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Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

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DOI:

10.3791/54312

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30 de janeiro de 2017

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1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Neste artigo

Resumo

Descreve-se um ensaio rápido, com base molecular da gripe A e B. O ensaio detecta Influenza cada alvo dentro de 15 min, utilizando amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. O ensaio de Influenza A e B é de fácil utilização e necessário hands-on tempo mínimo para executar.

Resumo

A gripe é uma doença respiratória contagiosa causada por vírus da gripe A e B em seres humanos e faz com que uma quantidade significativa de morbilidade e mortalidade a cada ano. A Influenza A e B do ensaio foi o primeiro teste molecular gripe rápida dispensada-CLIA disponível. O teste de Influenza A e B funciona através do emprego de amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. Aqui, o desempenho do ensaio de Influenza A e B em congelado, arquivado esfregaço nasofaríngeo (NPS) amostras armazenadas no meio de transporte viral (VTM) foram comparados com um ensaio de painel respiratório.

O desempenho do ensaio de Influenza A e B foi avaliada por comparação dos resultados com o método de referência do painel respiratório. A sensibilidade para o vírus total de influenza A foi 67,5% (CI de 95% (IC), 56,6-78,5) e a especificidade foi de 86,9% (Cl, 71,0-100). Para os testes de vírus da gripe B, a sensibilidade e a especificidade foram de 90,2% (Cl, 68,5-100) E 98,8% (Cl, 68,5-100), respectivamente.

Este sistema tem a vantagem de um tempo de teste significativamente mais curto do que qualquer outro ensaio molecular actualmente disponíveis e o processo simples, livre de pipeta é executado em um sistema totalmente integrado, fechada, de pequenas dimensões. No geral, a Influenza A e B ensaio avaliada neste estudo tem o potencial de servir como um teste de diagnóstico da gripe rápida point-of-care.

Introdução

Infecções de vírus da gripe resultar em uma quantidade significativa de morbidade e mortalidade em cada ano 1, 2, 3. Influenza não complicada é caracterizada por sintomas respiratórios e constitucionais, tais como febre, mialgia, dor de cabeça e tosse não produtiva 4, 5. Os indivíduos mais velhos, crianças, doentes imunocomprometidos e pacientes com comorbidades subjacentes correm um risco maior de complicações graves, como pneumonia, miocardite, doença do sistema nervoso central, ou morte 6, 7.

Infecção por influenza é original de outros vírus respiratórios em que a administração rápida de terapêutica antiviral dentro de 48 h do início dos sintomas pode reduzir a gravidade da doença e comprimento 8. A identificação rápida da gripe, também tem sidomostrado para reduzir o uso de antibióticos desnecessários 9, 10. Além disso, pacientes hospitalizados com infecções de gripe devem ser colocados em quartos isolados com precauções de controle de infecção apropriadas. No entanto, doenças respiratórias provocadas por vírus influenza não pode ser difícil distinguir clinicamente de gripe. Por esse motivo, os testes de diagnóstico rápidos e precisos para a gripe é muito importante para a gestão clínica do paciente.

Vários ensaios estão disponíveis para a detecção e identificação dos vírus da gripe. Os testes de detecção de antígeno da gripe rápidas (RIDTs) são amplamente utilizados na prática clínica como testes point-of-care, porque eles são simples de usar e fornecer resultados dentro de 15 a 30 min 11, 12; no entanto, as suas sensibilidades variam muito (10-80%), dependendo do fabricante e da população que está sendo testado, eo tipo de gripe e subtyPE 13, 14, 15. Ensaios de fluorescência direta (DFAS) fornecem sensibilidades superiores sobre RIDTs, mas o tempo de processamento é maior (~ 3 horas) e deve ser concluída por técnicos qualificados 16, 17. A cultura viral tem sido o padrão ouro para o diagnóstico da gripe e melhorou a sensibilidade sobre ambos os RIDTs e DFAs 18. No entanto, a cultura viral influenza pode levar de 2-14 d para completar, diminuindo sua utilidade em ajudar manejo do paciente 19. Por último, os testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT) substituíram as técnicas de cultura como o novo padrão ouro no diagnóstico da gripe. NASC são considerados como tendo a maior sensibilidade para a detecção de gripe em poucas horas. No entanto, NASC são os ensaios mais caros e exigem equipamentos e técnicos especializados para realizar 5 , 20, 21, 22, 23, 24, 25.

O ensaio de influenza A e B aqui descrito é o primeiro teste da gripe dispensada-CLIA molecular rápida que está prontamente disponível. Este ensaio trabalha utilizando uma Reacção nicking endonuclease de amplificação (NEAR) que utiliza amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. Este ensaio diferencia influenza A com B, requer dois minutos para configurar e processar uma amostra, e exige um total de 15 minutos para se completar.

Aqui, apresentamos o protocolo para o ensaio Influenza A & B. Além disso, nós fornecemos um conjunto de dados de amostra definida comparando o desempenho da Influenza A e B do ensaio de swab nasofaríngeo arquivado (NPS) amostras armazenadas em meio de transporte viral (VTM) para outro ensaio painel patógeno respiratório.

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Protocolo

ÉTICA DECLARAÇÃO: A utilização de sobras de amostras clínicas é aprovado e segue as diretrizes da Cancer Center Institutional Review Board Memorial Sloan Kettering.

1. Antes de realizar o teste

NOTA: O Influenza A e B do ensaio é aprovado para espécimens de esfregaço nasofaríngeo e das zaragatoas nasofaríngeas armazenados no meio de transporte viral. As mechas são incluídos no kit e deve ser usado para um desempenho óptimo. No entanto, rayon, espuma, reuniram-se cotonetes ou swab nasal de poliéster também pode ser usado para coletar amostras de swab nasal.

  1. Para a coleta de uma amostra de swab nasal, insira o cotonete na narina que tem a drenagem mais visível ou que é mais congestionado. Com a rotação suave, empurre a zaragatoa na narina até encontrar resistência e rodar várias vezes contra a parede nasal antes de lentamente retirar da narina. Armazenar os cotonetes e transportá-los em frascos contendo 3 ml de meio de transporte viral (VTM).
    NOTA: A atenção cuidadosa para aproprcoleta de amostras iate deve ser tomado como coleta de amostra inadequada pode produzir resultados errados.
    NOTA: As amostras de zaragatoa deve ser testado o mais rapidamente possível após a colheita. No entanto, elas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante até 2 horas ou refrigerada a 2-8 ° C durante até 24 horas, se o teste não está imediatamente disponível. amostras recolhidas recentemente são ideais para o desempenho no teste ideal. O manuseio inadequado da amostra, armazenamento e / ou transporte podem produzir resultados errados.
    NOTA: Como medida de precaução, os indivíduos que executam este teste deve tratar todas as amostras como potencialmente infecciosas, seguindo as precauções universais ao manusear amostras.
  2. Trazer todas as amostras à temperatura ambiente antes do teste.
    NOTA: Todos os componentes de ensaio são de uma única utilização e não deve ser utilizado para executar vários testes. Não misturar os componentes do kit de lotes diferentes. Não usar reagentes após a data de expiração.
  3. Traga o receptor amostra azul para rootemperatura m antes do teste. A base de teste de laranja pode ser testada, sem a necessidade de aquecer até à temperatura ambiente.
  4. Deixe todas as peças de teste no embrulho folha até imediatamente antes da utilização. Ligue o instrumento pressionando o botão de energia no lado do instrumento. Digite o user-ID e pressione "OK".

2. A execução do teste

  1. Para iniciar o processo de teste, toque em "Run Test" na tela do instrumento. Digite o ID do paciente usando o teclado na tela ou scanner de código de barras e pressione "OK". Abra a tampa e insira a base de teste laranja no suporte base de teste da Orange.
  2. Confirmar que o teste correto é exibido na tela e pressione "OK". Insira o receptor amostra azul no suporte do receptor amostra azul.
    NOTA: Não abra o receptor da amostra antes de colocar no instrumento, pois isso vai impedir que o tampão de eluição de atingir a temperatura de funcionamento correto e pode afetar o desempenho do teste.
  3. Aguarde até que o receptor de exemplo para aquecer. Quando solicitado pelo instrumento, remover o selo de alumínio e coloque o cotonete doente a ser testado para o receptor da amostra.
    NOTA: Quando retirar o papel alumínio, coloque dois dedos sobre a borda do Receptor de exemplo para garantir que ele permanece no lugar.
  4. Misture vigorosamente o cotonete no líquido durante 10 segundos, pressionando a cabeça cotonete contra a parede do receptor da amostra como você misturá-lo para ajudar a desalojar a amostra do cotonete. Pressione "OK" para prosseguir. Se o teste compressas armazenados em meio de transporte viral, vortex da VTM por 10 segundos, em seguida, adicione 200 mL para o receptor da amostra.
  5. Pressionar o cartucho de transferência de branco para o receptor da amostra azul. Continue pressionando no receptor da amostra até que o indicador laranja sobe.
  6. Levante e depois ligar o cartucho de transferência para a base de teste. Observe o indicador de laranja descer assim que a transferência cartucho está ligado corretamente. Feche a tampa e não abra até que o "Teste completo"mensagem aparece na tela.

3. Controlo de Qualidade

  1. Toque 'Run QC Test' na tela inicial. Selecione o teste QC a ser executado. Confirme o tipo de teste para coincidir com a amostra QC destinado a testes tocando 'OK' e seguir as instruções na tela para completar o teste.

4. Resultado Interpretação

  1. Após a execução do teste é completa, observar os resultados do teste apresentado no ecrã com as interpretações para a presença de Influenza A, B, subtipos desconhecidos. Para resultados inválidos repetir o teste.

5. Manutenção e Limpeza

  1. Limpar o aparelho e da área de banco circundante diariamente com 70% de etanol ou uma solução de lixívia a 10%. Pulverizar a solução de limpeza em um pano úmido, sem fiapos para limpar. Não deite as soluções diretamente no aparelho.

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Resultados

Neste estudo, os espécimes NPS arquivados foram coletadas de pacientes internados com sintomas semelhantes aos da gripe no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC), durante um surto de gripe entre 15 de dezembro de 2012 e 1º de março de 2013. Os espécimes NPS foram apresentados em 3 ml da VTM e testado como parte da prática clínica de rotina com um ensaio molecular que detecta um painel de vírus respiratórios (PR), incluindo a gripe a, a-1, a-3 e B. Durante o período do estudo, 3.6...

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Discussão

Os vírus da gripe são causas mundiais de morbidade e mortalidade. diagnóstico rápido e preciso da gripe é uma das principais chaves para gerir surtos de gripe durante a temporada respiratória. Outros testes à base de antigene é rápido e fácil de realizar; no entanto, eles têm baixa sensibilidade 13. Por outro lado, os testes moleculares tradicionais têm melhorado a sensibilidade, mas requerem técnicos de laboratório mais experientes para realizar e são mais dispendiosas. O ensaio de Influenza A e...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos à equipe do Serviço de Microbiologia Clínica do Memorial Sloan-Kettering Cancer Center pela ajuda na coleta de amostras clínicas. Este estudo foi apoiado em parte por um acordo de pesquisa entre MSKCC e Alere Scarborough (SK2013-0262).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fabricante de instrumentosNAT-000 (Global), NAT-024 (EUA)
Vírus da gripe A e Kit de teste B 24Alere425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode ScannerAlereEQ001001
Alere Universal PrinterAlere55115 (Global), alereiprinter ( EUA)
200 e micro; l pipeta
200 µ l pontas
Meio de transporte viralRemelM4-RT
de precisãode pipeta descartáveis

Referências

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