Artigo de método

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

DOI:

10.3791/54300

⸱

27 de setembro de 2016

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

Neste artigo

Resumo

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A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo.

Resumo

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Durante a última década tem havido um ressurgimento do uso de protoplastos vegetais que variam de espécie para espécie vegetal modelo, para análise de vias de sinal de transdução, redes reguladoras da transcrição, a expressão do gene, genoma, e de edição de gene silenciador. Além disso, o progresso significativo tem sido feito para a regeneração de plantas a partir de protoplastos, o que tem gerado ainda mais o interesse na utilização destes sistemas para genoma das plantas. Neste trabalho, um protocolo tem sido desenvolvido para a automatização de isolamento de protoplastos e transformação de cultura em suspensão de tabaco um 'amarelo brilhante' 2 (A-2), utilizando uma plataforma robótica. Os procedimentos de transformação foram validados utilizando um gene repórter da proteína fluorescente laranja (OFP) (pporRFP) sob o controlo do promotor 35S do mosaico da couve-flor vírus (35S). OFP expressão em protoplastos foi confirmada por microscopia de epifluorescência. As análises também incluiu métodos de eficiência de produção de protoplastos usando propidium iodeto. Finalmente, as enzimas de grau alimentar de baixo custo foram usadas para o procedimento de isolamento de protoplastos, evitando a necessidade de enzimas laboratório-grade que são um custo proibitivo em high-throughput automatizado isolamento de protoplastos e análise. Com base no protocolo desenvolvida no presente trabalho, o procedimento completo de isolamento de protoplastos para transformação pode ser realizada em menos de 4 horas, sem qualquer entrada a partir do operador. Embora o protocolo desenvolvido neste trabalho foi validado com a cultura de células A-2, os procedimentos e métodos podem ser traduzidas a qualquer sistema de cultura em suspensão planta / protoplasto, o que deverá permitir a aceleração da pesquisa genómica de culturas.

Introdução

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Nos últimos anos tem havido um impulso significativo colocado sobre a concepção de culturas transgênicas para superar várias doenças 1, dotar resistência a herbicida 2, conferem seca 3,4 e tolerância ao sal 5, evitar herbivoria 6, aumentar a produção de biomassa 7, e diminuir a recalcitrância da parede celular 8. Esta tendência foi ajudada pelo desenvolvimento de novas ferramentas moleculares para a geração de plantas transgénicas, incluindo genoma de edição utilizando CRISPR e TALENS 9, e silenciamento de genes por meio de ARNcd de 10, 11 miARN, e ARNsi 12. Embora estas tecnologias simplificaram a geração de plantas transgênicas, eles também criaram um gargalo, onde o grande número de plantas transgénicas gerada não podem ser rastreados usando sistemas tradicionais que dependem de regeneração de plantas. Relacionado com este gargalo, enquanto que o silenciamento e de edição de genoma construções podem ser rapidamente inserido em plantas, muitos doscaracterísticas visadas não conseguem produzir o efeito desejado, o que muitas vezes não é descoberto até que as plantas são analisados ​​na estufa. Neste trabalho, nós desenvolvemos um método para o rápido rastreio automatizado, de alto rendimento de protoplastos de plantas, especificamente para lidar com o gargalo de corrente no rastreio inicial de um grande número de genoma de edição e silenciamento de genes alvos.

O uso de protoplastos, em oposição às células de plantas intactas, tem várias vantagens para o desenvolvimento de uma plataforma automatizada. Em primeiro lugar, os protoplastos são isolados após a digestão da parede celular de plantas, e com isso já não presente barreira, a eficiência de transformação é aumentada 13. Nas células vegetais intactas há apenas dois métodos bem estabelecidos para a transformação biolística, 14 e 15 de transformação mediada por Agrobacterium. Nenhum desses métodos podem ser facilmente convertidos para plataformas de manipulação de líquidos, como biolistics exige equipamento especializado para transformação, enquanto transformação mediada por Agrobacterium requer a co-cultura e a subsequente remoção das bactérias. Nem são passíveis de métodos de alto rendimento. No caso de protoplastos, a transformação é realizada rotineiramente utilizando polietileno-glicol (PEG) a transfecção mediada por 16, que só requer várias trocas de solução, e é especialmente adequado para plataformas de manipulação de líquidos. Em segundo lugar, os protoplastos, por definição, são as culturas de uma única célula, e assim os problemas associados com a acumulação e a formação da cadeia em culturas de células de plantas, não são observados em protoplastos. Em termos de rastreio rápida utilizando um espectrofotómetro de placa-base, a aglutinação de células, ou células em planos múltiplos irá conduzir a dificuldade em adquirir medições consistentes. Uma vez que os protoplastos são também mais denso do que o seu meio de cultura, eles sedimentar para o fundo dos poços, a formação de uma monocamada, o que é favorável para espectrofotometria à base de chapa. Finalmente, enquanto que as culturas em suspensão de células de plantas são Primarily derivado do calo 17, os protoplastos podem ser colhidas a partir de uma série de tecidos de plantas, conduzindo-se à capacidade para identificar a expressão específica de tecido. Por exemplo, a capacidade de analisar raiz- ou expressão específica de folha de um gene pode ser muito importante para a predição fenótipo. Por estas razões, os protocolos desenvolvidos neste trabalho foram validados utilizando protoplastos isolados do tabaco amplamente utilizado (Nicotiana tabacum L.) cultura em suspensão "amarelo brilhante" 2 (BY-2).

A cultura em suspensão BY-2 foi descrito como a célula "HeLa" de plantas superiores, devido ao seu uso disseminado em análise molecular de células de plantas 18. Recentemente, BY-2 de células têm sido usadas para estudar os efeitos da planta estressores 19-22, localização da proteína intracelular 23,24, biologia celular e de base 25-27 demonstrando a ampla utilidade destas culturas na biologia das plantas. Uma vantagem adicional de a-2 é a culturascapacidade para sincronizar as culturas com afidicolina, que pode levar a reprodutibilidade melhorada para a expressão do gene 28 estuda. Além disso, têm sido desenvolvidos métodos para a extracção de 2-POR protoplastos utilizando enzimas de baixo custo 29,30, como as enzimas utilizadas tradicionalmente para gerar protoplastos são de custo proibitivo para sistemas de alto rendimento. Como tal, o protocolo descrito abaixo foi validado usando a cultura em suspensão BY-2, mas deve ser modificável com qualquer cultura em suspensão de células de plantas. Experimentos de prova de conceito são realizadas utilizando um gene repórter da proteína de fluorescência laranja (OFP) (pporRFP) a partir dos Porites de coral Porites rígidos 31 sob o controlo do promotor CaMV 35S.

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Protocolo

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1. Estabelecimento de culturas de células em suspensão

  1. Prepara-líquido, por 2 meios adicionando 4,43 g Linsmaier e Skoog, meio basal de 30 g de sacarose, 200 mg de KH 2 PO 4, e 200 g de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 900 mL de água destilada de água e o pH para 5,8 com 0,1 M KOH. Depois de ajustar o pH, ajustar o volume final a 1000 mL com água destilada e autoclave. Os meios podem ser armazenado até 2 semanas a 4 ° C.
  2. Inocular um frasco Erlenmeyer de 250 mL com 100 ml de líquido BY-2 meios de comunicação e um única peça de BY-2 de calo (> 1 cm em diâmetro) cultivadas num sólido por-dois meios (líquido BY-2 meios com a adição de 1% agar) e selar com folha de alumínio. Incubar a cultura a 28-30 ° C com agitação durante 5 dias.
    NOTA: BY-2 calo é mantida em meio sólido para armazenamento de longo prazo, como culturas líquidas irão rapidamente crescer demais. volume de cultura pode ser ajustado como necessário, tipicamente, um mL de cultura de 100 será capaz de carregar trinta e três 6-wplacas ELL.
  3. Transferência de 2 ml de fase log BY-2 cultura a 98 mL de frescos Media By-2 e incubar por 5-7 dias a 28-30 ° C com agitação.
    NOTA: Sub-cultura de culturas líquidas estabelecidas pode ser levada a cabo regularmente utilizando 1: 100 diluições de 5-7 dias de idade, culturas, em vez do que a inoculação com calo.
  4. Misturar cuidadosamente a cultura, as células irão resolver rapidamente, e a transferência de 6 ml da cultura de células para um tubo de centrifugação de fundo cónico de 15 ml e deixa as células assentar durante pelo menos 10 min. Ajustar o volume de células empacotadas a 50% do volume total, removendo o sobrenadante.
  5. Agitar tubo, invertendo e pipeta de 500 uL em cada poço de uma placa de 6 poços para a digestão. Use pipetas de grande calibre para transferir as células nesta fase, visto que são densos e vai obstruir pontas de pipetas convencionais.

2. protoplastos Isolamento

  1. Ligue todos os componentes do sistema robótico (Figura 1A) e abrir a tarefa placa movimentador de agendamento suavelouça. O programa de agendamento de tarefas integra o motor de microplacas com o outro equipamento para permitir a transferência de placas entre cada peça de equipamento.
  2. Antes da experimentação, definir as especificações técnicas de material de laboratório (por exemplo, pratos, tampas) utilizados no protocolo, bem como posições inicial e final para cada peça de material de laboratório, no software de placa de motor, como segue:
    1. Clique em Configuração no bar principal ferramenta no software placa motor e selecione o Container de comando Gerenciar Tipos.
    2. Se o tipo de recipiente é listada na biblioteca de tipo de recipiente existente, em seguida, selecione o recipiente adequado.
    3. Se o tipo de recipiente não estiver listado na biblioteca tipo de recipiente existente, em seguida, clique em Adicionar para especificar um novo tipo de recipiente.
    4. Depois de adicionar um novo tipo de recipiente, insira as dimensões do novo contêiner (altura, largura, dimensões de empilhamento, e pinça de compensação) nas guias apropriadas e clique em Salvar.
      1. Se as dimensões corretas não estão disponíveis a partir do fabricante, em seguida, determinar com precisão todas as dimensões ao milímetro utilizando pinças. Erros na medição das dimensões do contêiner irá resultar em falha do motor placa.
    5. Repita os passos 2.2.2 através 2.2.4.1 para todos os tipos de recipiente que o motor placa vai encontrar. Depois de se completar este passo para todo o material usado, é necessário definir o início e o fim de localização para cada recipiente (passo 2.2.6).
      NOTA: Para este protocolo o material de laboratório inclui a placa de 6 poços, a placa de poço profundo, ea placa de rastreio de 96 poços fluorescente.
    6. Para definir a posição de início e fim de cada recipiente, clique na guia Início / Fim de um protocolo específico. Primeiro, selecione a posição de início de cada recipiente. Em seguida, marque a caixa Lidded / Unlidded tanto no início e fim posição. Repita o procedimento para todos os recipientes.
      NOTA: Se o recipiente será deixado em um outro pedaço de equipment (em vez do motor de placa) a localização final pode ser deixado em branco.
  3. Nesta fase carregar manualmente todas as placas para a posição inicial para todo o fluxo de trabalho. Carregar as placas de 96 poços de rastreio fluorescente no hotéis 2, placas de 6 poços com células BY-2 em Hotel 3, uma placa 96 de poço profundo que vai ser utilizado para a transformação em placa de aquecimento / arrefecedor ninho 2, e uma cónico de 50 ml tubo contendo a solução de enzima (ver arquivo suplementar, Secção 1.2.2) para o distribuidor multi-modo.
    1. Se transformação vai ser levada a cabo no protocolo, pré-carregar a placa de poços profundos com 96 a 10 ul de plasmídeo de ADN por cavidade (1 mg / mL, Uma 260/280> 1,8) contendo a construção repórter OFP e incubar no prato aquecedor / refrigerador a 4 ° C. Cada poço vai ser usado para uma única transformação, portanto, o número de poços cheios dependerá da configuração experimental.
  4. Coloque todos os suprimentos e placas no automatizard plataforma de manipulação de líquidos nos locais designados e definir a posição de cada item no software de controle de automação (Figura 1B).
    1. Carregar uma placa de 96 poços pré-carregado com 200 uL de PEG a 40% em MMG (manitol 0,4 M, MgCl2 100, MES 4 mM, pH 5,7) na coluna 1, 200 ul de iodeto de propídio (PI, 1 ug / ml) na coluna 2, e 200 mL de etanol na coluna 3 (ninho 2), e uma caixa de pontas de pipeta no ninho 8.
    2. Para definir a localização do material de laboratório no software da plataforma automatizada de manipulação de líquidos, selecione Ferramentas no menu e clique em Editor médico laboratorial.
    3. Selecione o tipo de material de laboratório no menu suspenso ou definir um novo tipo de material de laboratório usando o botão New médico laboratorial.
    4. Definir a posição de cada pedaço de material de laboratório selecionados, selecionando a guia Protocolo principal e clicando em Configurar médico laboratorial. Certifique-se de que cada pedaço de material de laboratório colocado sobre a plataforma de manuseamento de líquidos é automatizadodefinida antes de executar o protocolo.
    5. Para acionar os protocolos automatizados, clique janela do Explorer do perfil e selecione o nome do protocolo a ser executado (protoplastos isolamento, contagem de células, e Transformação mediada por PEG).
    6. Clique em Executar para inicializar todos os dispositivos que serão usados no protocolo.
    7. Finalmente, na janela de trabalho Explorer, clique em Adicionar Unidade de Trabalho para verificar todos os recipientes / material de laboratório no sistema e começar o protocolo automatizado.
      NOTA: As descrições completas dos protocolos automatizados estão contidos no arquivo suplementar.

3. Estabelecer curva padrão para contagem de células

  1. Concentrar manualmente protoplastos, a uma concentração de 1 x 10 6 protoplastos / ml num volume de 1 ml. Centrifugar protoplastos a 1.000 xg durante 10 min, e remover o sobrenadante.
  2. Manualmente adicionar 900 ul de etanol a 70% (mantida a 4 ° C) para o sedimento de protoplastose re-suspender o pellet. Incubar durante 10 min em gelo para fixar as células.
  3. Adicionar 100 ul de Pi (1 ug / ml) aos protoplastos para rotular os núcleos e permitem a detecção de pelo leitor de placas.
  4. Carga de 80 ul de líquido BY-2 meios para cada coluna e linha de rastreio da placa de 96 poços de fluorescência a partir de coluna 2.
  5. Na coluna 1 da placa de 96 poços de rastreio fluorescente, adicionar 70 ul de protoplastos e 50 uL BY-2 meios para cada poço na coluna.
  6. Coloque a placa no ninho 6 da plataforma de manipulação de líquidos automatizado, e executar uma diluição em série de 2 vezes.
    1. Para realizar uma diluição em série na plataforma de manipulação de líquidos automatizado, clique em Assistente de diluição de série Lançamento e ajustar o volume de transferência (60 pi), o número de misturas e de volume (2, 70 mL), poços iniciais (coluna 1, linhas AF), a diluição Wells (Colunas 2-11, linhas AF), e aspirado e dispensar propriedades (0,5 mm de bem inferior).
    2. Depois de definir os parâmetros, salvar umd executar o protocolo.
      NOTA: Uma vez que todos os protoplastos são marcadas com PI (devido à fixação das células), a fluorescência é proporcional à concentração de protoplastos.
    3. Após a diluição em série é concluída, remova a placa do ninho 9 e inserir no leitor de placas e executar o protocolo de curva padrão no software leitor de placas.
      NOTA: Uma curva padrão irá então ser gerado por comparação da fluorescência de PI (excitação 536 nm / emissão 620 nm) em cada poço com a concentração de protoplastos conhecido.
  7. Após a conclusão do protocolo de leitor de placas, remova a placa e recolher as células transgênicas para autoclave ou outros procedimentos de-vitalização tal como definidas em protocolos de biossegurança ".

4. Análise microscópica da Transformação

  1. Retire a placa com protoplastos transformados (o produto de Automated Protocolo 3, Supplemental Arquivo) do Hotel 1 do sistema robótico.
  2. vezem microscópio invertido, câmera, e lâmpada fluorescente.
  3. Seleccione a objectiva 10X inicial para incidindo sobre os protoplastos, ligue a lâmpada de halogéneo, e fechar o obturador para a lâmpada fluorescente.
  4. placa de carga em sistema microscópica e foco nos protoplastos usando brightfield.
  5. Depois de focar protoplastos, desligar a lâmpada de halogéneo e abrir o obturador para a lâmpada fluorescente.
  6. Seleccionar o filtro CY3 / TRITC definido para a visualização da proteína expressa por pporRFP os protoplastos transgénicos.
  7. Digitalizar cada poço para determinar o número de protoplastos expressando o pporRFP marcador fluorescente.
  8. Calcula-se a eficiência de transformação medida que o número total de protoplastos que expressam o marcador fluorescente o número total de protoplastos.
  9. Recolher quaisquer placas contendo células transgênicas em sacos de biossegurança aprovados para autoclave ou outros procedimentos de-vitalização tal como definidas em protocolos de biossegurança ".

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Resultados

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No presente estudo, a taxa de duplicação de BY-2 variou entre dependente da temperatura à qual as culturas foram incubadas, consistente com relatórios anteriores de uma duração do ciclo celular médio de 15 h 14-18 h. Com esta taxa de duplicação, de 1: 100 a partir de inoculo foi utilizado para iniciar culturas, levando a culturas com um volume empacotado de células (PCV) de 50% em 5-7 dias. No protocolo actual, em que as culturas foram cultivadas em 200 ml de meio, o hematócrito de 100 m...

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Discussão

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O protocolo acima descrito foi validada com êxito para o isolamento de protoplastos, enumeração e transformação usando a cultura de células em suspensão BY-2 de tabaco; No entanto, o protocolo pode ser facilmente estendida a qualquer planta de cultura em suspensão. Actualmente, o isolamento e transformação de protoplastos foi alcançado em numerosas plantas, incluindo o milho (Zea mays) 10, cenoura (Daucus carota) 32, álamo (Populus euphratica) 33, de uva (V...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pela Agência de Projetos de Pesquisa Avançada - Energia (ARPA-E) Prêmio No. DE-AR0000313.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Orbitor RS Transportador de microplacasThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Leitor multimodoBioTek
MultiFlo FX Dispensador multimodoBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Aquecedor/resfriadorInheco
Software de automação VworksSoftware Agilentusado para controlar e escrever protocolos para Agilent Software Bravo
MomentumSoftwarede agendamento de tarefas
Software Liquid Handling Control 2.17Biotekusado para controlar e escrever protocolos para
microscópio invertido MultiFlo FX IX81Olympus
Zyla 3-TapAndor
ET-CY3 / TRITC Conjunto de filtrosChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Frasco deamostrade enzimas de baixo custo celulase
Rohapect UFAB Frasco deamostrade enzimas de baixo custo pectinase
Rohapect 10LAB Frasco de amostra de enzimaspectinase/arabinase de baixo custo
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
Ácido 2,4-diclorofenoxiacéticoPhytotechnology LaboratoriesD295
iodeto de propídioSigma AldrichP4170
Poli (etilenoglicol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FAnteriormente Fluka PEG
Iodeto de propídioFisher Scientific25535-16-4Acros Orgânicos
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Acetato de SódioFisher ScientificBP333-500
ManitolSigma AldrichM1902-1KG
SacaroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
Placa de 6 poçosThermo Scientific103184
Placa de poço profundo de 96 poços de 1,2 mlThermo ScientificAB-0564
Placa de fundo óptico de 96 poçosThermo Scientific165305
Finntip 1000 Pontasde pipeta de diâmetro largoThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500
7000190Thermo Scientific para controlar o Orbiter RS Software o Câmera de microscópio

Referências

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