Method Article

Agregada Optimization Tamanho em micropoços para sistemas baseados em Suspensão Cardiac diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/54308

⸱

September 25th, 2016

 ,  , 
1Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os métodos convencionais para iniciar a diferenciação cardíaca baseada suspensão total dos pluripotentes humanas células-tronco (hPSCs) são atormentado com a heterogeneidade da cultura com relação ao tamanho e forma agregada. Aqui, descrevemos um método robusto para a diferenciação cardíaca empregando micropoços para gerar controlado-size HPSC agrega cultivadas em condições de promoção cardíacos.

Abstract

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A diferenciação cardíaca de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) é tipicamente realizada em agregados de células em suspensão. A formação convencional de agregados de hPSCs envolve a dissociação de colônias de células em aglomerados menores, com controle de tamanho dos aglomerados grosseiramente controlado pipetando a suspensão celular até que o tamanho desejado do aglomerado seja alcançado. Um dos principais desafios da diferenciação cardíaca convencional baseada em agregados de hPSCs é que a heterogeneidade da cultura e a desorganização espacial levam a um rendimento de cardiomiócitos variável e ineficiente. Nós e outros relatamos anteriormente que o tamanho agregado das células-tronco embrionárias humanas (hESC) pode ser modulado para otimizar a eficiência da indução cardíaca. Enfrentamos esse desafio empregando uma abordagem escalável e baseada em micropoços para controlar os parâmetros físicos da formação de agregados, especificamente o tamanho e a forma do agregado. O método que descrevemos aqui consiste na agregação forçada de números definidos de hPSC em micropoços e na subsequente cultura desses agregados em condições que direcionam a indução cardíaca. Este protocolo pode ser facilmente dimensionado dependendo do tamanho e número de poços usados. Usando esse método, podemos obter consistentemente saídas de cultura com frequências de cardiomiócitos superiores a 70%.

Introduction

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Em cultura de células in vitro pode ser realizada sob um número de modalidades, mas é tipicamente levada a cabo quer sob condições bidimensionais aderentes ou em condições de suspensão tridimensionais que recapitulam mais completamente em sistemas in vivo. Consequentemente, há uma tendência crescente em muitos campos de investigação para desenvolver métodos robustos para gerar tridimensionais construções de tecido. Em situações em que tipos de células e processos requerem um suporte de superfície e sinais de adesão da matriz extracelular (ECM), a cultura tri-dimensional pode ser activado por meio de construções de scaffold, onde as células são cultivadas sobre ou dentro de uma matriz de suporte exógeno 1. As células e os processos que não necessitam de adesão a uma matriz de suporte pode ser realizada em suspensão como sistemas unscaffolded compostas principalmente ou exclusivamente de células (que pode então prosseguir para gerar as suas próprias matrizes endógenos) 2,3. Aqui, apresentamos um protocolo para cardíaca diferenciação of células-tronco pluripotentes humanas - em, uniforme, agregados unscaffolded controlado-size (hPSCs células capazes de se tornar qualquer tipo de célula no corpo, quer de fontes embrionárias ou outras STEM).

Diferenciação de hPSCs como agregados de suspensão é atormentado por grandes variações no tamanho dos agregados, tanto dentro uma corrida e entre as execuções. Esta variabilidade é uma consequência do método tipicamente empregue para gerar estes agregados, que envolve a dissociação mecânica de colónias de células. Para reduzir esta variabilidade, um certo número de abordagens têm sido utilizadas para controlar o número de células por agregado bem como diâmetro total e uniformidade. Exemplos incluem a formação de agregados em tubos de microcentrífuga de 4 ou 5 gotas de suspensão como, micropatterning definido bidimensionais colónias HPSC 6 que podem então ser transferidos para suspensão, ou centrifugação das células em U ou placas multi-poços de fundo em V 7,8, 9. No entanto, todas estas aproxoaches são limitados pela sua baixa taxa de geração agregada. sistemas baseados em Bem utilizar uma abordagem semelhante para sistemas de placas de fundo em V, no entanto, o tamanho mais pequeno dos micropoços (neste protocolo cada um tendo uma largura de 400 mm) permite a geração de um maior número de agregados uniformes a partir de uma única cultura de placa bem (diâmetro padrão de ~ 15,5 mm contendo ~ 1.200 micropoços) do que seria gerado a partir de uma placa de fundo em V de 10 todo. Formação de agregados à base de bem tem sido utilizado em uma série de configurações, incluindo diferenciação de hPSCs para ectodérmica 11, endodérmico 12, mesodermais 13 e extraembryonic 14 destinos; chondrogenesis a partir de células-tronco mesenquimais 15; geração de substratos uniformes de triagem toxicológica 16; e as investigações de mechanobiology 17.

Um desafio importante no desenvolvimento de protocolos de produção robusta para a produção de derivados de cardiom HPSCyocytes tem sido a falta de reprodutibilidade na eficiência diferenciação cardíaca entre as execuções. Nós anteriormente demonstrado que esta variabilidade pode ser atribuído à heterogeneidade da população HPSC de partida, que compreende ambas as células auto-renovação e diferenciação hPSCs que expressam genes associados com endoderme e diferenciação neural 6,18. Sinais segregadas por estas células de diferenciação impacto indução cardíaca. Especificamente, endoderme extraembryonic promove indução cardíaca, enquanto progenitores neuronais inibem a indução cardíaca. Após a agregação HPSC, células dentro do diferenciar agregado e organizar para que hPSCs indiferenciadas estão rodeados por uma camada de células da endoderme extraembryonic que se desenvolvem na superfície agregada 13. Através do controlo da dimensão do agregado, pode-se modular a proporção de células da endoderme de indução cardíacas para hPSCs indiferenciadas (razão entre superfície e volume) e optimizar esta razão para a indução cardíaca máxima 13.

Protocol

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1. Preparação dos componentes do meio

  1. Prepare meio de lavagem. Por 100 ml de DMEM / F12, adicionar 1 ml de 100 x penicilina / estreptomicina (Pen / Strep), 1 ml de 100x de L-glutamina, e 5 ml de soro de substituição.
  2. Prepara-se o quimicamente definido Basal Medium cardíaca Indução de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Prepare os seguintes reagentes de ações para a mídia que serão utilizados neste protocolo.
    1. Ácido L-Ascórbico: Prepara-se uma solução stock de 5 mg por ml em 4 ° C, água destilada ultra-pura esterilizada em um tubo cónico.
      1. Deixar a solução em gelo e agitar com vortex até que o tubo periodicamente o soluto é dissolvido completamente. Filtro-esterilizar a solução de ácido ascórbico utilizando um filtro de seringa de 0,22? M.
      2. Preparar alíquotas de 1 ml da solução de ácido ascórbico e armazenar essas aliquotas a -20 ° C. Usar uma alíquota descongelada recentemente cada meio tempo é preparado.
    2. No dia da preparação médio, Dilui-se 13 ul de monotioglicerol (MTG) em 1 ml de Meio de Indução Basal cardíaco. Descartar não utilizado MTG, diluída.
    3. Preparar alíquotas de 1 ml de transferrina (30 mg / mL) para armazenar a -20 ° C. Loja descongeladas aliquotas a 4 ° C durante até 3 meses.
    4. Prepare ácido 4 mM clorídrico (HCl) contendo 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA). Numa hotte, adicionar 30 ul de uma solução de HCl 6,0 N a 50 ml de água destilada ultra-pura. Filtrar-esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 mM. Adicionar 2 ml de solução de BSA a 25% para a solução de HCl a 50 ml.
    5. Preparar tampão fosfato salino (PBS) contendo 0,1% de BSA. Adicionar 20 ul de solução de BSA a 25% por ml de PBS.
    6. Prepare humano osso morfogenética Proteína 4 (BMP-4) solução estoque (10 ng / ul). Dissolve-se 10 ug liofilizadas BMP-4 em 1 ml de solução tampão de HCl 4 mM contendo 0,1% de BSA. Preparar 50 uL alíquotas para armazenar a -20 ° C.
    7. Prepare Humano Fibroblasto Crescimento Fator 2 solução-mãe (bFGF)(10 ng / ul). Dissolve-se 10 mg de bFGF liofilizado em 1 ml de tampão fosfato salino (PBS) contendo 0,1% de BSA. Preparar 50 uL alíquotas para armazenar a -20 ° C.
    8. Prepare Endotelial Vascular fator de crescimento humano (VEGF) solução estoque (5 ng / mL). Dissolve-se 5 ug de VEGF liofilizada em 1 ml de PBS contendo 0,1% de BSA. Preparar 50 uL alíquotas para armazenar a -20 ° C.
    9. Prepare Activina A solução estoque (10 ng / ul). Dissolve-se 10 ug liofilizadas Activina A em 1 ml de PBS contendo 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA). Preparar 50 uL alíquotas para armazenar a -20 ° C.
    10. Prepare Inibidor de Wnt-2 Produção (IWP-2) solução estoque (10 mM). Dissolve-se 2 mg IWP-2 em 429 ul de dimetilsulfóxido (DMSO). Preparar 10 uL alíquotas para armazenar a -80 ° C.
  4. Prepare completa Cardiologia Indução Médio. A 100 ml de Basal cardíaca meio de indução, adicionar 1 ml de 100x Pen / Strep a 1 ml de 100x de L-glutamina, 500 mL de transferrina, 1ml de ácido ascórbico descongelado de fresco, e 300 ul de MTG. Descarte médio não utilizado.

2. Preparação da placa de micropoços

NOTA: Todos os passos devem ser realizados numa câmara de segurança biológica.

  1. Adicionar 0,5 ml de solução de lavagem (componente do kit) para cada cavidade que irá ser utilizada na placa. Para assegurar que os contactos solução toda a superfície interior de cada micropoço, centrifugar a placa a 840 xg durante 2 min.
  2. Incubar a placa durante 30 a 60 min à temperatura ambiente.
  3. Aspirar a solução de lavagem de poços. Lavar cada poço duas vezes como se segue: Adicionar 1 mL de PBS a cada poço, a placa de centrifugação a 840 xg durante 2 min, e depois aspirar o PBS.

3. Formação de HPSC agregados na microplaca

NOTA: Todos os passos devem ser realizados numa câmara de segurança biológica.

  1. Coloque meio de lavagem em um banho de água C 37 °.
    NOTA: O volume necessário = 1 ml x número de poços de HpSC que vai ser dissociado.
  2. Dissociar hPSCs para células individuais
    Nota: Estes passos descrevem a dissociação de células cultivadas em placas de 6 cavidades - os volumes de reagente pode ser dimensionada proporcionalmente para diferentes formatos de cultura.
    1. Aspirar o meio de cultura a partir de cada cultura HPSC bem para a dissociação. Lavar cada poço com 1 ml de enzima de dissociação, e depois aspirar imediatamente a enzima de dissociação a partir de cada poço.
      NOTA: a dissociação da enzima residual deve ser suficiente para dissociar as células.
    2. Incubar a placa a 37 ° C durante 3 min.
    3. Adicionar 1 ml de meio de lavagem a cada poço e mecanicamente dissociar as células da superfície de cultura do tecido por pipetagem do meio de lavagem com uma micropipeta sobre a superfície do P1000 de cultura de tecidos. Se a dissociação parece ser incompletas e aglomerados celulares permanecem, passar a suspensão através de um filtro neste ponto.
    4. Transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 15 ml e armazenaro tubo na incubadora, enquanto a contagem de células é realizada no passo seguinte.
    5. Executar uma contagem de células:
      1. Retirar uma amostra de 10 uL da suspensão de células recolhido no passo anterior. Adicionar 30 ul de azul de tripano e misturar a suspensão bem por pipetagem.
      2. Transferem-se 10 ul de células com Trypan Blue-coradas para cada uma das câmaras de um hemocitómetro e visualizar sob o microscópio invertido com a objectiva 10X. Contar as células.
    6. A partir dos resultados da contagem de célula, calcular o número de poços pode ser semeadas a 1,2 x 10 6 culas por cavidade da placa de microcavidades. Calcular Média agregação necessária para propagar as células em 1 ml por poço.
    7. Prepare meio de agregação. Por 10 ml de completa cardíaca meio de indução, adicionar 0,5 ml de solução de estoque BMP4 (concentração final = 0,5 ng / ml) e Y-27632 Inibidor ROCHA (concentração final = 10 pM).
    8. Remover o tubo cónico contendo os hPSCs da incubadora e centrifuGE do tubo a 200 xg durante 5 min. Aspirar o meio de lavagem e ressuspender as células em meio de agregação a uma densidade de 1,2 x 10 6 culas por ml.
    9. Aspirar a solução de lavagem PBS, a partir de cada cavidade da placa de microcavidades. Usando uma micropipeta P1000, distribuir uniformemente e de sementes de 1 ml da suspensão de células para cada poço na placa de microcavidades. Às sementes de um grande número de poços, vortex periodicamente a suspensão de células para evitar a sedimentação.
    10. Centrifugar a placa a 200 xg durante 5 min. Observar a placa com o microscópio para confirmar as células têm girado para a parte inferior de cada micropoço.
    11. Incubar a placa durante 24 horas a 37 ° C em 5% de CO 2, 5% O 2 (hipoxia) incubadora.

4. Cardiac Indução Fase 1

  1. Um dia após a agregação (dia 1), preparar o volume necessário de uma fase meio de indução (para uma placa de 24 poços, 1 mL de volume = X número de poços). Para 1 ml de completameio de indução cardíaca, adicionar 1 ml de BMP4 solução de stock (concentração final = 10 ng / ml), 0,5 ml de solução de estoque de bFGF (concentração final = 5 ng / ml) e 0,6 ul de Activina A (concentração final = 6 ng / ml). Coloque a forma de um banho de água a 37 ° C durante pelo menos 15 min.
  2. Remova a placa de micropoços da incubadora. Inspecione os agregados sob o microscópio. Comparado a imediatamente agregação pós-centrífuga, eles devem aparecer intacta, com bordas lisas (mais redonda e menos quadrado do que no dia anterior).
  3. Remover o sobrenadante sem perturbar os agregados dentro dos micropoços:
    1. Segure a microplaca horizontalmente nível (ie., Não incliná-lo). Para cada poço na placa de micropoços, coloque a ponta de uma micropipeta P1000 na superfície do meio de cultura e contra o bordo do poço.
    2. remover lentamente o meio, tendo cuidado para não perturbar os agregados na parte inferior dos micropoços. Depois de reduzir tele nível médio de cerca de 1 a 2 mm a partir da superfície de micropoços texturizados, lentamente inclinar a placa para recolher médio de um dos lados do poço (uma vez que o volume é suficientemente baixa, o movimento de fluido é muito reduzida, e é mais fácil de evitar agregados ficando levantada fora de suas micropoços individuais). Lentamente, pipetar o meio remanescente no poço.
  4. Para adicionar fresco Fase 1 Indução Médio, assegurando simultaneamente os agregados permanecem em seus micropoços individuais: Draw 1 ml de meio de indução de Fase 1 com uma micropipeta P1000. Segurar a ponta da pipeta contra o bordo interior do poço e muito lentamente dispensar o meio contra a parede interior do poço. Repita o procedimento para os restantes poços.
  5. Retornar a placa à incubadora sob condições hipóxicas durante 3 dias.

5. Indução Fase 2 Cardíaca

  1. No dia 4, local de meio de lavagem (volume = número de poços x 2 ml) num banho de água a 37 ° C durante um mínimo de 15 min.
  2. Prepara-se o volume necessário de Fase 2 Indução médio (volume = número de poços x 1 ml): por ml de completa cardíaca meio de indução, adicionar 2 ml de solução de estoque de VEGF (concentração final = 10 ng / ml) e 0,5 ul IWP-2 solução de estoque (concentração final = 5 uM). Colocar o meio de indução preparado Fase 2 em um banho de água a 37 ° C durante um mínimo de 15 min.
  3. Usando uma pipeta de 5 ml serológico, colher os agregados a partir de cada cavidade da placa de microcavidades e recolher a suspensão agregada em um tubo de 15 ml (recolher até 10 poços por 15 tubo ml).
  4. Permitir que os agregados que se contentar com 15 min em uma incubadora hipóxico.
    NOTA: Este passo é importante para separar as células individuais e os restos celulares dos agregados intactos.
  5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente os agregados em 10 ml da pré-aquecido meio de lavagem para remover citocinas indutivos residuais (por exemplo, Activina A é uma molécula de sinalização potente, mesmo a muito baixas emissões de COncentrations).
  6. Centrifugar os agregados a 50 g durante 2 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em agregados pré-aquecido por indução 2 Médio.
  7. Transferir a suspensão agregada a uma placa de 24 poços de ultra-baixo de fixação (ULA) a 1 ml por poço. Observar os agregados sob o microscópio como uniforme, aglomerados de células apertados. Incubar em condições de hipóxia até o dia 6.

6. Indução cardíaca Fase 3

  1. No dia 6, preparar o volume necessário da fase 3 Indução médio (volume = número de poços x 1 mL). Para uma completa ml de Cardiologia meio de indução, adiciona-se 2 ul de solução de estoque de VEGF (concentração final = 10 ng / mL), e 0,5 ml de solução de estoque de bFGF (concentração final = 5 ng / ml). Coloque meio de indução preparado Fase 3 num banho de água a 37 ° C durante um mínimo de 15 min.
  2. Usar uma pipeta de 5 ml serológico para transferir os agregados para tubos de 15 mL cónico, reunindo-se a 10 ml de agregados por tubo.
  3. Permitir 10 min para os agregados para resolver. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os agregados no pré-aquecido Fase 3 Indução Médio. Usando uma pipeta de 5 ml serológico, redistribuir os agregados em uma placa de 24 poços ULA a 1 ml por poço.
  4. No dia 10, preparar o volume necessário da fase 3 Indução médio (volume = número de poços x 1 ml) como por Etapa 6.1.
  5. Use uma pipeta de 5 ml sorológico para transferir os agregados a 15 ml tubos cônicos, reunindo-se a 10 ml de agregados por tubo.
  6. Permitir 10 min para os agregados para resolver. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os agregados na Fase 3 Indução Médio. Usando uma pipeta de 5 ml serológico, redistribuir os agregados em uma placa de 24 poços ULA a 1 ml por poço.
  7. Incubar sob condições hipóxicas durante dois dias. No dia 12, começam incubação das células em níveis de oxigénio normóxicas para o restante do período de cultura (37 ° C, 20% de O2, 5% de CO 2).
    NOTA:Depois deste ponto de tempo, as células não são cultivadas sob condições hipóxicas.
  8. Repetir esta troca de meio completo (Passos 6,2 e 6,3) a cada 4 dias, começando 14 dias até à colheita de células (tipicamente, as concentrações máximas de cardiomiócitos são observadas após 14 dias de diferenciação).

7. Fluxo de Análise de Citometria de troponina cardíaca T (cTnT) Expression Frequência de Cultura Micropoço Output

  1. Dissociar os agregados como se segue:
    1. Use uma pipeta de 5 ml sorológico para transferir um bem de agregados a um tubo de 15 ml. Centrifugar os agregados a 50 xg durante 2 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado.
    2. Adicionar 1 ml de solução a 1 mg / mL de colagenase tipo II dissolvido de fresco para os agregados. Transferir a suspensão agregada a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar os agregados de colagenase tipo II durante a noite à temperatura ambiente.
    3. No dia seguinte, usar uma micropipeta P1000 dissociar delicadamente os agregadosnuma suspensão de células única homogénea. Se os agregados não são facilmente dissociar, resolver os agregados, aspirar o sobrenadante e incubar os agregados em 700 ul de enzima de dissociação para 1 a 2 min à temperatura ambiente. Pipeta suavemente os agregados de 1 a 2 vezes com uma micropipeta para dissociar P1000.
    4. Diluir a enzima de dissociação: Adicionar 700 ul de meio de lavagem contendo 14 ul de 1 mg solução estoque / ml DNAse. Tomar 10 ul a executar uma contagem de células, e centrifugar a suspensão restante usando uma microcentrifugadora de bancada a 300 xg durante 2 min.
  2. Executar uma contagem de células: mancha a amostra 10 ul de contagem com um volume igual de azul de tripano e contagem usando um hemocitómetro.
  3. Remover o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo as células restantes do microcentrífuga. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células, a uma concentração de 200.000 a 500.000 células por 100 ul, em Hanks Balanced Salt Solution contendo2% de Soro Fetal Bovino (HF).
  4. Para cada condição, transferir 100 ul de suspensão de células por poço para 2 poços de uma placa de 96 poços (uma bem serão coradas com o anticorpo TnT e o outro será o controlo de anticorpo secundário).
  5. Centrifugar a placa a 300 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante com uma micropipeta multicanal.
  6. Fixar as células: Adicionar 200 ul de solução de fixação (componente do kit) por poço e incubar a placa durante 15 minutos à TA.
  7. Centrifugar a placa a 300 xg durante 2 min. Use uma micropipeta multicanal para retirar cuidadosamente o sobrenadante dos poços. Elimine o sobrenadante em um recipiente de resíduos paraformaldeído.
  8. Lavar as células duas vezes fixos: Adicionar 200 ul de HF para cada poço. Centrifugar a placa a 300 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante, e repita o passo de lavagem mais uma vez. As células fixadas pode ser armazenado durante até uma semana, em HF a 4 ° C.
  9. Permeabilizar as células:
    1. Centrifugar a placa a 300xg durante 2 min.
    2. Adicionar 100 ul de solução de permeabilização (componente do kit) a cada poço e incubar a placa à temperatura ambiente durante 5 min.
    3. Centrifugar a placa a 300 xg durante 2 min e o sobrenadante aspirado.
  10. Prepara-se uma mistura principal de anti-TnT em HF na concentração óptima para um dado número de lote (A diluição óptima deve ser determinada por titulação e varia tipicamente de 1: 500 a 1: 2000).
  11. Para cada condição (2 poços por condição), adicione 100 ml de mistura principal para um poço (amostra corada) e 100 ml de HF simples para o outro bem (controle de anticorpo secundário). Incubar as células a 4 ° C durante 30 min.
  12. Centrifugar as células a 300 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 200 mL de HF por poço. Repita este passo de lavagem mais uma vez.
  13. Preparar um master mix do anticorpo secundário. Transferir um volume de HF que corresponde a 100 uL de cada poço (de controlo e anticorpo secundário-TnT manchado) a ser tratado. Adicionar 1 mL de anticorpo secundário de cabra anti-ratinho-APC por 200 ul de HF (diluição 1: 200).
  14. Corar as amostras. Adicionar 100 ul de solução de coloração a cada poço (tanto o controlo de anticorpo secundário anti-poços e TnT-corados). Incubar as células no escuro a 4 ° C durante 30 min (manter a placa coberta ou no escuro após a adição de anticorpo secundário fluorescente para evitar a fotodegradação).
  15. Centrifugar as células a 300 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 200 mL de HF por poço. Repita este passo de lavagem mais uma vez.
  16. Transferir as amostras de 5 ml de fundo redondo de fluxo citómetro tubos de análise e realizar citometria de fluxo para o sinal no canal de APC usando os protocolos padrão para o instrumento 19.

Results

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agregados de tamanho controlado de hPSCs pode efetivamente ser formada utilizando o sistema de micropoços, dependente apenas da concentração de células e a área de superfície do micropoço. Após uma breve centrifugação, o número apropriado de células (1.000) neste protocolo são reunidas em cada micropoço (Figura 1A). É importante ressaltar que essas células restabelecer conexões intracelulares dentro de 24 horas, e não deve encher o bem, mas aparecem como agregados compactos com bordas lisas (Figura 1B). Estes agregados fornecer os materiais de partida para uma maior diferenciação para um destino cardíaca. Se as células não conseguem formar aglomerados apertados, isso sugere uma possível morte celular após a dissociação e reagregação, e a adequação das concentrações individuais Passaging celular e inibidor da rocha por uma linha celular particular, devem ser examinadas. Os seguintes três dias em micropoços mostram pouca alteração na morfo agregadologia, embora algum crescimento é evidente. Quando removida dos micropoços, os agregados devem manter a sua volta, morfologia apertada e ser de um tamanho similar a um outro (Figura 1C). Cultura em ULA placas de 24 poços irá permitir a expansão das células e o crescimento.

De dia 8, após a exposição primeiro a Activina de sinalização, e inibição Wnt, os agregados começará a aparecer como maior e mais brilhante agregados (Figura 1D). Durante este período, os restos celulares considerável será evidente na parte inferior de cada poço e deve ser removido, permitindo que os agregados de resolver antes de remover meios. Ocasionalmente, muitos agregados irá fundir. Isto não irá inibir a diferenciação de outros agregados no poço, embora estes "super" agregados tendem a não exibir as alterações morfológicas observadas com agregados mais pequenos e são menos susceptíveis de sofrer diferenciação completa.

"Jove_content" fo: manter-together.within-page = "1"> a diferenciação resulta em alterações morfológicas notáveis ​​para os agregados com um aumento do tamanho e a aparência das regiões fibrosas organizados. Por volta do dia 12, os agregados contratantes podem ser observados. Estes irão sempre ser constituído por células grandes, muitas vezes transparentes e incluem extensa matriz extracelular fora do agregado (Figura 2). Enquanto as contrações todo o agregado indicam uma diferenciação bem sucedida, expressão marcador cardíaco também pode ser observada em agregados que não aparecem para se contrair. Após dissociação de agregados e de imunomarcação, a maioria das células vai ser positivo para o TnT cardiomiócitos marcador por citometria de fluxo (Figura 3). A expressão deste marcador é estável nas células e pode ser observada em agregados tão tarde como 19 dias de diferenciação.

1.jpg "/>
Figura 1: Cronologia da HPSC diferenciado para um destino cardíaca Imediatamente após a agregação, as células quase encha cada micropoço (A).. Um dia mais tarde, os agregados apareça condensado e lisa (B). Esta morfologia persistir mesmo quando os agregados são removidos a partir dos micropoços, e plaqueadas em placas de cavidades (C). De dia 8, os agregados começam a se expandir e aparecem de cor mais clara (D). Barra de escala:. 250 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-1
Figura 2: Agregados Comece contratante Dia 12 de Diferenciação Depois de seis dias em Cardiac Indução Fase 3 Médio, foram observadas contrações todo o agregado contundentes (painel superior:. Relaxarção, painel médio: contração). O painel inferior é derivado subtraindo os painéis superior e médio, com a maioria das diferenças significativas que aparecem como preto ou branco (setas). Barra de escala:. 250 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3:. Imunomarcação para a troponina cardíaca T em Diferenciada hPSCs No dia 17, a maioria das células são positivas para a troponina T cardíaca por citometria de fluxo (histograma a cheio). Também são mostradas as células marcadas com anticorpo secundário sozinho (histograma não preenchido). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

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Tem sido observado que a diferenciação cardíaca eficiente de células estaminais pluripotentes é um processo altamente variável. Enquanto, não é surpreendente que as diferentes linhas celulares apresentam diferentes propensões para capacidade de diferenciação de tipos específicos de células, tem-se observado que a eficiência diferenciação cardíaca varia dramaticamente entre replicado é executado usando a mesma linha de células de seis. O protocolo descrito aqui aborda uma importante fonte desta variabilidade, controlando diretamente o número de células de entrada por agregado. Para reduzir ainda mais a variabilidade entre as execuções, recomenda-se que as linhas HPSC adaptados para passagem em células individuais são utilizados, dado que esta forma de HPSC expansão e manutenção resulta em populações pluripotentes mais consistentes em relação às frequências de expressão de marcadores de pluripotência (por exemplo, Oct4, Nanog, Tra-1-60, etc.).

O protocolo conforme escrito aqui especifica um tamanho total de 1.000 células para oindução cardíaca ptimal a partir da linha de células estaminais embrionárias de HES-2. Para aplicar este protocolo a diferentes linhas celulares, é fundamental que uma tela de tamanho agregado inicial ser realizados para determinar o tamanho do agregado óptima linha específica de célula. Embora não impactar diretamente os procedimentos a seguir aqui, nós lembrar ao leitor que as mudanças no tamanho do agregado e densidade de células em geral se espera que afectem a oferta de oxigênio. Isso pode se tornar uma consideração relevante em aplicações a jusante. Além disso, a morte celular por apoptose é uma preocupação durante a dissociação do hPSCs para células individuais. Portanto, é fundamental para garantir que inibidor ROCHA está presente durante a agregação de células forçada nos micropoços. Finalmente, é essencial que no dia 4 de diferenciação os agregados são bem lavada para remover vestígios de Activina A, presente na indução uma médio, antes de ressuspensão em 2 Indução Médio. Após 4 dias de diferenciação, Activina A promove a diferenciação endoderme à custa de mesoindução Derm 20.

A principal aplicação desta técnica é a tela tamanho dos agregados que promovem a diferenciação cardíaca eficiente. No entanto, uma das limitações da técnica atual é que é um desafio para a escala de produção cardíaca para níveis clinicamente relevantes usando placas de micropoços. Scale-se de diferenciação cardíaca é normalmente realizado em condições de cultura de massa em biorreatores suspensão agitada 21. Por conseguinte, uma vez que o sistema de micropoços foi usado para determinar os limites aceitáveis ​​de tamanho dos agregados para a indução cardíaca eficiente, o próximo passo é para dimensionar-se para determinar as velocidades do impulsor biorreactor que pode gerar o tamanho dos agregados de células desejada.

Uma das diferenças significativas desta técnica com relação a outros métodos de diferenciação cardíaca agregado à base é que ele permite investigações directos para modular os efeitos da sinalização endógena em agregados, bem comoa co-cultura de indutivas / tipos de tecidos inibitórios com os hPSCs no agregado 13. Estes tipos de investigações pode informar o desenvolvimento de processo de produção cardíaca em grande escala.

Disclosures

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A M.U. tem interesse financeiro na tecnologia de micropoços subjacente.

Acknowledgements

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Agradecemos ao Dr. Peter Zandstra, em cujo laboratório este protocolo foi desenvolvido, e aos Drs. Mark Gagliardi e Gordon Keller, que prestaram assistência no estabelecimento dos métodos iniciais nos quais este processo foi baseado. O desenvolvimento do protocolo foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação em ciência e tecnologia de Ontário para CB e uma doação da Heart and Stroke Foundation de Ontário para Peter Zandstra.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
de segurança biológica
Auxiliar
Pipetas sorológicas (5 a 25 ml) 
Aspirador
Pipetas de aspiração ou Pasteur
Hotte
0,22 µ m filtro de seringa
5% CO2, 5% O2, e incubadora de cultura celular controlada por umidade Incubadora hipóxica (baixo teor de oxigênio)
5% CO2, 20% O2, e incubadora de cultura celular controlada por umidade 
Centrífuga de baixa velocidade com rotor de balde oscilante equipado com suporte de placa 
Micropipetadores P2, P20, P200 e P1000 e pontas associadas 
Microscópio invertido com objetivas de fase 4X, 10X e 20X 
Placas de 24 poços Ultra-Low Attachment (ULA)Corning/Costar3473
microcentrífuga de 1,5 ml
Microcentrífuga
Ácido L-ascórbicoSigma-AldrichA4403
Água destilada ultrapura estérilSigma-AldrichW3500
Vortex
Ice
-20 & graus; C freezer
MonotioglicerolSigma-AldrichM6145Tóxico; A alíquota de MTG é fortemente recomendada para minimizar a oxidação devido à abertura repetida. As alíquotas podem ser armazenadas a 4 &graus; C por até 3 meses, -20 & C é recomendado para armazenamento de longo prazo.
StemPro-34 MediumThermo Fisher Scientific10639-011Basal Cardiac Induction Medium; O suplemento é armazenado a -20 &graus; C e o meio basal a 4 °C.
TransferrinRoche10652202001
BMP-4R& D Technologies314-BP
bFGFR& D Technologies233-FB
VEGFR& D Technologies293-VE
Activin AR& D Technologies338-AC
IWP-2Reagents Direct57-G89
Phosphate buffered salino (PBS)Thermo Fisher Scientific14190
Bovine Serum Albumin (BSA)Thermo Fisher Scientific15561
Ácido clorídrico Sigma-Aldrich258148
Dimetilsulfóxido Corrosivo (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660
100x Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15140
100x L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030
Knockout Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828010
TrypLE SelectThermo Fisher Scientific12563Enzima de dissociação
Hemocitômetro
Trypan Blue
Aggrewell 400 placasStemCell Technologies27845Placas de micropoços
Solução de enxágue AggrewellStemCell Technologies7010Microwell Rinsing Solution
Y-27632 ROCK InhibitorTocris1254
Collagenase Tipo IISigma-AldrichC6885 
Solução salina balanceada Hank'sThermo Fisher Scientific14025092
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific12483
Placa de 96 poços (para coloração FACS)
Reagente de permeabilização intrapreparadaKit Beckman CoulterIM2389com 2 partes: Solução de fixação e solução de permeabilização; Neomarcadores tóxicos
de anticorpos cTnTMS-295
cabra anti-rato-IgG APC anticorpoThermoFisherMolecular ProbesA865
5 ml tubos de citometria de fluxo de fundo redondoFACS dependente da
Cabine de pipeta 15 e 50 ml tubos cónicos Tubos dede bancada máquina

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