Microfluídico troca de tampão para Micro / nanopartículas celular Engenharia sem interferências

Summary

Este protocolo descreve o uso de uma estratégia de troca de tampão à base de microfluidos inercial para purificar as células manipuladas micro / nanopartículas com depleção eficaz de partículas não ligadas.

Abstract

células de engenharia com micro ativo-ingrediente-carregado / nanopartículas (NPs) está se tornando um método cada vez mais popular para melhorar as propriedades terapêuticas nativos, permitem imagiologia bio e controlar fenótipo celular. Um problema crítico é ainda tratado de forma inadequada ao número significativo de partículas que permanecem não ligados após a marcação de células que não podem ser facilmente removidas por centrifugação convencional. Isto leva a um aumento do ruído de fundo de imagem bio e pode conferir efeitos de transformação em células não alvo vizinhos. Neste protocolo, apresentamos uma estratégia inercial baseada em microfluidics tampão de câmbio denominado como Dean Fluxo Fracionamento (DFF) para separar eficientemente células marcadas de NPs livres de uma forma de alto rendimento. O microdispositivo espiral desenvolvido facilita a recolha contínua (> recuperação de células de 90%) das células purificadas (THP-1 e MSCs) suspensas em solução tampão nova, ao conseguir% depleção de corante fluorescente não ligado ou NPs tingem-carregado (sil> 95ica ou PLGA). Este único passo, estratégia de purificação de células à base de tamanho permite que o rendimento de processamento de alta celular (10 ⁶ células / min) e é altamente útil para a purificação de células de grande volume de células micro / nanopartículas projetada para alcançar uma aplicação clínica livre de interferências.

Introduction

Engenharia células, carregado por agente micro / nanopartículas (NPs) é um método livre de integração, e versátil simples, genômica para melhorar a capacidade bioimaging e aumentar / complementar suas propriedades terapêuticas nativas em medicina regenerativa. ^1-3 modificações celulares são alcançados por rotular o membrana plasmática ou citoplasma com um excesso de concentração de NPs carregado por agente para saturar os locais de ligação. No entanto, uma grande desvantagem deste método é a de quantidades significativas de partículas não ligadas que permanece em solução depois de processos de rotulagem de células, que podem potencialmente confundir identi....

Protocol

1. Nanopartículas (NPs) Rotulagem de células-tronco mesenquimais e monócitos

1. as células estaminais mesenquimais Cultura (MSCs) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (SFB) e antibióticos para ≥80% de confluência antes da marcação. Do mesmo modo, a cultura de células THP-1 (ATCC) em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com FBS a 10% para uma densidade de ~ 10 ⁶ células / ml.
2. NPs de carga de sílica (~ 500 mm) com uma solução de corante calceina (200 ^ M) usando agitação durante a noite. Fabricar AM PLGA-calceína (CAM), utilizando um protocolo descrito anteriormente....

Results

Após a marcação das células com bio-imagem NPs carregado agente durante a noite, as células marcadas (que contém partículas livres) são colhidos e purificados por DFF espiral microdispositivo para remover NPs livres num processo de etapa (Figura 1A). O 2-entrada, microcanal espiral 2-outlet foi concebido pelo software de engenharia e microfabricados usando SU-8 fotorresiste. A bolacha de silício modelado é depois utilizado como um molde para moldagem por PDMS réplica usa.......

Discussion

A tecnologia de purificação de célula DFF aqui descrita permite a separação rápida e contínua de células marcadas de um modo de elevado rendimento. Esta abordagem é ideal para a separação do volume da amostra ou grande processamento de amostras alta concentração de células, e é melhor do que a filtração à base de membrana convencional, que é propenso ao entupimento após uso prolongado. Da mesma forma, a separação magnética baseados em afinidade requer passos adicionais de rotulagem de células que são trabalhosos e caros.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linhas celulares & Mídia
Células-tronco mesenquimais (MSCs)	Lonza	PT-2501
Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)	Soro Fetal Bovino Lonza	12-614F
(FBS)	Gibco	10270-106
Células de monócitos THP-1 (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mídia	Lonza	12-702F
Reagentes e Materiais
0,01% poli-L-lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
Seringa de 3 ml	BD	302113	Seringa de 3 ml Luer-Lock
Seringa de 60 ml	BD	309653	Seringa de 60 ml Luer-Lock
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calceína, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grau 2,5 L
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Lâminas de microscópio simples	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Fita adesiva Dow Corning	SYLGARD® 184
3M		21200702044	18 mm x 25 m
Silica NPs (∼ 200 μ m)	Sigma-Aldrich	748161	Tamanho do poro 4 nm
Ponta da seringa	JEC	Technology 7018302	23 G 0,013 x 0,25
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0,02 x 0,06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipamento
biópsia	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessecador	Scienceware	111/4 IN OD
	Phantom	V9.1
Microscópio de contraste de fase invertido	Nikon	Eclipse Ti
Limpador de plasma	Harrick Plasma	PDC-002
Bomba de seringa	Chemyx	CX Fusion 200