poço numa placa de 96 poços. Permita 24 horas para as células a ajustar à cultura.
  2. Incubar e efectuar leituras a 0 (dia 0), 36 (dia 3) e 84 (dia 7) horas, respectivamente.
  3. No final da incubação desejado, remover a mídia e substituir com 100 ul de PBS sozinho.
  4. Preparar 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio solução de brometo (MTT) (5 mg / ml) por adição de 10 ml de dimethsulfóxido il (DMSO) a 1 g de sulfato de dodecilo de sódio (SDS).
  5. Adicionam-se 10 ul (5 mg / ml) de uma solução de MTT a cada poço e incubar a 37 ° C durante 2 horas adicionais.
  6. Após a incubação, remova sobrenadantes que contêm PBS e mistura MTT não convertidos (solução amarela-cor).
  7. Adicionar 100 ul de solução de SDS-DMSO a cada poço e incubar durante uma hora adicional.
  8. Ler a absorvância a 540 nm utilizando um leitor de microplacas.

6. Análise de Coloração da superfície celular por citometria de fluxo de imagem

  1. Após 7 dias de diferenciação de monócitos purificados, dispensar 1x10 6 alíquotas de células das células dendríticas derivadas de monócitos para o número apropriado de tubos de 1,5 ml.
  2. Comece a coloração da superfície celular por células de bloqueio, utilizando 50 ul de calor inactivados (HI) de soro humano, incubar a 4 ° C durante 10 min.
  3. Após a incubação, as células centrifugar a 720 xg durante 5 minutos, rejeitar o sobrenadante.
  4. A célula pellet, adicionar respectivos anticorpos fluorocromo-conjugados (por exemplo, anti-CD11c ou anti-CD14) e incubar a 4 ° C durante 20 minutos ao abrigo da luz. Em tubos separados, prepare individuais manchado de fluorocromos amostras / ml), uma vez que são necessários para a compensação.
  5. Após a incubação, lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão PBS e centrifugação de cada vez a 720 xg durante 5 min.
  6. As células protegidas da luz Mantendo, re-suspender em tampão de PBS a uma concentração de células / 100 ul para análise de citometria de fluxo.
  7. A fim de porta em células viáveis, adicionar 1 ml de DAPI a cada tubo antes de adquirir as células no fluxo de imagens de células única citometria de instrumento de acordo com as instruções do fabricante.

7. Análise estatística

  1. Entrada de todos os dados em uma planilha.
  2. Comparar resultados utilizando t-teste do estudante e / ou one-way ANOVA, conforme apropriado.
  3. Considerar as diferenças estatisticamente significativas se p <0,05.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rendimento de monócitos por separação magnética é superior em comparação com monócitos Rendimento pelo Método A adesão

Os dados apresentados na Figura 1 PBMC exibição e as contagens de células de monócitos pelo método de exclusão de azul de tripano no dia do isolamento de PBMCs e separação de monócitos. Em média, os monócitos isolados pelo método de adesão responsáveis ​​por aproximadamente 6,...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com base nas dificuldades conhecidas de isolar e gerando MDDCs de sangue humano, o presente estudo teve como objetivo fornecer uma comparação global dos dois métodos bem estabelecidos para a geração de MDDCs. O primeiro método de comparação é um método tradicional bem estabelecida para gerar MDDCs, explorando a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) 21,22,27. O método de aderência é rápido e de baixo custo, e não requer o uso de equipamento complexo. No entanto, alg...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os autores não divulgam interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa é apoiada pelo Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo, prêmio K99/R00 AA021264. Suporte laboratorial adicional como parte do pacote inicial foi recebido do Departamento de Imunologia, Instituto de Farmacologia Neuroimune, Faculdade de Medicina Herbert Wertheim e FIU- Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento Econômico. Gianna Casteleiro foi apoiada pelo NIH / NIGMS R25 GM061347. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-5442-03Deve ser usado em RT
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Life Technologies10010-023
ACK Tampão de lisingQualidade Biológica118-156-101
RPMI 1640 meioLife Technologies22400-089
Antibiótico-Antimicótico (100x)Life Technologies15240-062
Soro Fetal Bovino (FBS)Life Technologies16000-044
RoboSep tampãoStemCell20104
EasySep Kit de enriquecimento de monócitos humanosStemCell19059
TC20 Contador de células automatizadoBio-Rad145-0101
FITC-DextranSigma AldrichFD4-100MG
Mancha azul de tripano (0,4%)Life Technologies15250-061
Leitor multimodo Synergy 2Biotek7131000
XTT Biorreagente de sal de sódio (XTT)Sigma AldrichX4626-100MG
Biorreagente de dimetilsulfóxido (DMS)Sigma AldrichD8418-500ML
Brometo de tetrazólio azul de tiazolila (MTT)Sigma Aldrichm5655-500MG
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)Bio-Rad161-0302
Metossulfato de Fenazina (DMSO)Sigma AldrichP9626-1G
Inativado (HI) Soro HumanoChemiconS1-100ML
Accuri C6 Citômetro de FluxoBD Accuri653119
FlowSight Amnis Citômetro de FluxoEMD Millipore100300

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  4. Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
  5. Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
  6. Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
  7. Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
  8. Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
  9. Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
  10. Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
  11. Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
  12. Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
  13. Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).
  14. Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
  15. Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
  16. Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682(2013).
  17. Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
  18. Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
  19. Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
  20. Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
  21. Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
  22. Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
  23. Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
  24. Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
  25. Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
  26. Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
  27. Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
  29. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  30. El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
  31. Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
  32. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
  33. Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
  34. Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
  35. Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
  36. Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
  37. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
  38. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
  39. Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
  40. Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Monocyte IsolationDendritic Cell GenerationImaging Flow CytometryMagnetic SeparationAdherence MethodCD11c CD14 AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsHuman Monocyte DifferentiationViability Proliferation AssessmentSingle Cell Analysis

Artigos relacionados