Imagens de cálcio na<em&gt; Drosophila</em&gt; At Activation Egg

Resumo

Este artigo descreve um protocolo adaptável ex vivo para a visualização de ^{Ca2 +} durante a ativação do ovo em Drosophila.

Resumo

A ativação do ovo é um processo universal que inclui uma série de eventos para permitir que o óvulo fertilizado complete a meiose e inicie o desenvolvimento embrionário. Um aspecto da ativação do ovo, conservado em todos os organismos examinados, é uma mudança na concentração intracelular de cálcio (Ca²⁺), muitas vezes denominada 'onda de Ca²⁺'. Embora a velocidade e o número de oscilações da onda de Ca²⁺ variem entre as espécies, a mudança no Ca²⁺ intracelular é fundamental para provocar eventos essenciais para o desenvolvimento embrionário. Essas alterações incluem retomada do ciclo celular, regulação do mRNA, exocitose do grânulo cortical e rearranjo do citoesqueleto.

No ovo maduro de Drosophila, a ativação ocorre no oviduto feminino antes da fertilização, iniciando uma série de eventos dependentes de Ca²⁺. Aqui apresentamos um protocolo para imagens da onda Ca²⁺ em Drosophila. Essa abordagem fornece um sistema de modelo manipulável para interrogar o mecanismo da onda Ca²⁺ e as mudanças a jusante associadas a ela.

Introdução

Uma alteração na concentração intracelular de Ca ²⁺ em ovo (oócitos) de activação é um componente conservado de todos os organismos estudados ^1,2. Este evento inicia uma vasta gama de processos dependentes de Ca ^2+, incluindo retomada do ciclo celular e a tradução de mRNAs armazenados. Devido a esta exigência de Ca ^2+, visualizando as alterações transitórias em concentrações intracelulares de Ca ²⁺ tem sido de interesse chave.

Historicamente, foram seleccionados organismos modelo para estudos de activação de ovo com base no tamanho e disponibilidade dos seus ovos. Várias abordagens de visualização têm sido utilizadas para seguir e quantificar as alterações na concentração de ^{Ca2 +} intracelular em tais sistemas, incluindo: a aequorina fotoprote�a em medaka peixes ^3; Ca ²⁺ corantes fluorescentes sensíveis, tais como Fura-2 em ouriço-do-mar e hamster ^4,5; e cálcio verde-1-dextrano em Xenopus ^6.

A geração e melhoria de indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIS) transformou a capacidade de visualizar ^{de Ca2 +} dinâmica in vivo ^7. Estas construções genéticas são expressas em tecidos específicos e limitar a necessidade de preparações de tecidos invasivos ^8.

GCaMPs são uma proteína fluorescente (GFP) classe baseado verde da Gecis que têm sido muito eficaz devido à sua elevada afinidade ^{de Ca2 +,} razão e capacidade de sinal-ruído para ser personalizado ^9-11. Na presença de ^{Ca2 +,} o complexo GCaMP sofre uma série de alterações conformacionais, que começa com a ligação de Ca ²⁺ para a calmodulina, que resulta em um aumento da intensidade de fluorescência da GFP componente ^9.

GCaMPs têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre neurônios Drosophila visualize as alterações de cálcio intracelular ^12. Os applicati recenteson da tecnologia GCaMP para visualizar Ca ²⁺ em ovos de Drosophila maduros revelou uma única transiente ^{de Ca2 +} onda de activação de ovo ^13,14. A onda ^{de Ca2 +} pode ser visualizada a baixa ampliação durante a ovulação in vivo ¹³ ou em maior ampliação usando um ensaio de activação ex vivo ^13,14. No ensaio ex vivo, os oócitos maduros individuais são isolados a partir dos ovários e activado usando uma solução hipotónica, referido como tampão de activação, o que foi mostrado para recapitular eventos de activação in vivo, em ^15-17.

Este ensaio ex vivo permite a visualização de alta resolução fácil da onda ^{de Ca2 +,} sob diferentes condições experimentais, incluindo perturbação farmacológica, manipulações físicas e mutantes genéticos. Este artigo demonstra a preparação de ovos de Drosophila maduras para a activação ex vivo e The subsequente microscopia usado para visualizar a onda ^{de Ca2 +} utilizando GCaMP. Esta abordagem pode ser utilizada para testar a iniciação e controlo da onda de ^{Ca2 +} e a sonda resultados jusante.

Protocolo

Nota: Realizar todas as medidas à temperatura ambiente, salvo indicação contrária.

1. Preparação para Dissection

Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com E. gavis, Universidade de Princeton & Weil et. al. ^18. Execute os seguintes passos dois dias antes de imagem.

1. Aqui fly um frasco contendo aproximadamente 10 ml de comida sólida e adicionar uma pequena quantidade de fermento seco para um canto, inferior a 1 g é suficiente.
   Nota: Para obter informações sobre frascos de voar ou de alimentos ver 'Drosophila Manutenção' ^19.
2. Adicionar 1 - 3 gotas de água para hidratar a levedura.
3. Definir o frasco de lado em um ângulo de 45 ° e permitir 3-5 min para a levedura para assumir a água.
4. Enquanto a levedura é a absorção de água, seleccionar uma garrafa de moscas que expressam GCaMP5 MYR UASt- ²⁰ impulsionado por banheira-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que surgiram recentemente (um myristoyforma lada do GCaMP5 foi escolhido para fornecer um sinal de alta-ruído através de amarrar o GECI à membrana dentro do ovo).
5. Anestesiar as moscas na garrafa com gás _CO2. Certifique-se de manter a garrafa invertida de modo a não perder moscas na comida húmida.
6. Dica as moscas anestesiados em uma almofada de CO ₂ e tipo 10 - 15 mulheres e 5 homens usando um pincel sob um microscópio de dissecação. Nota: É padrão para incluir machos para fornecer fêmeas saudáveis ​​para dissecção.
7. Quando o frasco do passo 1.3 está pronto, adicione as moscas selecionados para o frasco. Tome cuidado para manter a horizontal frasco até que as moscas se tornar ativo.
8. Colocar o frasco a 25 ° C durante aproximadamente 36 h.
9. Retornar as moscas remanescentes do CO ₂ pad para a garrafa ou descarte.

2. Dissecting Drosophila Ovário

Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com Weil et. ai. 18.

1. Após 36 h, anestesiar as moscas do frasco yeasted com CO _2.
2. Uma vez que as moscas dentro do frasco são anestesiados ponta-los para a almofada de CO ₂ a ser classificados com um pincel sob um microscópio de dissecação.
3. Selecione uma fêmea.
4. Isolar os dois ovários de fêmea. Para protocolo detalhado completo ver Weil et. al. ^18. Em suma:
   1. Colocar uma pequena gota de óleo de hidrocarbonetos halogenados oxigenado (série 95) em um n ° s 1.5, 22 x 40 milímetros lamela.
   2. Agarrar a fêmea com uma pinça na anterior do abdome.
   3. Segurando a fêmea sob o microscópio de dissecação, use o segundo conjunto de pinças para remover suavemente a parte posterior da fêmea.
   4. Limpe o tecido posterior do segundo fórceps.
   5. Espremer na cavidade abdominal com a segunda pinça do anterior para o posterior do abdómen. Os dois ovários opaco deve ficar para a pinça quando fora da FEMAle.
   6. Toque nos ovários no óleo.
   7. Remover qualquer tecido do fórceps por limpando os fórceps.
   8. Repita essas etapas (2.4.1 - 2.4.7) para obter três lamelas, cada um contendo os ovários de uma mosca.

3. Isolando Individual óvulos maduros

1. Sob um microscópio de dissecação padrão com a ampliação definido para 4X, na primeira lamela a partir do passo 2.4, separar os dois ovários, rasgando a tuba uterina.
2. Introduzir um par de fórceps fechadas para o centro de um único ovário, tomando cuidado para não perfurar quaisquer câmaras de ovo.
3. Insira uma sonda de dissecação padrão para o centro do ovário ao lado das pinças fechadas.
4. Suavemente arrastar a sonda de dissecação através do ovário para o pólo posterior, onde os óvulos maduros (fase 14 câmaras de ovo) estão localizados.
5. Repita os passos 3.1 - 3.4 2-5 vezes, dependendo do tamanho do ovário e do número de ovos.
   Nota: A adição de CO ₂ normalmente provoca a deposição de um único ovo que aparecerá maior com apêndices dorsais elevado que os ovos depositados previamente. Este ovo deve ser descartado para a imagem latente, uma vez que já foi activado dentro da fêmea.
   Nota: óvulos maduros são susceptíveis de separar facilmente a partir de tecido conjuntivo de ovário.
6. Se não houver óvulos maduros são visíveis fora do ovário, continue suavemente provocando com a sonda de dissecação.
7. Uma vez que os ovos maduros são visíveis na lamela fora do ovário, manobrar 3-5 numa linha no centro da lamela.
   Nota: Para obter os melhores resultados, a sonda de correr suavemente ao longo do lado dos ovos.
   Nota: Evite puxando os apêndices dorsais, pois isso pode danificar o óvulo.
   Nota: Dependendo do futuro imaging set-up, alinhe os ovos cerca de 200 mm além perpendicular à lamela para a área máxima de imagem.
8. Uma vez alinhados, remover o resto do tecido do ovário, arrastando-a para longe dos ovos alinhadas utilizando o forceps.
9. Retire o excesso de óleo, esfregando com o canto de limpar um médico. Tenha cuidado para não tocar os ovos maduros com o médico limpe ovos, como maduras que são contactadas serão perdidos.
10. Desenhar uma cruz sobre a lamela com um marcador para simplificar a colocar a amostra sob o microscópio.
11. Defina a lamela em um lugar seguro e deixar as câmaras de ovos preparados na lamela para descansar por 5 - 10 min. Isso permite que o ovo se estabelecer no óleo. As amostras podem ser utilizados até 1 h após a dissecação.
12. Repita os passos 3,1-3,11 para o resto das lamelas com ovários sobre eles.

4. Preparar for Imaging

1. Traga tampão de activação preparado para ¹⁵ temperatura ambiente.
   Nota: tampão de activação é um tampão hipotónico: 3,3 mM de NaH ₂ PO _4, 16,6 mM de KH ₂ PO _4, 10 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5% de polietileno glicol 8000, CaCl2 ₂ mM, levada a pH 6,4 com uma mistura 1: 5 proporção de NaOH: KOH.Para mais informações ver Mahowald, 1983 ^15. Alíquotas de tampão de activação pode ser armazenado a -20 ° C durante meses e a 4 ° C durante até 2 semanas.
2. transportar cuidadosamente lamelas preparados, tampão de activação e pipetas de vidro para a instalação de imagem.
   Nota: Uma de campo amplo, confocal, de disco rotativo ou folha microscópio de luz pode ser utilizado. Recomendamos o uso de um microscópio invertido. Os resultados representativos foram obtidos utilizando um microscópio confocal.
3. Um objectivo adequado para imagiologia de todo o óvulo maduro deve ser escolhida (aqui: 20X 0,7 NA).
4. Montar a primeira lamela preparado para o palco microscópio. Tome cuidado para não quebrar as lamelas no palco.
5. Qualitativamente selecionar um campo de visão com uma câmara de óvulo maduro para a ativação. Do não de imagem perfurada câmaras de ovo ou aqueles com formação de bolhas na membrana.
   Nota: Para obter etapas 4.6 - 4.7, comandos de software irá variar dependendo do microscópio e fabricante.
6. Set parágrafo imagingmetros para a excitação padrão GFP (488 nm) e emissão (500-580 nm). Também configurar uma vista de campo brilhante, a fim de visualizar e orientar o óvulo maduro e óleo de deslocados.
7. Seleccionar o menor plano z em que os ovos maduros são visíveis e definir um Z-pilha completa para ser levado para 40 um a cerca de 2 mM por passo. Defina os parâmetros para que haja nenhum atraso entre a aquisição Z-stack. Definir a série de tempo para capturar cerca de 30 min.

5. Activação de imagem Ex Vivo ovo

1. Comece a captura da imagem.
2. Espere por 1 - 2 completos Z-stacks a serem adquiridos. Isto mostra o óvulo maduro antes da activação.
3. Retirar cerca de 300 ul de tampão de activação para uma pipeta de vidro.
4. Posicionando a ponta da pipeta de vidro contendo tampão de ativação em um ângulo de 45 ° acima da lamela, mova lentamente a pipeta no caminho do feixe até que esteja diretamente acima do óvulo maduro que está sendo trabalhada. A pipeta de vidro deveser de 1 - 2 cm acima do óleo.
5. Adicionar 1 - 2 gotas de tampão de activação em menos de 5 segundos a partir da pipeta de vidro. Isto deve deslocar o óleo. Evitar a adição de tampão de activação de excesso ou tocar no ovo com a pipeta de vidro, uma vez que pode causar o deslocamento do óvulo maduro. Tome cuidado para não tocar a lamela com a pipeta, pois isso pode causar uma mudança no plano ou bolhas de ar focais a se formar no óleo de imersão entre o objetivo e lamela.
6. Embora a adição de tampão de activação durante a aquisição de imagem, verificar o canal de campo brilhante para assegurar que o óleo tenha sido deslocado pelo tampão de activação.
   Nota: Isto irá aparecem pela primeira vez como uma sombra devido à pipeta quebra do caminho do feixe, mas também irá resultar no aparecimento de gotas de óleo pequenas. Algumas gotas de óleo pode permanecer associado com o óvulo maduro que irá afectar os resultados experimentais e a qualidade da imagem.
7. Se o óleo não é deslocada a partir da adição inicial de tampão de activação de repetir os passos 5,4-5.6.
8. Uma vez que o óleo é deslocado com sucesso, permitem que a série de tempo para ser executado até a conclusão.
   Nota: Devido ao inchaço dos oócitos em ativação, algumas câmaras de ovo irá mover drasticamente fora do plano focal ou campo de visão após a adição de tampão de activação. Nesta situação, pare a aquisição e montagem da próxima lamela.
9. Depois da sequência de imagem concluiu aquisição, salvar os dados.

6. Pós-aquisição de Processamento de Imagem

1. Abra o conjunto de dados usando Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), ou software de processamento de imagem equivalente, e selecione os arquivos relevantes para a análise.
2. Para construir uma projeção dos dados adquiridos selecione: Imagem> Pilhas> Z-projeto.
3. Selecione um começo Z-slice e uma Z-slice parada, geralmente toda a seção. Selecione um tipo de projeção, normalmente definido como 'Max intensidade ". Marque a caixa tick 'All Time Frames "para aplicar as configurações selecionadas para toda a série.
4. E semais de um canal fluorescente foi fotografada, use a ferramenta Canais para permitir o movimento entre as cores, fazer um composto, ou fazer a escala de cinza da imagem. Selecione Imagem> Colors> Canais ferramenta.
5. Para ajustar o brilho eo contraste da imagem, selecione Image> Adjust> Brightness / Contrast.
6. Para exportar uma única imagem, mover controle deslizante escala de tempo para o quadro relevante e selecione Arquivo> Salvar como> JPEG ou qualquer formato preferido.
7. Escolha um local e título para o arquivo exportado, em seguida, salvar.
   Nota A taxa de quadros a partir do software de imagem será obrigado a dar uma data e hora na imagem.
8. Para exportar a série temporal como um filme selecione: File> Save As> AVI, em seguida, selecione a taxa de quadros (~ 7 quadros por segundo).
9. Escolha um local e título para o arquivo exportado, em seguida, salvar.
10. Para salvar o arquivo no formato ajustado Fiji, selecione Arquivo> Salvar.

Resultados

Aqui demonstramos como preparar ovos de Drosophila maduros para a activação ex vivo. Ovos expressam um GECI permitir imagens de Ca ²⁺ dinâmica na activação de ovo e o início do desenvolvimento embrionário (Figura 1). Deve notar-se que, dependendo da GCaMP usado, especificamente a presença de um grupo miristoílo, os resultados podem ter pequenas diferenças qualitativas ^{13 14.} Nós também têm demonstrado um papel para a actina funcional durante a activação do ovo por meio da adição de um inibidor de polimerização de actina, citocalasina D, para o tampão de activação (Figura 2) ^14.

Um requisito para o citoesqueleto na activação do ovo é conservada. Em C. elegans, após a fertilização, os componentes do citoesqueleto são reorganizados para preparar o embrião de uma célula para a primeira divisão assimétrica ^21,22. Em ouriço do mar, a perturbação dos cytoskeleTal re-organização após activação foi mostrado para afectar o ciclo celular, prevenindo a formação do anel ²³ contráctil. O papel da actina na mediação de uma onda ^{de Ca2 +} e sua função jusante para ativação ovo em Drosophila continua a ser totalmente elucidado.

Em Drosophila, o co-visualização da onda do citoesqueleto de actina e ^{de Ca2 +} pode ser conseguida utilizando este ensaio de activação ex vivo. Séries temporais de vários canais podem ser adquiridas e dinâmica do ^{Ca2 +} intracelular pode ser combinado com mudanças na organização da actina no oócito (Figura 3).

Figura 1:. A Single Ca ²⁺ onda em série Drosophila Egg Activation Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 seguindo a umddition de tampão de activação (AH). O aumento no Ca ²⁺ citoplasmático origina-se no polo posterior (B) e propaga (BF) com uma velocidade média de cerca de 1,5 um / seg. Iniciação da onda é tipicamente observada dentro de 3 minutos da adição de tampão de activação. Após a activação, os níveis de cálcio intracelular do óvulo maduro retorna aos níveis (G, H) de pré-activação. Veja o filme suplementar 1 (tempo total de 33 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A adição de citocalasina D da Activação: Tampão perturba Ca²⁺ Propagação de Ondas. A série da ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 após a adição de tampão de activação contendo / ml concentração final citocalasina D 10 mg (AH). Embora a onda ²⁺ Ca é iniciada no pólo posterior (A), que é comprometida e não atinge o anterior do ovo (F) (setas brancas indicam a frente da onda). Nenhuma outra Ca ²⁺ foram observadas alterações ao longo de 30 min). Veja o filme suplementar 2 (total de tempo de 30 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Co-visualização de actina e Ca ²⁺ em EAtivação gg em série Drosophila. Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 (ciano) e UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) após a adição de tampão de activação (AH). O Ca ²⁺ onda inicia a partir do pólo posterior e recupera como na Figura 1. Actina parece estar mudando ao longo do tempo, as setas brancas (A vs H). A falta de detecção do sinal ^{de Ca2 +} no centro do óvulo maduro é devido ao movimento da amostra durante a captura de imagem. Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O primeiro passo crítico neste protocolo é isolar os ovos maduros sem danos. Isso pode ser conseguido por manobras gentílicas dos ovos com a sonda de dissecação. A prática permitirá que essa manipulação seja executada sem danificar os ovos. Um segundo passo crucial é evitar a perda da amostra quando o tampão de ativação é aplicado ao ovo maduro em óleo. A aplicação do tampão de ativação deve ser feita lentamente e sem contato com a lamínula. Esta etapa pode ser desafiadora se a configuração do microscópio não permitir um acesso fácil à amostra. É aconselhável mover as partes axilares do microscópio, como uma incubadora de temperatura.

Modificações neste protocolo podem ser feitas para visualizar outros fatores marcados com fluorescência, em vez de Ca²⁺ na ativação do ovo. De forma mais geral, diferentes estágios de desenvolvimento de Drosophila ou os resultados da adição de um tampão diferente podem ser analisados usando este protocolo.

A solução de problemas pode ser necessária se as configurações do microscópio não forem ideais para visualizar o sinal da amostra. Isso pode ser alcançado aumentando ou diminuindo a potência do laser, alterando o alcance de captura e ajustando os parâmetros da pilha Z. Outro problema pode ser que os ovos se movam consistentemente para fora do campo de visão após a adição do buffer de ativação. Se isso acontecer regularmente, deixe os ovos maduros se depositarem nas lamínulas por um longo período de tempo, 15 a 20 minutos. Esteja ciente de que o uso de um óleo de viscosidade mais alta alterará o deslocamento do óleo pelo tampão de ativação.

Esta técnica aqui apresentada é limitada pela distância de trabalho da objetiva, desidratação dos ovos maduros e capacidade de dissecar os ovos maduros sem danos. No entanto, quando comparado aos métodos de imagem in vivo onde o oócito maduro passa pela fêmea adulta e é depositado ¹³, nosso método permite maior resolução espacial, a opção de manipular fisicamente o óvulo maduro antes da ativação e a capacidade de testar o papel da ativação do óvulo sem fertilização.

Existem muitas aplicações futuras potenciais dessa técnica, incluindo o teste de construções repórter para componentes celulares na ativação do ovo e a visualização da onda Ca²⁺ em fundos mutantes ^14,24. Juntamente com ferramentas experimentais e genéticas, o ensaio de ativação ex vivo do ovo aqui apresentado permite o estudo do gatilho, propagação e efeitos a jusante da onda Ca²⁺ universalmente conservada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Levedura ativa seca	Fleischman» s	#2192
Microscópio de dissecação	Leica	MZ6	Vários funcionarão
Lâmpada	Mircotec Fibra óptica	MF0-90	Vários funcionarão
Toalhetes médicos	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Caneta marcadora	Stabilo	841/46	OHPen universal, preta - disponível na maioria das papelarias. Almofada Superfine Width 0.4 mm
CO2	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Óleo de halocarbono, série 95	Halocarbon Products Corp.	Distribuidor na Europa:
Solvadis (GMBH)
Óleo 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Pode ser usado em vez de óleo de halocarbono, série 95
Fórceps	Fine Science Tools	11252-00	Embora essas ferramentas devam estar limpas, não é necessário o uso de uma autoclave, o etanol seria suficiente.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Pipeta de vidro	Fisherbrand,FB50251		Pipetas Pasteur, vidro, desplugadas, 150 mm de comprimento
Frasco	Regina Industries	P1014	GPPS  80 mm x 25 mm