A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Summary

A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo.

Abstract

Durante a última década tem havido um ressurgimento do uso de protoplastos vegetais que variam de espécie para espécie vegetal modelo, para análise de vias de sinal de transdução, redes reguladoras da transcrição, a expressão do gene, genoma, e de edição de gene silenciador. Além disso, o progresso significativo tem sido feito para a regeneração de plantas a partir de protoplastos, o que tem gerado ainda mais o interesse na utilização destes sistemas para genoma das plantas. Neste trabalho, um protocolo tem sido desenvolvido para a automatização de isolamento de protoplastos e transformação de cultura em suspensão de tabaco um 'amarelo brilhante' 2 (A-2), utilizando uma plataforma robótica. Os procedimentos de transformação foram validados utilizando um gene repórter da proteína fluorescente laranja (OFP) (pporRFP) sob o controlo do promotor 35S do mosaico da couve-flor vírus (35S). OFP expressão em protoplastos foi confirmada por microscopia de epifluorescência. As análises também incluiu métodos de eficiência de produção de protoplastos usando propidium iodeto. Finalmente, as enzimas de grau alimentar de baixo custo foram usadas para o procedimento de isolamento de protoplastos, evitando a necessidade de enzimas laboratório-grade que são um custo proibitivo em high-throughput automatizado isolamento de protoplastos e análise. Com base no protocolo desenvolvida no presente trabalho, o procedimento completo de isolamento de protoplastos para transformação pode ser realizada em menos de 4 horas, sem qualquer entrada a partir do operador. Embora o protocolo desenvolvido neste trabalho foi validado com a cultura de células A-2, os procedimentos e métodos podem ser traduzidas a qualquer sistema de cultura em suspensão planta / protoplasto, o que deverá permitir a aceleração da pesquisa genómica de culturas.

Introduction

Nos últimos anos tem havido um impulso significativo colocado sobre a concepção de culturas transgênicas para superar várias doenças ^1, dotar resistência a herbicida ^2, conferem seca ^3,4 e tolerância ao sal ^5, evitar herbivoria ^6, aumentar a produção de biomassa ^7, e diminuir a recalcitrância da parede celular ^8. Esta tendência foi ajudada pelo desenvolvimento de novas ferramentas moleculares para a geração de plantas transgénicas, incluindo genoma de edição utilizando CRISPR e TALENS ^9, e silenciamento de genes por meio de ARNcd ^{de 10, 11} miARN, e ARNsi

Protocol

1. Estabelecimento de culturas de células em suspensão

1. Prepara-líquido, por 2 meios adicionando 4,43 g Linsmaier e Skoog, meio basal de 30 g de sacarose, 200 mg _de KH ₂ PO _4, e 200 g de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 900 mL de água destilada de água e o pH para 5,8 com 0,1 M KOH. Depois de ajustar o pH, ajustar o volume final a 1000 mL com água destilada e autoclave. Os meios podem ser armazenado até 2 semanas a 4 ° C.
2. Inocular um frasco Erlenmeyer de 250 mL com 100 ml de líquido BY-2 meios de comunicação e um única peça de BY-2 de calo (> 1 cm em diâmetro) cultivadas num sólido por-dois meios (líquido B....

Results

No presente estudo, a taxa de duplicação de BY-2 variou entre dependente da temperatura à qual as culturas foram incubadas, consistente com relatórios anteriores de uma duração do ciclo celular médio de 15 h 14-18 h. Com esta taxa de duplicação, de 1: 100 a partir de inoculo foi utilizado para iniciar culturas, levando a culturas com um volume empacotado de células (PCV) de 50% em 5-7 dias. No protocolo actual, em que as culturas foram cultivadas em 200 ml de meio, o hematócrito de 100 m.......

Discussion

O protocolo acima descrito foi validada com êxito para o isolamento de protoplastos, enumeração e transformação usando a cultura de células em suspensão BY-2 de tabaco; No entanto, o protocolo pode ser facilmente estendida a qualquer planta de cultura em suspensão. Actualmente, o isolamento e transformação de protoplastos foi alcançado em numerosas plantas, incluindo o milho (Zea mays) ^10, cenoura (Daucus carota) ^32, álamo (Populus euphratica) ^33, de uva (V.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbitor RS Transportador de microplacas	Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler	Agilent
Synergy H1 Leitor multimodo	BioTek
MultiFlo FX Dispensador multimodo	BioTek
Teleshake	Inheco	3800048
CPAC Ultraflat Aquecedor/resfriador	Inheco
Software de automação Vworks	Software Agilent		usado para controlar e escrever protocolos para Agilent Software Bravo
Momentum	Software	de agendamento de tarefas
Software Liquid Handling Control 2.17	Biotek		usado para controlar e escrever protocolos para
microscópio invertido MultiFlo FX IX81	Olympus
Zyla 3-Tap	Andor
ET-CY3 / TRITC Conjunto de filtros	Chroma Technology Corp	49004
Rohament CL	AB Frasco de	amostra	de enzimas de baixo custo celulase
Rohapect UF	AB Frasco de	amostra	de enzimas de baixo custo pectinase
Rohapect 10L	AB Frasco de amostra de enzimas		pectinase/arabinase de baixo custo
Linsmaier & Skoog Basal Medium	Phytotechnology Laboratories	L689
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético	Phytotechnology Laboratories	D295
iodeto de propídio	Sigma Aldrich	P4170
Poli (etilenoglicol) 4000	Sigma Aldrich	95904-250G-F	Anteriormente Fluka PEG
Iodeto de propídio	Fisher Scientific	25535-16-4	Acros Orgânicos
CaCl2	Sigma Aldrich	C7902-1KG
Acetato de Sódio	Fisher Scientific	BP333-500
Manitol	Sigma Aldrich	M1902-1KG
Sacarose	Fisher Scientific	S5-3
KH2PO4	Fisher Scientific	AC424205000
KOH	Sigma Aldrich	P1767
Gelzan CM	Sigma Aldrich	G1910-250G
Placa de 6 poços	Thermo Scientific	103184
Placa de poço profundo de 96 poços de 1,2 ml	Thermo Scientific	AB-0564
Placa de fundo óptico de 96 poços	Thermo Scientific	165305
Finntip 1000 Pontas	de pipeta de diâmetro largoThermo Scientific	9405 163
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Sigma Aldrich	P4504-1KG
MES	Fisher Scientific	AC17259-5000
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500