É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

9.5K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/54307

⸱

7 de agosto de 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

Neste artigo

Resumo

Um método é descrito pelo qual nanopartículas de pontos quânticos (QD) podem ser usadas para estudos imunocitoquímicos correlativos de tecido de patologia humana embebido em epóxi. Empregamos QDs conjugados com fragmentos de anticorpos comerciais que são visualizados por microscopia de luz de fluorescência de campo amplo e microscopia eletrônica de transmissão.

Resumo

É descrito um método em que as nanopartículas de quantum dot (QD) pode ser utilizado para estudos imunocitoquímicos correlativos de tecido patologia humana usando microscopia de luz e de fluorescência de campo amplo microscopia electrónica de transmissão (TEM). Para demonstrar o protocolo temos immunolabeled epoxi secções ultrafinas de tumor Somatostatinoma humana utilizando um anticorpo primário para somatostatina, seguido por um anticorpo secundário biotinilado e estreptavidina conjugada com visualização 585 nm cádmio-selênio (CdSe) quantum dots (QDs). As secções são montadas sobre uma grelha TEM espécime, em seguida, colocado sobre uma lâmina de vidro para observação ao microscópio óptico de fluorescência de campo amplo. A microscopia de luz revela rotulagem QD 585 nm como fluorescência laranja brilhante formando um padrão granular dentro do citoplasma da célula de tumor. Em baixa para ampliação de gama média por microscopia de luz do padrão de marcação pode ser facilmente reconhecido e o nível de rotulagem não-específica ou de fundo avaliada. Esta é uma críticapasso subsequente para interpretação do padrão de imunomarcação por TEM e avaliação morfológica do contexto. A mesma seção é então seco com papel absorvente e visualizado por TEM. QD sondas são vistos para ser ligado a material amorfo contidos em grânulos de secreção individuais. As imagens são adquiridas a partir da mesma região de interesse (ROI) visto por microscopia de luz para análise de correlação. Correspondendo imagens de cada modalidade pode então ser misturada para sobrepor os dados de fluorescência em MET ultraestrutura da região correspondente.

Introdução

Luz- correlativa e microscopia eletrônica (CLEM) é uma abordagem poderosa para a análise de eventos dinâmicos transitórios 1, eventos raros 2, 3 e complexos sistemas de 4. Há muitas permutações diferentes técnicas disponíveis 5, dependendo da questão que se coloca no entanto um requisito comum é que a mesma estrutura em uma única amostra 6 é fotografada por várias modalidades de microscopia. Nossa abordagem específica para CLEM foi desenvolvido para o estudo do tecido patologia humana de arquivo eo caso usada aqui foi bem caracterizada e publicado anteriormente 7. O objectivo era, em primeiro lugar, para maximizar os dados analíticos de uma única amostra de biópsia ou cirurgia e, por outro, para usar a microscopia de fluorescência de luz para ajudar a esclarecer o contexto do padrão de marcação imunocitoquímica visto ao nível ultra-estrutural.

nanocristais de pontos quânticos (QDs) oferecem o potencial de um marcador universal abl sistemaE para ser visto por tanto, a microscopia de luz de fluorescência e microscopia electrónica 8, 9, 10. A sua estrutura de núcleo cristalino permite QDs de tamanhos diferentes para gerar uma vasta gama de picos de emissão de fluorescência quando excitada pela luz em comprimentos de onda para longe dos seus espectros de emissão 11. O seu peso atômico é suficiente para produzir densidade de elétrons que é detectável por microscopia eletrônica de transmissão, microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) ou microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo. Eles são particularmente adequados para estudos imunocitoquímicos como até mesmo QDs individuais podem ser observados dando uma sensibilidade final de um QD por molécula-alvo 12. Além disso, dependendo do QD utilizados podem possuir uma assinatura elementar indivíduo adequado para mapeamento.

amostras de patologia humana oferecem benefícios significativos para a investigação biomédica translacional. amostras de tecido cirúrgico e biópsia são rotineiramente submetidos à biobanking e com appropfolgas ética riate pode ser acessado por estudos de investigação. Tecido humano não tem questões de relevância ou de interpretação que podem ocorrer em animais ou em modelos in vitro de doença. No entanto, a preparação de amostras de amostras de patologia muitas vezes não é o ideal. Pode haver atraso no tecido a ser colocado no fixador, inadequado fixador utilizado tal como formalina, em vez de glutaraldeído por TEM e inadequado amostragem. CLEM métodos têm o potencial para optimizar a informação de diagnóstico e de prognóstico disponível a partir de uma única amostra humana. No entanto, algumas abordagens correlativos recentemente desenvolvidas, tais como as que utilizam mini-gerador de oxigénio singuleto (miniSOG) não estão disponíveis para utilização em patologia, devido à necessidade de que a etiqueta seja geneticamente codificados na célula de interesse 13. Por esta razão temos explorado a utilidade de rotulagem QD de tecido TEM rotineiramente preparados para estudos imunocitoquímicos correlativos. QDs aplicado a epoxi gravado ou secções de resina acrílica de Liamostras de biópsia e tecidos ghtly aldeído fixos oferecem a possibilidade de obtenção de microscopia de luz de fluorescência correlativa e os dados TEM partir de uma única amostra.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Tissue Dissecção e Fixação

  1. Dissecção de tecido
    1. Dissecar pedaços de tecido a partir de uma amostra ou tecido tumoral biópsia cirurgicamente ressecado.
      Nota: O tecido utilizado no presente estudo foi rotineiramente fixadas em formalina tecido fresco mas também é adequado. Nós seleccionada uma área confirmada e comunicada por um patologista para conter anatómica tumoral Somatostatinoma após a coloração histológica de rotina e imunocoloração anti-somatostatina (não mostrado).
    2. Use pedaços de tecido não maiores que aproximadamente 1,0 mm3.
  2. Cacodilato de tampão de preparação de
    1. Prepara-se uma solução de tampão de estoque (1 M), adicionando 21,4 g de cacodilato de sódio (ver Lista de Materiais) e 3,0 ml de 1% de solução de cloreto de cálcio a 90 ml de água destilada e, em seguida, cobrindo-se a solução para um volume final de 100 ml. Agitar a solução e deixá-lo repousar durante a noite para que o reagente cristalino dissolve totalmente.
    2. Prepara-se uma solução tampão de trabalho pela adição de 20 ml de solução de reserva a 170 ml de água e, em seguida, verificar o pH com papel indicador. Ajustar o pH para 7,4 por adição de 3 - 4 gotas de HCl a 3%. Completar a solução a um volume final de 200 ml com molaridade final de 0,1 M.
  3. Fixador Preparação e Utilização
    1. Adicionar uma ampola de 10 ml de solução de glutaraldeído a 50% a 20 ml da solução de cacodilato de sódio (1 M). Encha com água destilada para 190 ml. Verificar o pH e ajustar para 7,4 por adição de 1 - 4 gotas de ácido clorídrico a 3% (HCl), se necessário.
    2. Completar com água destilada para perfazer um volume final de 200 ml.
    3. Mergulha-se o tecido em fixador contendo 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4 durante 24 horas a 4 ° C num tubo de ensaio de vidro. Descarte fixador não utilizados após 1 semana.

2. Processamento de Tecidos e Embedding

  1. ósmio TetroXide coloração
    1. Após a fixação é completa, mergulhar o tecido em tampão de cacodilato de sódio (0,1 M) durante 20 min, em seguida, repetir durante mais 20 min.
    2. Prepara-se uma tetróxido de ósmio aquoso a 2% (OsO 4) solução de trabalho através da adição de 8,0 ml de uma OsO solução 4 estoque de 5% a 2,0 ml da solução de tampão de cacodilato de sódio (1 M) e 10,0 ml de água destilada para fazer um volume final de 20,0 ml.
    3. Remover o tampão depois imergir o tecido em 2% de OsO4 em pH 7,4 durante 4 h à temperatura ambiente.
      ATENÇÃO! Tenha cuidado ao decantação e preparar OsO 4 soluções, usar equipamento de proteção pessoal adequado e trabalhar em um exaustor em todos os momentos.
  2. Acetato de uranilo Coloração
    1. Após osmication tecido estiver concluída, remova a solução OsO 4 e mergulhe o tecido em 2% acetato de sódio por 10 min. Retirar 2% de acetato de sódio, em seguida imerso em 2% de acetato de uranilo durante 1 hora atemperatura do quarto.
  3. Desidratação
    1. Desidratar tecido através de álcoois graduados. Use% de etanol a 50 durante 10 minutos, 70% de etanol durante 10 min, 95% de etanol durante 10 minutos e duas mudas de etanol a 100% durante 20 minutos cada à temperatura ambiente.
    2. Executar duas mudanças de 100% de acetona, durante 30 min cada.
  4. Impregnação de resina e cura
    1. Misture resina epóxi de baixa viscosidade em um copo de polietileno descartáveis. Adicionar 10,0 g de dióxido de vinil ciclohexeno (ERL 4221) monómero epoxi, 6 g de éter diglicidílico de polipropileno-glicol (DER 732) e 26,0 g de anidrido succínico nonenilo (NSA). Mexa bem à mão usando varas de madeira por 2 min.
    2. Adicionar quinze gotas de 2-dimetilaminoetanol acelerador (DMAE) epoxi e agitar novamente durante 2 min. Tome cuidado para misturar completamente os componentes ERL, DER e NSA antes de adicionar o acelerador DMAE.
    3. Comece a impregnação de resina do tecido através da substituição de 100% de acetona com 1: 1 de resinaacetona durante 1 hora, em seguida, substitua com 6: resina 1 a acetona, durante 3 horas, e, finalmente, 100% de resina durante a noite.
    4. Transferir o tecido em resina fresca em 8 micromoulds mm. Cure a 70 o C durante a noite. Resina deve ser difícil, mas não frágil após a cura.

3. ultramicrotomia

  1. Faca, corte Parâmetros e Seção Espessura
    1. Coloque uma faca de diamante cortes semifinos na ultramicrótomo e cortar secções de tecido com uma espessura de 500 nm.
    2. Flutuar seções para o banho de água atrás do fio da navalha. Pegar as seções sobre uma lâmina de vidro e seque-as para baixo por 10 a 20 segundos usando uma chapa quente em cerca de 110 o C.
    3. Etch as secções com solução de etóxido de sódio durante 20 segundos e depois lave com 100% de etanol água, em seguida destilada. Stain com 2% de azul de metileno em 1% de bórax por 20 s sobre a placa, lavar com água corrente da torneira durante 5 segundos e seco sobre a placa por 5 s. Então stain com 1,5% fucsina básica sobre a placa por 5 segundos, em seguida, seco sobre a placa por 20 s.
    4. Na análise por microscopia de luz de campo brilhante e confirmar que as células tumorais e uma região de interesse (ROI) estão presentes na secção.
    5. Alterar a faca de diamante cortes semifinos a uma faca de diamante ultrafino e definir o ângulo da faca e corte velocidade correta como recomendado pelo fabricante faca.
    6. Corte cortes ultrafinos a 90 nm de espessura. Observar a coloração de ouro quando as secções de flutuação no banho de água.
    7. Esticar e achatar as seções acenando vapor clorofórmio a partir de 1 cm 2 pedaço de papel de filtro dentro de poucos milímetros de seções. Tome cuidado para não trazer o papel clorofórmio embebido em contacto com a superfície da água.
  2. Ultrathin Seção grade de montagem
    1. Levante os cortes ultrafinos da superfície da água usando um thin-bar grelha de níquel TEM 300-mesh que foi mergulhado na seção adhesive solução. Localize as seções do lado chato da grade. As grades têm uma superfície baça ou fosco de um lado e uma superfície polida ou brilhante do outro lado. No filme de suporte é necessário. Nota: É necessário para lidar com essas grades com pinças anti-magnéticas para evitar grades que adere a fórceps.
    2. Prepara-se o adesivo por secção de colocação 20 cm de fita adesiva clara num frasco de 5 ml com 2,0 ml de acetona. Tampa e agite o frasco, deixe descansar por 10 min, em seguida, retire a fita deixando a solução adesiva.

4. imunomarcação

  1. antígeno Unmasking
    1. Prepare 1 ml de solução de gravação fresco saturada de metaperiodato de sódio em água destilada e utilizá-lo imediatamente. gotículas lugar da solução de gravação em uma superfície labfilm limpa.
    2. Coloque grades completamente secas com secções para baixo em gotículas de solução de metaperiodato de sódio à temperatura ambiente durante 30 min. Transferir as grades para dro água destiladaplets para 60 seg de lavar.
  2. A incubação do anticorpo e QD sonda identificadora
    1. Executar todas as incubações e rotulagem em gotas de solução colocados sobre uma superfície Parafilm limpo.
    2. Coloque a grade sobre uma gota de 0,05 M de glicina em PBS durante 10 min para bloquear o aldeído residual na secção. Remover o bloco de aldeído por blotting brevemente a borda da grelha.
    3. Coloque a grade sobre uma gota de soro normal de cabra 1% (NGS) e 1% bsac (10%) em PBS durante 10 min. Preparar a solução de bloqueio por adição de 10 ul de NGS e 100 ul de bsac para 890 ul de PBS para dar um volume final de 1000 uL.
    4. Acondicionar as secções colocando sobre uma gota de diluente de anticorpo durante 10 min.
    5. Realizar a incubação imunomarcação utilizando o anticorpo policlonal anti-somatostatina diluída 1:10 com o diluente de anticorpo, dando uma concentração de 3,47 g / L. Nota: incubação do anticorpo é feito colocando grades em gotas durante 1 h à temperat quartoure em câmara úmida.
    6. Remover o reagente de anticorpo a partir do passo 4.2.5 por blotting da borda da grelha, em seguida, lavar secções em diluente durante 2 x 5 min.
    7. Incubar em anticorpo secundário (de cabra biotinilado anti-coelho policlonal) diluída 1:10 durante 1 h à temperatura ambiente. Remover a solução de anticorpo secundário. Lavar em diluente para 2 x 5 min.
    8. Incubar em QDs estreptavidina conjugada (585 nm) diluído 1:10 durante 1 h à temperatura ambiente. Cubra com papel alumínio para reduzir a exposição à luz durante a incubação.
    9. Lave as redes na água destilada fresca por 2 min. Seque as bordas da grade seco.

5. Fluorescência Microscopia de Luz

  1. Fonte de Luz e Filtro Cubes
    1. Use diodo emissor de luz (LED) 365 nm luz por microscopia de luz de fluorescência de campo amplo. Inserir um cubo de filtro com as seguintes características: (L Ex 365 nm, a BS 395 FT e EM LP 420 nm).
      Nota: Este cubo de filtro wdoente permitir que o espectro de emissão de todos os QDs tamanhos para ser visualizados simultaneamente sob o mesmo comprimento de onda de excitação.
  2. Visualização e criação de imagens Secções
    1. Coloque a seção de grade imunocoradas para baixo sobre uma lâmina de vidro em uma gota de água e cobrir com uma lamela de vidro (espessura número 1.5). Use microscopia óptica para avaliar o padrão de marcação, o nível de qualquer rotulagem não específica e estabelecer que os controlos negativos são claras de rotulagem.
    2. Identificar o ROI em relação às barras da grade. grades Finder pode ser útil para o estabelecimento de co-ordenadas de estruturas alvo.
    3. Adquirir imagens de rotulagem positivo na seção usando uma câmera digital cor completa com a definição da câmara no "color auto FL" e "Balanço de Branco" fixado em 3,200K. Utilizar a câmara no modo "automático de exposição", com uma configuração "gama" compreendida entre 0,45 e 1,00 para optimizar a aparência das imagens e "Ganho analógico" definido em 1x.Clique no ícone da câmera na interface gráfica software Zen 2 Lite com "Live", focalizar a imagem e clique em "Snap" para capturar a imagem para o framestore.
    4. Salvar imagens como arquivos .tif para evitar compressão e pixelation se tornando aparente.
    5. Prepare uma impressão mostrando a posição do ROI em relação às barras da grade ou outros pontos do tecido significativos. Estas cópias serão úteis para navegação posterior da secção e re-encontrar ROIs por microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
    6. Retirar a grade do slide, lavar em água destilada e suavemente apagar as bordas seca.
      Nota: Não use a iluminação demasiado intensa para adquirir imagens de fluorescência. A fotoestabilidade de QDs permite tempos de imagem de até alguns segundos, mas tome cuidado para não prolongar a exposição como extinção do sinal QD pode ocorrer após cerca de 1 min em água. fotoestabilidade prolongado ou permanente só é obtida quando QD marcado seções são desidratados com tolueno eembutido sob lamelas conforme as especificações do fabricante. No entanto, este processo irá então excluir a possibilidade de exame correlativo da mesma secção por TEM.

6. Transmission Electron Microscopy

  1. TEM Set Up e visualização
    1. Transferir a grade para o TEM para exame usando uma voltagem de aceleração de 100 kV. Use baixa ampliação de aproximadamente 1,400X para navegar ao redor da grade e encontrar ROIs que se correlacionam com os pontos de vista de microscopia de luz. Visualização de grupos de QDs em ampliações ao redor 50,000X.
    2. Observe QDs individuais em 70,000X ampliação ou acima. Observe os QDs como estruturas cristalinas irregulares com densidade de elétrons moderado.
  2. imagiologia
    1. Use uma câmera digital para imagens TEM. A monocromática 1392 x 1040 pixel sensor é adequada.
    2. Adquirir imagens clicando no ícone "Camera" para "On" no microscope interface gráfica do software de imagem, em seguida, para "Off" para armazenar a imagem na framestore. Nota: estas operações vão variar de acordo com o sistema de microscópio que está sendo usado. Use a câmera no modo de exposição automática com um ajuste de "Gamma" de 1,00.
    3. Salvar imagens como arquivos .tif.

7. CLEM Imagiologia

  1. Localizando um ROI de fluorescência por TEM
    1. Use uma impressão a partir da imagem de microscopia de luz para localizar ROIs correspondente por TEM. Tecidos características arquitectónicas tais como vasos sanguíneos e estruturas luminais são úteis para a navegação em torno da seção usando TEM.
    2. Capturar uma imagem do ROI correspondente por TEM.
  2. CLEM sobreposição de imagens
    1. Certifique-se a imagem TEM está correctamente orientado com a imagem de microscopia de luz e corrigir o alargamento de cada um de modo que a mesma estrutura visto em cada modalidade é o mesmo tamanho.
    2. Orientarcomeu a microscopia de luz e imagens de TEM e exibi-los lado a lado ou como sobreposições para destacar as características ultra-estruturais de ROIs immunolabeled.
    3. Criar uma imagem de sobreposição usando o Photoshop CS2. Em primeiro lugar, ampliar a imagem de fluorescência para a mesma ampliação como uma imagem de baixa potência TEM. Orientar as duas imagens e colá-los lado a lado em uma tela.
    4. Achatar a imagem.
    5. Criar a sobreposição de fluorescência a partir desta imagem composta. Clique no botão "Rectangular Marquee Tool", selecione a imagem de fluorescência e criar uma camada duplicada a partir dele.
    6. Ajuste o "Layer Style / Mistura opções" para 30 - a transparência de 40%.
    7. Clique no botão "Move Tool" e arraste a camada de sobreposição de fluorescência sobre a imagem TEM correspondente. Alinhar as imagens.
    8. Depois de atingir o alinhamento, "achatar" as camadas para produzir a imagem de sobreposição final.
    9. Use a "Rectangular Marquee Tool" para selecionar a nova imagem sobreposta and copiá-lo para uma nova tela. Salve como um arquivo .tiff.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A amostra de tumor Somatostatinoma utilizados para este estudo foi composta por células tumorais que formam estruturas ductal misturadas com o tecido stomal colágeno. Por microscopia de luz de fluorescência, as células tumorais individuais que continham grânulos de secreção abundante mostrou rotulagem positivo para o hormônio somatostatina. Núcleos apareceu como furos escuras com marcação não-específica mínima detectável (Figura 1). A baixas ampliações, variavelmente int...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este estudo demonstrou a utilidade potencial de QDs como sondas universais para estudos Clem. Os 585 nanopartículas nm QD utilizados mostraram fluorescência brilhante e estável quando visto por microscopia óptica de campo amplo e foram prontamente observadas por TEM. Um estudo anterior por um dos presentes autores mostrou QDs também ser apropriado para a microscopia de luz de super-resolução 7. Sua fotoestabilidade foi particularmente útil para períodos de visionamento estendidos e exposições de imagem longos...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer o apoio de Xiao Juan Wu (Laboratório de Imuno-histoquímica) e do Departamento de Patologia Anatômica, Serviço de Patologia do Sudoeste de Sydney (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, Nova Gales do Sul, Austrália.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cacodilato de sódioProscitechC0205Produto químico nocivo
Tetróxido de ósmioProscitechC010Use apenas na capela de exaustão
Acetato de uraniloUnivar-Ajax569Etanol químico perigoso
100%FronineJJ008
Acetona 100%FronineJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
Metaperiodato de sódioAnalar BDH10259
anticorpo anti-somatostatinaDakoA0566
Diluente de anticorpoDakoS3022
Qdot 585 Conjugado de Streptavidin InvitrogenQ10113MP
Anticorpo anti-coelho IgG biotinilado para cabrasSigmaB7389-1ML
Glutaraldeído 50%EMS16320
Soro normal para cabrasInvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid 
BSAc (10%)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
Tiras indicadoras de pH (pH 2,0 - 9,0)Merck1,09584.0001
MicromoldesProscitechRL063
Faca de diamanteDiatomeUltra 45
Microscópio eletrônico de transmissãoFEIMorgagni 268D
Carl ZeissAxioscope A1
Grids 300 mesh níquel (barra fina)Agar ScientificG2740N
UltramicrótomoRMCPowertome
TEM software de controle de câmeraSoft Imaging SystemAnalySISVersão 3.0
Software de processamento de imagemAdobe Systems PhotoshopCS2
BR0014GMicroscópio de luz de fluorescência incorporado

Referências

  1. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  2. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).
  3. De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
  4. Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
  5. Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
  6. Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014(2010).
  7. Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
  8. Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
  9. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
  10. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
  11. Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
  12. Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
  13. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
  14. Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
  15. Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
  16. Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
  17. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
  18. Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
  19. Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Microscopia Eletrônica de Luz CorrelativaEstudos ImunocitoquímicosMicroscopia Eletrônica de TransmissãoMicroscopia de Fluorescência de Campo AmploTecido Tumoral de SomatostatinomaQDs Conjugados com EstreptavidinaPreparação de Grade de NíquelProtocolo de Marcação com AnticorposSobreposição de Fluorescência em TEM
Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.