Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

Summary

Um método é descrito pelo qual nanopartículas de pontos quânticos (QD) podem ser usadas para estudos imunocitoquímicos correlativos de tecido de patologia humana embebido em epóxi. Empregamos QDs conjugados com fragmentos de anticorpos comerciais que são visualizados por microscopia de luz de fluorescência de campo amplo e microscopia eletrônica de transmissão.

Abstract

É descrito um método em que as nanopartículas de quantum dot (QD) pode ser utilizado para estudos imunocitoquímicos correlativos de tecido patologia humana usando microscopia de luz e de fluorescência de campo amplo microscopia electrónica de transmissão (TEM). Para demonstrar o protocolo temos immunolabeled epoxi secções ultrafinas de tumor Somatostatinoma humana utilizando um anticorpo primário para somatostatina, seguido por um anticorpo secundário biotinilado e estreptavidina conjugada com visualização 585 nm cádmio-selênio (CdSe) quantum dots (QDs). As secções são montadas sobre uma grelha TEM espécime, em seguida, colocado sobre uma lâmina de vidro para observação ao microscópio óptico de fluorescência de campo amplo. A microscopia de luz revela rotulagem QD 585 nm como fluorescência laranja brilhante formando um padrão granular dentro do citoplasma da célula de tumor. Em baixa para ampliação de gama média por microscopia de luz do padrão de marcação pode ser facilmente reconhecido e o nível de rotulagem não-específica ou de fundo avaliada. Esta é uma críticapasso subsequente para interpretação do padrão de imunomarcação por TEM e avaliação morfológica do contexto. A mesma seção é então seco com papel absorvente e visualizado por TEM. QD sondas são vistos para ser ligado a material amorfo contidos em grânulos de secreção individuais. As imagens são adquiridas a partir da mesma região de interesse (ROI) visto por microscopia de luz para análise de correlação. Correspondendo imagens de cada modalidade pode então ser misturada para sobrepor os dados de fluorescência em MET ultraestrutura da região correspondente.

Introduction

Luz- correlativa e microscopia eletrônica (CLEM) é uma abordagem poderosa para a análise de eventos dinâmicos transitórios ^1, eventos raros ^{2, 3} e complexos sistemas de ^4. Há muitas permutações diferentes técnicas disponíveis ^5, dependendo da questão que se coloca no entanto um requisito comum é que a mesma estrutura em uma única amostra ⁶ é fotografada por várias modalidades de microscopia. Nossa abordagem específica para CLEM foi desenvolvido para o estudo do tecido patologia humana de arquivo eo caso usada aqui foi bem caracterizada e publicado anteriormente ^7. O objectivo era, em primeiro lugar, pa....

Protocol

1. Tissue Dissecção e Fixação

1. Dissecção de tecido
   1. Dissecar pedaços de tecido a partir de uma amostra ou tecido tumoral biópsia cirurgicamente ressecado.
      Nota: O tecido utilizado no presente estudo foi rotineiramente fixadas em formalina tecido fresco mas também é adequado. Nós seleccionada uma área confirmada e comunicada por um patologista para conter anatómica tumoral Somatostatinoma após a coloração histológica de rotina e imunocoloração anti-somatostatina (não mostrado).
   2. Use pedaços de tecido não maiores que aproximadamente 1,0 ^mm3.
2. Cacodilato de tampão de preparação de

Results

A amostra de tumor Somatostatinoma utilizados para este estudo foi composta por células tumorais que formam estruturas ductal misturadas com o tecido stomal colágeno. Por microscopia de luz de fluorescência, as células tumorais individuais que continham grânulos de secreção abundante mostrou rotulagem positivo para o hormônio somatostatina. Núcleos apareceu como furos escuras com marcação não-específica mínima detectável (Figura 1). A baixas ampliações, variavelmente int.......

Discussion

Este estudo demonstrou a utilidade potencial de QDs como sondas universais para estudos Clem. Os 585 nanopartículas nm QD utilizados mostraram fluorescência brilhante e estável quando visto por microscopia óptica de campo amplo e foram prontamente observadas por TEM. Um estudo anterior por um dos presentes autores mostrou QDs também ser apropriado para a microscopia de luz de super-resolução ^7. Sua fotoestabilidade foi particularmente útil para períodos de visionamento estendidos e exposições de imagem longos.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cacodilato de sódio	Proscitech	C0205	Produto químico nocivo
Tetróxido de ósmio	Proscitech	C010	Use apenas na capela de exaustão
Acetato de uranilo	Univar-Ajax	569	Etanol químico perigoso
100%	Fronine	JJ008
Acetona 100%	Fronine	JJ006
ERL 4221	Proscitech	C056
DER 732	Proscitech	C047
NSA	Proscitech	C059
DMAE	Proscitech	C050
Metaperiodato de sódio	Analar BDH	10259
anticorpo anti-somatostatina	Dako	A0566
Diluente de anticorpo	Dako	S3022
Qdot 585 Conjugado de Streptavidin	Invitrogen	Q10113MP
Anticorpo anti-coelho IgG biotinilado para cabras	Sigma	B7389-1ML
Glutaraldeído 50%	EMS	16320
Soro normal para cabras	Invitrogen	PCN5000
PBS "Dulbecco A"	Oxoid
BSAc (10%)	Aurion	900.022
Parafilm	Pechiney PP	M
Tiras indicadoras de pH (pH 2,0 - 9,0)	Merck	1,09584.0001
Micromoldes	Proscitech	RL063
Faca de diamante	Diatome	Ultra 45
Microscópio eletrônico de transmissão	FEI	Morgagni 268D
	Carl Zeiss	Axioscope A1
Grids 300 mesh níquel (barra fina)	Agar Scientific	G2740N
Ultramicrótomo	RMC	Powertome
TEM software de controle de câmera	Soft Imaging System	AnalySIS	Versão 3.0
Software de processamento de imagem	Adobe Systems Photoshop	CS2